專利名稱：一株產納他霉素的新菌株及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物領域，特別涉及一株產納他霉素的新菌株及其應用。
背景技術：
納他霉素是一種四烯大環內酯類抗生素，為高效、安全的抗真菌天然產物，由于其對哺乳動物細胞的毒性極低，而對真菌的抑制作用極強，抗菌譜極廣，并且能夠阻止絲狀真菌中黃曲霉毒素的形成，加之其溶解度低，可用其對食品表面進行處理以增加食品的保質期，卻不影響食品的風味和口感，因而是一種十分理想的高效、安全的天然食品防腐劑，多年來在30多個國家被廣泛用于乳制品、肉類、水果、飲料等許多食品工業中，是國際上被美國FDA正式批準的僅有的兩種生物防腐劑之一。我國1996年食品添加劑委員會對納他霉素進行評價并建議批準使用，1997年3月我國衛生部正式批準其作為食品防腐劑，成為我國已批準使用的3種生物防腐劑之一。納他霉素通過鏈霉菌發酵生產，菌株的生產能力是關系到其發酵水平和生產成本的關鍵因素，因此高產菌種的選育是納他霉素研究的熱點之一。前人報道的納他霉素產生菌有恰塔努加鏈霉菌(Streptomyces chattanovgensis)、納塔爾鏈霉菌(Streptomyces natalensis)和褐黃抱鏈霉菌(Streptomyces gilvosporeus)；近年北京市農林科學院植保環保所研究發現了納他霉素新的產生菌利迪鏈霉菌(S.1ydicus)菌株AOl (中國專利，申請號為200710187435. 1，授權公告號為CN100590194C)和A02(中國專利，申請號為200610065620. 9，授權公告號為CN100467588C)，其以納他霉素為主要有效成分的活性產物對包括多種植物病原真菌在內的供試真菌均有強烈的抑制作用。但因其為野生型菌株，在生產能力和工藝性狀等方面尚不能滿足工業化生產的要求，因此需要通過菌種選育獲得性狀優良的高產新菌株。目前納他霉素生產菌菌種選育的手段有誘變育種、原生質體育種和基因組重排育種(genome shuffli ng)和基因工程育種，這些育種手段各有千秋。誘變育種是實驗室常規育種手段，其操作簡單、成本低，不需要了解菌株的遺傳背景。但誘變育種正突變率低，篩選工作量大，故構建一種快速有效的篩選模式是試驗成功的關鍵。鑒于目前對納他霉素的遺傳背景和生物合成途徑尚未完全清楚，基因組重排技術在納他霉素生產菌的遺傳改造中將占據重要地位。

發明內容
本發明的目的是提供一株產納他霉素的新菌株及其應用。本發明所提供的產納他霉素的新菌株具體為利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus)JZB130117o 該菌株是以利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)AOICGMCC No. 1653與利迪鏈霉菌(Sti^ptomyces lydicus) A02CGMCC No. 1654為出發菌株，對其進行誘變、基因組重排(Genome shuffling)后所得新菌株。該菌株已于2011年12月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱06110，地址為北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCC No. 5562。
所述利迪鏈霉菌(Sti^ptomyceslydicus) JZB130117CGMCC No. 5562 在制備納他霉素中的應用也屬于本發明的保護范圍。本發明的再一個目的是提供一種制備納他霉素的方法。本發明所提供的制備納他霉素的方法，具體可包括如下步驟發酵培養所述利迪鏈霉菌(Sti^ptomyces lydicus) JZB130117CGMCC No. 5562，收集發酵產物，獲得納他霉素。在上述方法中，所述發酵培養的培養基(發酵培養基)的溶劑為水，溶質及其終濃度如下玉米淀粉(35. 0-40. 0)g/L，棉籽精粉(20. 0-25. 0)g/L，葡萄糖(10. 0_15)g/L，豆柏粉(25. 0-28. 0)g/L，蛋白胨(5. 0-8. 0)g/L, MgSO4 · 7H20(1. 0-1. 2)g/L, KH2PO4 (O. 2-0. 3) g/L, NaCl (4. 0-6. O) g/L, (NH4) 2S04 (5. 0-6. 0) g/L 和 CaCO3 (5. 0-8. 0) g/L, pH7. 0 7. 4。在本發明的一個實施例中，所述發酵培養基的溶劑為水，溶質及其終濃度具體如下:玉米淀粉40. Og/L，棉籽精粉25. Og/L，葡萄糖10. Og/L，豆柏粉25. Og/L，蛋白胨5. Og/L, MgSO4 · 7Η201· 0g/L, KH2PO4O. 2g/L, NaCl5. Og/L, (NH4) 2S045. Og/L, CaC037. Og/L,pH7. 0 7· 4。 在本發明的一個實施例中，所述發酵培養基中的玉米淀粉為石家莊市天馬淀粉廠產品；所述棉籽精粉為北京中棉紫光生物科技有限公司產品；所述葡萄糖為河北省昌黎縣淀粉有限公司產品；所述豆柏粉為北京中棉紫光生物科技有限公司產品。在上述方法中，在發酵培養前，還包括利用種子培養基培養所述利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)JZB130117CGMCC No. 5562獲得種子液的步驟，再將所述種子液接種到上述發酵培養基中進行發酵培養。所述種子培養 基的溶劑為水，溶質及其終濃度如下可溶性淀粉(10.0-15.0)g/L,葡萄糖(15. 0-30.0) g/L，豆柏粉(15. 0-30.0) g/L，蛋白胨(5. 0-8. 0) g/L，MgSO4 · 7H20 (0. 8-1. 2) g/L, KH2PO4 (0. 2-0. 3g/L, NaCl (4. 0-5. 0)g/L, CaCO3 (8. 0-10. 0) g/L ；pH7. 0 7· 4。在本發明的一個實施例中，所述種子培養基的溶劑為水，溶質及其終濃度具體如下可溶性淀粉10. 0g/L,葡萄糖20. 0g/L,豆柏粉20. 0g/L,蛋白胨5. 0g/L,MgSO4 · 7Η201· 0g/L, KH2PO4O. 2g/L, NaC14. Og/L, CaCO3IO. Og/L ；pH7. 0 7. 4。在上述方法中，所述發酵培養的時間具體可為60h_120h。在本發明的一個實施例中，所述發酵培養的時間具體為72h。在上述方法中，所述發酵培養的培養溫度具體可為28°C -30°C。在本發明的一個實施例中，所述培養溫度具體為30°C。在上述方法中，所述發酵培養可為搖瓶發酵培養；所述搖瓶發酵培養的培養方式為旋轉震蕩培養；所述旋轉震蕩培養的轉速為220r/mirT260r/min (如220r/min)，搖床振幅為26mm。在上述方法中，所述發酵培養也可為發酵罐發酵培養；所述發酵罐(如5L發酵罐)發酵培養過程中使發酵培養液中的溶氧量為20-30%。在本發明的一個實施例中，通過控制所述發酵罐發酵培養過程中的通氣量為6NL/min (NL/min是發酵過程中通氣量的通用單位，讀作標準升每分鐘，意思是20攝氏度，I大氣壓的標準狀況下的流量是每分鐘多少升，轉換為每分鐘內通過單位體積培養液的空氣體積為1. 85V / V ·π η)，攪拌轉速為26(T460r/min，使發酵培養基中的溶氧量達到20%_30%。
在上述方法中，當用發酵罐培養時，在所述發酵培養過程中還需向發酵培養液中補加葡萄糖；所述補加葡萄糖的時間為發酵開始后的12tT60h之間，所述補加葡萄糖為流加50% (50g/100mL)葡萄糖水溶液，使所述發酵培養液中還原糖的終濃度維持在1.0g/100ml。所述利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus)JZB130117CGMCC No. 5562 在如下 a)或b)中的應用也屬于本發明的保護范圍a)制備納他霉素敏感圃抑制劑；b)抑制納他霉素敏感菌。本發明所提供的利迪鏈霉菌(Sti^ptomyceslydicus) JZB130117CGMCC No. 5562,搖瓶發酵平均產納他霉素的量達到2. 43g/L,較兩個親本菌株利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus)A01CGMCC No. 1653 與利迪鏈霉菌(Sti^ptomyces lydicus)A02CGMCC No. 1654 分別提高了 38. 86%和55. 77% ;并且其發酵周期縮短了 40%，平均發酵產率(產物濃度/發酵時間)較親本菌株AOl提高了 132. 99%，較A02提高了 161.54%。另外，該菌株表型也發生了改變，高氏一號斜面培養基上不產生黃色色素，這有利于下一步的納他霉素分離純化工藝。保藏說明囷種名稱利迪鏈霉囷拉丁名(Streptomyceslydicus)菌株編號JZB130117保藏機構中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機構簡稱CGMCC地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號保藏日期2011年12月9日保藏中心登記入冊編號CGMCC No. 556

圖1為納他霉素標準曲線。圖2 為利迪鏈霉菌(Sti^ptomyces lydicus) JZB130117CGMCC No. 5562 與兩個親本菌株利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus) A01CGMCC No. 1653與利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No. 1654在高氏一號斜面培養基上的培養性狀。其中，A為斜面培養基的正面；B為斜面培養基的背面。圖3 為利迪鏈霉菌(Sti^ptomyces lydicus) JZB130117CGMCC No. 5562 菌株與其它5株納他霉素產生菌的RAPD分析結果。其中，A為隨機引物P64941所對應的結果；B為隨機引物P64944所對應的結果。A和B中，泳道I均為恰塔努加鏈霉菌(Sti^ptomyceschattanoogensis) NRRL B-2255 ;泳道 2 均為納塔爾鏈霉菌(Streptomyces natalensis)NRRL B-5314 ;泳道 3 均為揭黃抱鏈霉菌(Streptomyces gilvosporeus) NRRL B-5623 ;泳道4均為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A01 ;泳道5均為利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus)A02 ;泳道 6 均為利迪鏈霉菌(Sti^ptomyces lydicus)JZB130117CGMCC No. 5562。圖4為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)活性產物的HPLC第一次分離譜圖。圖5為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)活性產物的HPLC第三次分離譜圖。
圖6為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)的納他霉素樣品的紫外掃描圖譜。圖7為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)的納他霉素樣品的紅外吸收光譜。圖8為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)的納他霉素樣品的高分辨質譜圖(負離子)。圖9為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)的納他霉素樣品的高分辨質譜圖(正離子)。圖10為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)的納他霉素樣品的核磁共振碳譜(500MHz)。圖11為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)的納他霉素樣品的核磁共振氫譜(500MHz)。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus) A01CGMCC No. 1653 :參見中國專利，申請號為 200710187435. 1，授權公告號為 CN100590194C。利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus) A02CGMCC No. 1654 :參見中國專利，申請號為 200610065620. 9，授權公告號為 CN100467588C。恰塔努加鏈霉菌(Str eptomyceschattanoogensis) NRRL B-2255 :美國農業部菌種保藏中心 Agricultural Research Service (NRRL) Culture Collection, United StatesDepartment of Agriculture NRRL B-2255 ;中國普通微生物菌種保藏管理中心CGMCCNo. 4. 1415。納塔爾鏈霉菌(Streptomyces natalensis) NRRL B-5314 :美國農業部菌種保藏中心 Agricultural Research Service (NRRL) Culture Collection, United StatesDepartment of Agriculture NRRL B-5314。褐黃抱鏈霉菌(Streptomycesgilvosporeus) NRRLB-5623 :美國農業部菌種保藏中心 Agricultural Research Service (NRRL) Culture Collection, United StatesDepartment of Agriculture NRRL B-5623。下述實施例中，所涉及的納他霉素檢測方法均為紫外分光光度測定法。依據納他霉素在303nm處(納他霉素的最大吸收波長為303nm，且該波長附近吸收值穩定范圍較寬，即使有小的漂移也不會引起大的檢測誤差)的光密度(0D值)，以質量濃度為1、2、3、4、5、6、7、8、9g/L的納他霉素標準品(sigma-P9703)溶液做標準曲線(圖1)，得到回歸方程y=0. 1028x-0. 0009, R2=O. 9988，說明在lg/L 9g/L范圍內線性關系良好。測得待測發酵上清液在303nm處的OD值，代入上述標準曲線方程，計算得到納他霉素含量。實施例1、JZB130117菌株的獲得及鑒定一、JZB130117 菌株的獲得1、出發菌株的誘變以利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus) AOICGMCC No. 1653 和利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No. 1654 (以下簡稱 AOl 和 A02)作為出發菌株，進行紫外線和LiCl2復合誘變。紫外線指波長范圍在135 390nm區域內所產生的射線，而誘變育種最有效的波長為260nm，它是一種非電離輻射。本發明所用紫外燈為實驗室超凈工作臺中的15w低功率紫外燈，約為253. 7nm，是比較有效的作用光譜，距離控制在30cm處。LiCl2為增變劑，本身并無誘變作用，但是在抗生素產生菌的誘變育種中表明其與一些誘變因子具有協同作用。本發明LiCl2的使用濃度為O. 5% (O. 5g/100ml)。將LiCl2、硫酸鏈霉素和培養基一起加入培養皿中制成平板，使所述LiCl2的終濃度為O. 5%(0. 5g/100ml)，硫酸鏈霉素的終濃度為出發菌株的最小抑制濃度。將制備好的出發菌株的孢子懸浮液直接均勻涂布在上述所制平板中，放到距紫外燈30cm下進行誘變，處理時間為通過預實驗所測得的出發菌株最佳照射時間。處理后，用報紙包好，避免見光。然后放置在28°C的條件下培養天，挑取長出的菌落(鏈霉素抗性突變株)，轉接到斜面培養。其中，硫酸鏈霉素對出發菌株AOl和A02的最小抑制濃度分別為4. 5 μ g/ml和1.25 μ g/ml O出發菌株AOl和A02的最佳照射時間分別為240s和12(Tl50s，在相應的照射時間下，兩個出發菌株均具有80%的致死率。經搖瓶發酵試驗并檢測發酵液中納他霉素含量，結果顯示，對于AOl菌株，共分離得到5株納他霉素產量高于出發菌株A01，且5代內遺傳穩定的突變株(表I)。對于A02菌株，共分離得到7株納他霉素產量高于出發菌株A02，且5代內遺傳穩定的突變株(表2)。表IAOl (1. 75g/L)為出發菌株誘變獲得突變株的產量
權利要求
1.利迪鏈霉菌(Streptomyceslydicus) JZB130117,它在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC No. 5562。
2.權利要求1 所述的利迪鏈霉菌(Sti^ptomyces lydicus) JZB130117CGMCC No. 5562 在制備納他霉素中的應用。
3.一種制備納他霉素的方法，包括如下步驟發酵培養權利要求1所述的利迪鏈霉菌 (Streptomyces lydicus) JZB130117CGMCC No. 5562，收集發酵產物，獲得納他霉素。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于所述發酵培養的培養基的溶劑為水， 溶質及其終濃度如下玉米淀粉(35. 0-40. O) g/L，棉籽精粉(20. 0-25. O) g/L，葡萄糖 (10. 0-15) g/L，豆柏粉(25. 0-28. 0)g/L，蛋白胨(5. 0-8. O) g/L, MgSO4 · 7H20 (1. 0-1. 2) g/L, KH2PO4 (O. 2-0. 3) g/L, NaCl (4. 0-6. 0) g/L, (NH4) 2S04 (5. 0-6. 0) g/L 和 CaCO3 (5. 0-8. 0) g/L。
5.根據權利要求3或4所述的方法，其特征在于所述發酵培養的培養時間為 60-120h。
6.根據權利要求3-5中任一所述的方法,其特征在于所述發酵培養的培養溫度為 280C -30O。
7.根據權利要求3-6中任一所述的方法,其特征在于所述發酵培養為搖瓶發酵培養；所述搖瓶發酵培養的培養方式為旋轉震蕩培養；所述旋轉震蕩培養的轉速為220r/ min 260r/min,搖床振幅為26mm。
8.根據權利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于所述發酵培養為發酵罐發酵培養；所述發酵罐發酵培養過程中使發酵培養液中的溶氧量為20-30%。
9.根據權利要求3-6和8中任一所述的方法，其特征在于所述發酵罐發酵培養過程中向發酵培養液中補加葡萄糖；所述補加葡萄糖的時間為發酵開始后的第12tT60h之間， 使所述發酵培養液中還原糖的終濃度維持在1. 0g/100ml。
10.權利要求1 所述的利迪鏈霉菌(Sti^ptomyces lydicus)JZB130117CGMCC No. 5562 在如下a)或b)中的應用a)制備納他霉素敏感圃抑制劑；b)抑制納他霉素敏感菌。
全文摘要
本發明公開了一株產納他霉素的新菌株及其應用。本發明所提供的產納他霉素的新菌株為利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)JZB130117，它在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC No.5562。本發明所提供的利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)JZB130117CGMCC No.5562，平均產納他霉素量達到2.43g/L，較出發菌株利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A01CGMCC No.1653與利迪鏈霉菌(Streptomyces lydicus)A02CGMCC No.1654分別提高了38.86%和55.77%；并且其發酵周期縮短了40%，計算綜合發酵產率較親本菌株A01提高了132.99%，較親本菌株A02提高了161.54%；另外，該菌株的培養特性也發生了改變，斜面上觀察菌株不產生黃色色素，這有利于下一步的納他霉素分離純化工藝。
文檔編號C12R1/465GK103045516SQ201210581720
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月27日 優先權日2012年12月27日
發明者劉偉成, 劉建華, 盧彩鴿, 吳慧玲, 董丹, 張濤濤, 劉霆, 張殿朋, 劉德文, 田兆豐, 裘季燕, 亓芳 申請人:北京市農林科學院