一種新型免疫性肝炎模型的建立方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及乙肝病毒全基因組轉(zhuǎn)染小鼠肝細(xì)胞誘發(fā)的免疫性肝炎動物模型的制備方法，特別是一種含有肝細(xì)胞自身抗原和乙肝病毒抗原的免疫誘導(dǎo)劑及簡單的操作程序，產(chǎn)生與人類疾病更具有相似性的免疫性肝炎疾病模型及其在肝炎發(fā)病機(jī)制研究和抗肝炎藥物評價中的應(yīng)用。
【專利說明】一種新型免疫性肝炎模型的建立方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種動物疾病模型的制備方法，特別是一種簡單的免疫誘導(dǎo)劑及簡單的操作程序，產(chǎn)生與人類疾病更具有相似性的免疫性肝炎疾病模型及其在肝炎發(fā)病機(jī)制研究和抗肝炎藥物評價中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]免疫性肝炎是一組由異常免疫介導(dǎo)的、具有相似臨床表現(xiàn)的慢性免疫性肝病，是導(dǎo)致肝功能衰竭和肝硬化的重要病因。近年來，免疫性肝炎檢出率逐漸上升，在世界范圍內(nèi)占慢性肝炎的10%~20%。涉及免疫性肝炎的誘因很多，發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜。免疫學(xué)細(xì)胞障害機(jī)制是肝損傷的重要機(jī)制之一，“免疫損傷”目前認(rèn)為是乙肝病毒感染的主要致病機(jī)制，即乙肝病毒不直接殺傷肝細(xì)胞，感染后肝組織損傷是宿主一系列免疫反應(yīng)造成的，包括以病毒抗原和肝細(xì)胞自身抗原為靶抗原進(jìn)行免疫攻擊造成的損傷。雖然免疫性肝炎的自身抗體已經(jīng)明確，但其病因和引起肝細(xì)胞損傷的機(jī)制卻仍未完全闡明，主要原因之一是缺乏理想的能夠模擬慢性進(jìn)展性免疫損傷過程的動物模型。而現(xiàn)有的免疫性肝炎動物模型還不能涵蓋相應(yīng)疾病的生理病理特點(diǎn)，僅僅是某些臨床癥狀類似，或者某些病理改變類似，尚無標(biāo)準(zhǔn)的免疫性肝炎動物模型可用。因此，建立與人類疾病在發(fā)病機(jī)制、病程特點(diǎn)等方面具有相似性的免疫性肝炎模型具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種新型的免疫性肝炎動物模型，該模型適用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)動物，實(shí)驗(yàn)周期短，成模率高，簡單易行，而且耗費(fèi)人力財(cái)力少，為肝炎發(fā)病機(jī)制的研究和新型抗肝炎藥物的開發(fā)提供一種與人類疾病更具相似性的、穩(wěn)定可靠的疾病模型。為此，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案:
[0004]現(xiàn)有的免疫性肝炎動物模型還不能涵蓋相應(yīng)疾病的生理病理特點(diǎn)，僅僅是某些臨床癥狀類似，或者某些病理改變類似，尚無標(biāo)準(zhǔn)的免疫性肝炎動物模型可用。而用本發(fā)明采用乙肝病毒全基因組轉(zhuǎn)染小鼠肝細(xì)胞誘導(dǎo)建立的免疫性肝炎小鼠模型，由于乙肝病毒轉(zhuǎn)基因小鼠肝細(xì)胞既含有肝自身抗原，又含有乙肝病毒抗原，能更好地模擬人類免疫性肝炎尤其是病毒感染誘導(dǎo)的免疫性肝炎。
[0005]一種用乙肝病毒全基因組轉(zhuǎn)染小鼠肝細(xì)胞誘導(dǎo)，無需特殊裝置，簡單易行，實(shí)驗(yàn)周期短的免疫性肝炎動物模型的建立方法。具體制備方法如下:
[0006]取6周齡的ICR小鼠或C57BL/6小鼠，通過腹腔注射乙肝病毒轉(zhuǎn)基因小鼠肝細(xì)胞乳劑，每只0.2毫升，共2-3次，即可誘發(fā)產(chǎn)生免疫性肝炎。
[0007] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn):(I)采用乙肝病毒轉(zhuǎn)基因小鼠肝細(xì)胞作為免疫誘導(dǎo)劑，由于乙肝病毒轉(zhuǎn)基因小鼠肝細(xì)胞既含有肝自身抗原，又含有乙肝病毒抗原，能更好地模擬免疫性肝炎；(2)無需特殊裝置，簡單易行，實(shí)驗(yàn)周期短，成模率高；(3)與人類免疫性肝炎尤其是病毒感染誘導(dǎo)的免疫性肝炎具有良好的相關(guān)性；(4)適于肝炎發(fā)病機(jī)制研究和抗肝炎藥物評價。
【具體實(shí)施方式】
[0008]實(shí)施例1:免疫性肝炎模型的制備及評價
[0009]I準(zhǔn)備以下材料:
[0010]1.1實(shí)驗(yàn)動物:ICR小鼠和C57BL/6小鼠由浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心提供。
[0011]1.2乙肝病毒全基因組轉(zhuǎn)染小鼠:上海南方模式動物中心提供。
[0012]1.3脂多糖:美國SIGMA公司產(chǎn)品。
[0013]2制備方法按如下步驟:[0014]2.1采用灌流的方法分離純化乙肝病毒全基因組轉(zhuǎn)染小鼠肝細(xì)胞。
[0015]2.2分離的肝細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液懸浮，經(jīng)超聲破碎后，與Freund’ s完全佐劑按I: I比例充分混勻，呈白色乳劑，即免疫誘導(dǎo)劑。
[0016]2.3清潔級ICR小鼠或C57BL/6小鼠，雌雄各半，常規(guī)飼養(yǎng)。
[0017]2.4取6周齡小鼠，腹腔注射免疫誘導(dǎo)劑I次/周、0.2毫升/只，共2_3次。
[0018]2.5誘導(dǎo)劑免疫注射2-3次后，即可形成典型的免疫性肝炎模型。
[0019]3評價方法按如下步驟:
[0020]3.1建模后檢測小鼠血清白蛋白/球蛋白(A/G)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、IgG 和 IgM 水平。
[0021]3.2建模后采用間接免疫熒光法等檢測標(biāo)志性自身抗體，包括抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗體(SLA/LP)和抗肝腎微粒體I型抗體(LKM-1)、抗肝細(xì)胞質(zhì)I型抗體(LC-1抗體)和抗肝細(xì)胞膜特異性脂蛋白抗體(ALSP)水平。
[0022]3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死小鼠，取肝臟組織作病理學(xué)檢查，觀察模型小鼠出現(xiàn)的免疫性肝炎特征性病變一界面性肝炎(位于肝小葉實(shí)質(zhì)區(qū)與間質(zhì)區(qū)交界處出現(xiàn)碎屑樣壞死伴有炎癥細(xì)胞浸潤)。
【權(quán)利要求】
1.一種新型免疫性肝炎模型的建立方法，包括模型的制作程序及模型評價標(biāo)準(zhǔn)，其特征在于采用一種簡單的誘導(dǎo)劑及簡單的操作程序，復(fù)制出穩(wěn)定、可靠的免疫性肝炎模型及其在肝炎發(fā)病機(jī)制研究和抗肝炎藥物評價中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型免疫性肝炎模型的建立方法，其特征在于所述的動物為小鼠，包括ICR小鼠和C57BL/6小鼠。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型免疫性肝炎模型的建立方法，其特征在于所述的免疫誘導(dǎo)劑為乙肝病毒全基因組轉(zhuǎn)染小鼠肝細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的新型免疫性肝炎模型的建立方法，其特征在于所述的免疫誘導(dǎo)途徑為腹腔注射。
5.根據(jù)權(quán)利要求1和3所述的新型免疫性肝炎模型的建立方法，其特征在于所述的免疫誘導(dǎo)劑既含有肝細(xì)胞自身抗原，又含有乙肝病毒抗原。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型免疫性肝炎模型的建立方法，其特征在于所述的模型評價標(biāo)準(zhǔn)為小鼠轉(zhuǎn)氨酶水平和抗肝細(xì)胞自身抗體水平升高，以及肝組織病理學(xué)檢查出現(xiàn)免疫性損傷變化。
7.一種新型免疫性肝炎模型的建立方法如權(quán)利要求1所述一種簡單的誘導(dǎo)劑及簡單的操作程序，復(fù)制出穩(wěn)定可靠的免疫性肝炎模型，其特征在于所述的模型制備方法為每周注射誘導(dǎo)劑I次，每只動物0.2毫升，共注射2-3次。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所 述的免疫性肝炎模型的建立在肝炎發(fā)病機(jī)制研究和抗肝炎藥物評價中的應(yīng)用，其特征在于所述的免疫性肝損傷與人類免疫性肝炎，包括病毒性肝炎引起的肝臟病理改變具有良好的相關(guān)性。
【文檔編號】A01K67/027GK103920165SQ201310014429
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2013年1月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月10日
【發(fā)明者】伍義行, 沈鈺明, 賈袁媛, 張虹莉, 戴靈豪 申請人:中國計(jì)量學(xué)院