專利名稱：一種篩選耐旱性轉基因玉米的方法
技術領域：
本發明屬于作物遺傳育種領域，具體地說，涉及一種篩選耐旱性轉基因玉米的方法。
背景技術：
干旱一直是影響作物生產的主要災害之一，每年不同程度發生的旱災使我國經濟特別是農業生產蒙受了巨大損失。統計表明，從1950年至今，全國平均每年受旱面積達2200萬公頃，嚴重成災900萬公頃，因干旱直接減收糧食100億公斤以上，約占各種自然災害造成糧食損失的60%。玉米是我國的第二大糧食作物，種植面積約為2400萬公頃，50%以上種植在西北、西南、華北、東北地區依靠自然降水、缺水的旱地上。這些地區年降水量在200 600mm不等，有些地方蒸發量大，水分流失快、且降水變率很大，玉米生長發育對水分的需要滿足率較低，嚴重影響玉米生產，造成產量低、年際間不穩定。對玉米帶地區氣象資料和玉米產量的相關分析得出，干旱是導致我國玉米產量波動的主要原因，農業水資源短缺和土壤貧瘠已成為提高玉米生產力的主要限制因素。我國70%以上的玉米經常遭受干旱威脅，每年因此造成的產量損失在1500萬噸以上。要從根本上解決這一問題，一方面要加強對有限水資源的合理開發利用，另一方面要從農作物種質改良入手，培育篩選具有耐旱豐產的農作物品種。由此可見，篩選創新耐旱的玉米種質和培育抗旱節水的玉米品種已成為保障我國糧食安全和解決“三農”問題的重大需求。

20世紀90年代以來，作物育種已進入生物技術與常規技術有機結合的第三次突破階段。以分子標記、轉基因技術為核心的現代分子育種技術大幅提升了育種的效率和準確性，常規育種需要7-8代才能選出的育種材料，現代技術能將其縮短到2-3代，育種周期縮短為原來的1/4-1/3，實現了快速、定向、高效培育系統改良的作物新品種。除了能顯著提高育種效率外，轉基因技術與常規技術結合，在提高農產品產量、突破資源約束、緩解生態惡化等方面也正在發揮重要作用。近10年來我國的玉米生產出現了單產增長變緩的情況，加上全球氣候變化的影響，玉米育種進入了爬坡階段。綜合運用各種先進育種技術，進行產量、抗病蟲、抗逆、養分高效利用等相關性狀的協調改良，是未來玉米育種領域發展的主要方向，也是突破玉米育種技術瓶頸的重要選擇。現代生物技術能夠實現抗逆基因的定向定位轉移，在常規技術短期內難以解決的性狀協調改良等方面顯示了巨大的優勢，把轉基因技術與常規育種技術結合起來，將有效引領玉米育種領域的科技進步。大量研究表明，玉米抗旱育種是提高品種的抗旱性、減少干旱帶來的損失的有效途徑。抗旱育種的基本前提是需要有過硬的抗旱種質資源。然而，玉米抗旱性的常規改良比較困難。因為即使在環境條件好的情況下，產量的遺傳力也較低，水分供應的不確定性使得產量遺傳力更低了 ；同時，很多研究已經證明抗旱性的遺傳機制相當復雜，是由數量性狀位點QTL控制的(Ribaut等，1996a)。現代分子生物學的發展，為玉米抗旱育種提供了新的方法和思路。分子標記輔助選擇和轉基因技術為解決玉米的抗旱性問題提供新的技術手段，而轉基因技術和常規育種方法有機結合在一起，為玉米抗旱育種提供一種全新的技術方案。近年來，科學家們利用分子生物學手段，對玉米抗旱性進行了比較深入的遺傳剖析(Tuberosa等，2002; Ribaut等，2004)，鑒定出了大量抗旱相關性狀的數量性狀位點(QTL)。同時，科學家應用功能基因組學技術和方法不僅在模式植物(擬南芥)中成功找到了大量與干旱脅迫下表達的基因(Seki等，2002)，而且在玉米中也鑒定出了不少與抗旱性相關的候選基因(Riccardi 等，1998; Zinselmeier 等，2002; Yu 和 Setter2003; Zheng 等，2004),現已通過遺傳工程技術提取出了抗旱主效基因，通過轉基因技術導入到玉米植株中，創制出了有重要育種應用價值的抗旱轉基因玉米新材料并應用于轉基因玉米抗旱育種中。對轉基因玉米進行耐旱性鑒定，是評價和選育耐旱性轉基因玉米新種質的關鍵步驟。目前，國內外對轉基因玉米耐旱性篩選和鑒定方法的研究還少有報導，采用的具體方法主要有室內發芽鑒定法、盆栽鑒定法等，采用的指標也大多為生理指標，但干旱對玉米所造成的危害涉及玉米生長發育的各個階段，最終都以產量下降為表現，鑒定方法中各種指標的優劣都應該以產量為基準。目前還沒有較為理想的對于轉基因玉米的耐旱性的鑒定方法及篩選方法，因此，亟需加強這方面的研究。

發明內容
本發明的目的是提供一種篩選耐旱性轉基因玉米的方法。為了實現本發明目的，本發明的一種篩選耐旱性轉基因玉米的方法，包括以下步驟1)待測轉基因玉米及受體種子播種；2)待測轉基因玉米及受體植株定苗；3)待測轉基因玉米及受體植株干旱脅迫與正 常水分處理；4)待測轉基因玉米及受體形態指標檢測；5)待測轉基因玉米及受體產量指標檢測；6)待測轉基因玉米耐旱能力評價；7)選擇具有耐旱性的轉基因玉米。前述的方法，步驟I)中所述受體種子為非轉基因受體對照種子。前述的方法，步驟I)中采用的播種條件為年自然降水少于150mm的地區陸地播種，或年自然降水大于150mm的地區旱棚內播種，每種材料種植一小區，每小區12m2，隨機區組排列，三次重復，播種密度與大田相同，為每公頃60000-67500株。前述的方法，步驟3)中所述待測轉基因玉米及受體植株干旱脅迫處理(旱地)，具體為播種前澆底墑水，使0-50cm 土層水分達到田間持水量的80%±5%，在拔節期澆水后停水，開花和吐絲后再在灌漿期澆兩水。所述待測轉基因玉米及受體植株正常水分處理(水地)，具體為分別在播種前、拔節期、開花期和灌漿期灌水，除開花期外灌水量與脅迫處理相同，在降水量較多的年份酌情適當減少灌溉次數和灌水量。前述的方法，步驟6)中對待測轉基因玉米進行耐旱能力評價，通過公式(I)計算得出待測轉基因玉米耐旱指數DI= (GYS.T/GYS.W) · (GYm.w/GYm.t) 公式(I)其中，GYs. τ :待測材料旱地籽粒產量；GYs.w :待測材料水地籽粒產量；GYm.w :所有材料水地平均籽粒產量；GYm. t :所有材料旱地平均籽粒產量；通過公式(II)計算得出待測轉基因玉米耐旱性提高系數
DR=DI轉基因材料/DI受體公式(II)其中，D1:待測轉基因玉米材料耐旱指數；DI受體:轉基因玉米受體耐旱指數；依據待測轉基因玉米耐旱性提高系數進行分級，分級標準為DR ( 1，則待測轉基因玉米比受體玉米耐旱性提高O級，耐旱性無提高；1. 01 < DR <1. 25，則待測轉基因玉米比受體玉米耐旱性提高I級，耐旱性小幅提高；1. 26 < DR <1. 5，則待測轉基因玉米比受體玉米耐旱性提高2級，耐旱性提高中等；1. 51 < DR <1. 75，則待測轉基因玉米比受體玉米耐旱性提高3級，耐旱性明顯提高；1. 76 < DR < 2，則待測轉基因玉米比受體玉米耐旱性提高4級，耐旱性顯著提高；DR > 2. 01，則轉基因玉米比受體玉米耐旱性提高5級，耐旱性大巾畐提聞。本發明方法以待測轉基因玉米及受體植株為對象，采用拔節后開花期分別自然干旱脅迫處理和正常水分灌溉一定時間后，檢測與耐旱性顯著相關的形態和產量指標，進行數據處理后，根據數值來評價轉基因玉米耐旱能力，以達到建立一個客觀準確的轉基因玉米耐旱性評價方法的目的，并可進一步作為玉米耐旱性篩選和鑒定方法研究的參考。相對于現有技術，本發明至少具有下列優點及有益效果(一)適應范圍廣 本發明的一種篩選耐旱性轉基因玉米的方法除適用于篩選具有耐旱性的轉基因玉米外，也適用于篩選具有耐旱性的普通玉米種質。(二)評價標準數值化，更客觀準確在篩選耐旱性轉基因玉米的過程中，轉基因玉米的耐旱性比受體玉米的耐旱性提高或是降低因不能量化無法進行準確評價。本發明利用轉基因玉米及受體玉米開花期干旱脅迫后與抗旱性高度相關的形態和產量指標的變化，建立了轉基因玉米耐旱性評價體系，能夠更客觀的反映轉基因玉米比受體耐旱性提高的程度。(三)本發明方法易于掌握，重復性高本發明使用轉基因玉米成株作為評價篩選對象，試驗材料容易獲得，一次可同時評價大量轉基因植株，操作方法易于掌握，重復性高。


圖1為本發明較佳實施例篩選耐旱性轉基因玉米的工藝流程圖。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例篩選耐旱性轉基因玉米的方法1.試驗材料7份非轉基因玉米受體常規自交系，54份轉基因玉米材料。其中轉L0S5基因的5個轉基因系材料及I個受體，由中國農業大學提供；RABP9基因的8個轉基因系材料及I個受體，由中國農業科學院生物技術研究所提供；轉TsVPI基因的20個轉基因系材料及2個受體、轉betA基因的17個轉基因系材料及2個受體，由山東大學提供；轉CBL、PLD2基因的4個轉基因系材料及I個受體，由中國農業科學院作物科學研究所提供(表I)。2.試驗方法參閱圖1，篩選具有耐旱性的轉基因玉米的方法，具體如下2.1玉米種子選擇精選需要鑒定的發育良好的轉基因玉米種子和非轉基因玉米受體對照種子，各供試種子要求飽滿一致。2. 2轉基因玉米及受體播種在年自然降水少于150mm的地區陸地播種或年自然降水大于150mm的地區旱棚內播種，每種材料種植一小區，每小區12m2，隨機區組排列，三次重復，播種密度度每公頃60000-67500 株。2. 3轉基因玉米及受體干旱脅迫處理和正常水分處理干旱脅迫處理(旱地)播種前燒底墑水，使0_50cm 土層水分達到田間持水量的80%±5%，在拔節期澆水后停水，開花和吐絲后再在灌漿期澆兩水。正常水分處理( 水地)分別在播種前、拔節期、開花期和灌漿期灌水，除開花期外灌水量與脅迫處理相同，在降水量較多的年份酌情適當減少灌溉次數和灌水量。2. 4轉基因玉米及受體指標檢測處理時期測定所有供試材料開花至吐絲天數，收獲時測定收獲株數和收獲穗數，收獲后測定小區籽粒產量。2. 5轉基因玉米耐旱能力評價計算轉基因玉米及受體耐旱指數DI= (GYS.T/GYS.W) · (GYm.W/GYM.τ)式中，GYs.τ是待測材料旱地籽粒產量；GYS.W是待測材料水地籽粒產量；GYm.w是所有材料水地平均籽粒產量；gym.t是所有材料旱地平均籽粒產量；計算轉基因玉米耐旱性提高系數DR=DI _h_/DI受體式中，DI 是待測轉基因玉米材料耐旱指數；DIS#是轉基因玉米受體耐旱指數；依據轉基因玉米耐旱性提高系數進行分級，分級標準為DR< 1，則轉基因玉米比受體玉米耐旱性提高O級，耐旱性無提高；1.01 <DR<1. 25，則轉基因玉米比受體玉米耐旱性提高I級，耐旱性小幅提高；1. 26 < DR <1. 5，則轉基因玉米比受體玉米耐旱性提高2級，耐旱性提高中等；1. 51 <DR<1. 75，則轉基因玉米比受體玉米耐旱性提高3級，耐旱性明顯提高；1. 76 < DR < 2，則轉基因玉米比受體玉米耐旱性提高4級，耐旱性顯著提高；DR> 2. 01，則轉基因玉米比受體玉米耐旱性提高5級，耐旱性大幅提高。2. 6根據2. 5中所述的分級標準對供試的轉基因玉米進行分級，根據需要選擇耐旱性顯著和大幅提高的轉基因玉米。3.結果與分析從表I中可以看出，依據此分級標準，在54份供試轉基因材料中，耐旱性比受體提聞O級的材料有2份,提聞I級的材料有9份,提聞2級的材料有16份,提聞3級的材料有4份，提聞4級的材料有2份,提聞5級的材料有21份。其中轉基因玉米比受:體耐旱性提聞的材料52份，占所有供試材料的96%，耐旱性顯著提高(4級以上)的材料有23份，占所有供試材料的43%。
依據表I分級結果，根據需要選擇耐旱性顯著提高和大幅提高的轉基因玉米材料進行轉育，用于培育抗旱轉基因玉米新品種。表154份供試轉基因玉米耐旱性鑒定評價結果及耐旱性提高分級結果
權利要求
1.一種篩選耐旱性轉基因玉米的方法，其特征在于，包括以下步驟1)待測轉基因玉米及受體種子播種；2)待測轉基因玉米及受體植株定苗；3)待測轉基因玉米及受體植株干旱脅迫與正常水分處理；4)待測轉基因玉米及受體形態指標檢測；5)待測轉基因玉米及受體產量指標檢測；6)待測轉基因玉米耐旱能力評價；7)選擇具有耐旱性的轉基因玉米。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)中所述受體種子為非轉基因受體對照種子。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)中采用的播種條件為年自然降水少于150mm的地區陸地播種，或年自然降水大于150mm的地區旱棚內播種，每種材料種植一小區,每小區12m2，隨機區組排列，三次重復，播種密度每公頃60000-67500株。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述待測轉基因玉米及受體植株干旱脅迫處理，具體為播種前澆底墑水，使0-50cm 土層水分達到田間持水量的80%± 5%，在拔節期澆水后停水，開花和吐絲后再在灌漿期澆兩水； 所述待測轉基因玉米及受體植株正常水分處理，具體為分別在播種前、拔節期、開花期和灌漿期灌水，除開花期外灌水量與脅迫處理相同，在降水量較多的年份酌情適當減少灌溉次數和灌水量。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟6)中對待測轉基因玉米進行耐旱能力評價，通過公式(I)計算得出待測轉基因玉米耐旱指數DI= (GYS.T/GYS.W) · (GYm.w/GYm.t)公式(I) 其中， GYs.τ :待測材料經干旱脅迫處理后的籽粒產量； GYs. :待測材料經正常水分處理后的籽粒產量； GYm.w :所有材料經正常水分處理后的平均籽粒產量； GYm.τ :所有材料經干旱脅迫處理后的平均籽粒產量； 通過公式(II)計算得出待測轉基因玉米耐旱性提高系數 DR=DI轉基因材料/DI受體公式(II) 其中， D1:待測轉基因玉米材料耐旱指數； DI受# :轉基因玉米受體耐旱指數； 依據待測轉基因玉米耐旱性提高系數進行分級，分級標準為DR< 1，則待測轉基因玉米比受體玉米耐旱性提高O級，耐旱性無提高；1. 01 < DR <1. 25，則待測轉基因玉米比受體玉米耐旱性提高I級，耐旱性小幅提高；1. 26 < DR <1. 5，則待測轉基因玉米比受體玉米耐旱性提高2級，耐旱性提高中等；1. 51 < DR <1. 75，則待測轉基因玉米比受體玉米耐旱性提高3級，耐旱性明顯提高；1. 76 < DR < 2，則待測轉基因玉米比受體玉米耐旱性提高4級，耐旱性顯著提高；DR > 2. 01，則轉基因玉米比受體玉米耐旱性提高5級，耐旱性大幅提聞。
全文摘要
本發明提供了一種篩選耐旱性轉基因玉米的方法，包括以下步驟1)待測轉基因玉米及受體種子播種；2)待測轉基因玉米及受體植株定苗；3)待測轉基因玉米及受體植株干旱脅迫與正常水分處理；4)待測轉基因玉米及受體形態指標檢測；5)待測轉基因玉米及受體產量指標檢測；6)待測轉基因玉米耐旱能力評價；7)選擇具有耐旱性的轉基因玉米。本發明方法建立了一個適合轉基因玉米成株期耐旱性評價的方法，該體系以轉基因玉米成株及受體為檢測對象，在轉基因玉米及受體開花期干旱脅迫處理，通過對植株形態指標和產量指標的檢測，達到建立一個客觀準確的轉基因玉米耐旱性評價方法的目的，從而為耐旱性轉基因玉米的篩選提供可靠的依據。
文檔編號A01H1/04GK103053411SQ201310036610
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月30日 優先權日2013年1月30日
發明者孫寶成, 劉成, 王天宇, 黎裕, 石云素, 宋燕春, 唐懷軍, 張登峰 申請人:新疆農業科學院糧食作物研究所, 中國農業科學院作物科學研究所