專利名稱：一種雜交鵝掌楸高效遺傳轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雜交鵝掌楸遺傳轉(zhuǎn)化方法，具體涉及一種雜交鵝掌楸高效遺傳轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
雜交鵝掌楸又名鵝掌楸(馬褂木)，它是由南京林業(yè)大學(xué)葉培忠教授等首次通過人工雜交的方法，將分布在亞洲的中國(guó)雜交鵝掌楸與分布在北美洲的北美雜交鵝掌楸采用人工控制授粉方法育成的雜交樹種。雜交鵝掌楸葉形奇特，花色艷麗，是優(yōu)良的庭院栽培和園林觀賞樹種。同時(shí)，其樹體高大，主干圓滿通直，木材結(jié)構(gòu)細(xì)致均勻，色淺，易干燥，易加工，纖維較長(zhǎng)，是優(yōu)良的制漿造紙、人造板及家具用材樹種，社會(huì)需求量極大。但是雜交鵝掌楸生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，應(yīng)用常規(guī)手段育種具有較大的困難。因此必須依靠現(xiàn)代生物技術(shù)并與常規(guī)育種相結(jié)合，進(jìn)而縮短育種周期，加速育種進(jìn)程，營(yíng)造優(yōu)質(zhì)人工林，緩解木材供需矛盾?；蚬こ淌巧锛夹g(shù)的核心，為林木遺傳改良開辟了一條新的途徑。林木基因工程是通過適合的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，導(dǎo)入有用的外源基因，獲得轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)行林木遺傳改良或有關(guān)的研究。近年來，林木基因工程取得了較大的進(jìn)展。目前，已有幾百種植物得到遺傳改良，在豐產(chǎn)，抗病，抗寒等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是外源DNA進(jìn)入植物細(xì)胞最成功和應(yīng)用最為廣泛的方法，自1976年D.Cleene和D.Ley (1976)首次報(bào)導(dǎo)根癌農(nóng)桿菌菌株B6 (LMG18)也能感染裸子植物受傷組織并產(chǎn)生冠癭瘤(Crown gall)后，許多學(xué)者開始利用農(nóng)桿菌進(jìn)行木本植物的基因轉(zhuǎn)移。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化過 程中，成功的基因轉(zhuǎn)化首先依賴于良好的植物受體系統(tǒng)的建立。所謂植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)，是指用于轉(zhuǎn)化的外植體通過組織培養(yǎng)途徑或其他非組織培養(yǎng)途徑，能高效、穩(wěn)定地再生無性系，并能接受外源DNA整合，對(duì)轉(zhuǎn)化選擇抗生素敏感的再生系統(tǒng)。目前，以植物體胚發(fā)生體系或體胚作為受體系統(tǒng)越來越受到重視。該系統(tǒng)的主要特點(diǎn)有四點(diǎn):其一、組成胚狀體的胚性細(xì)胞接受外源DNA能力很強(qiáng)，是理想的基因轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，而且這些細(xì)胞繁殖量大，同步性好，因此轉(zhuǎn)化率很高；其二、胚狀體個(gè)體間遺傳背景一致，無性系變異小，成苗快，數(shù)量多，而且還可以制成人工種子，有利于轉(zhuǎn)基因植株的生產(chǎn)和推廣；其三、胚狀體多為單細(xì)胞起源，轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)基因植株嵌合體少；其四、胚狀體具有兩極，在發(fā)育過程中同時(shí)可分化出芽和根，形成完整的植株，減少了不定芽發(fā)育過程中生根困難的難題。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的:針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種雜交鵝掌楸高效遺傳轉(zhuǎn)化方法，以建立穩(wěn)定高效的雜交鵝掌楸遺傳轉(zhuǎn)化體系。技術(shù)方案:為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
一種雜交鵝掌楸高效遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟:(O雜交鵝掌楸轉(zhuǎn)化受體的建立:取繼代2周的雜交鵝掌楸愈傷組織細(xì)胞，接入含有M13雜交鵝掌楸液體培養(yǎng)基的三角瓶中，230C，95r/min的恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)；每7天繼代一次，繼代3次后建立出懸浮細(xì)胞系，即為雜交鵝掌楸轉(zhuǎn)化受體；
(2)農(nóng)桿菌制備:先活化EHA105單菌落，在含有卡那霉素50mg/L、鏈霉素30mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，28°C，280r/min振蕩培養(yǎng)至0D_為0.6-0.8，4°C離心收集菌體，用雜交鵝掌楸液體繼代培養(yǎng)基重懸菌體，將菌液濃度稀釋至0.5左右；
(3)侵染:取3ml菌液加到雜交鵝掌楸轉(zhuǎn)化受體中，并加入乙酰丁香酮ΙΟΟμπιοΙ/L。靜置l-3min后，置于23°C、95r/min的恒溫?fù)u床中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)16 40h ；
(4)脫菌培養(yǎng):將雜交鵝掌楸懸浮細(xì)胞經(jīng)400目及150目的篩子過篩，用雜交鵝掌楸單細(xì)胞培養(yǎng)基將400目的篩子上的單細(xì)胞懸浮，置于23°C、95r/min的恒溫?fù)u床，振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)36h后，再用400目的篩子過篩一次，并用加有頭孢霉素500mg/L的雜交鵝掌楸單細(xì)胞培養(yǎng)基將400目篩子上的單細(xì)胞收集。并將單細(xì)胞以2mL每皿的濃度鋪平板，培養(yǎng)基為加有頭孢霉素500mg/L，約21天繼代一次；繼代一次后，可以觀察到子葉胚；
(5)篩選培養(yǎng):待子葉胚成熟，并長(zhǎng)到2cm左右，將其挑出，轉(zhuǎn)到MS基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其中加有頭孢霉素200mg/L，卡那霉素50mg/L。步驟(1)中，取繼代2周的雜交鵝掌楸愈傷組織細(xì)胞5mL，將其接種到250mL的三角瓶中，并在瓶壁輕輕敲散；量取50mL雜交鵝掌楸Ml3液體培養(yǎng)基加入三角瓶中，將材料置于23°C,95r/min的恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)。步驟(2)中，農(nóng)桿菌制備，具體操作為:
1)將_70°C保存的EHA105菌液在冰上融化，用接種環(huán)蘸取少量菌液，接種到含有卡那霉素50mg/L，鏈霉素30mg/L的LB培養(yǎng)基上，將其置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
2)待其長(zhǎng)出單菌落后，用接種環(huán)挑取單菌落，接種到含有卡那霉素50mg/L，鏈霉素30mg/L的LB培養(yǎng)基上,再活化一次,然后將其置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
3)待其長(zhǎng)出單菌落后，用滅過菌的槍頭挑取單菌落接種到含有IOmL加有卡那霉素50mg/L，鏈霉素30mg/L的LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28°C、220r/min振蕩培養(yǎng)；
4)約20h后，吸取2mL菌液，接種到含有50mL加有適量抗生素的LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28°C、280r/min 振蕩培養(yǎng)至 OD600 為 0.6-0.8 ；
5)待農(nóng)桿菌培養(yǎng)到OD6tltl為0.6-0.8時(shí)，取25mL菌液于50mL離心管中，于5000r/min，4°C離心IOmin,去除上清,收集菌體；
6)用雜交鵝掌楸液體繼代培養(yǎng)基重懸菌體，將菌液濃度稀釋至0.5左右。步驟(3 )中，共培養(yǎng)36 40h。所述的EHA105帶有35S:⑶S基因和NPT-1I基因。步驟(5 )中，每21天繼代一次，繼代2次后，就可用于移栽。有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明以雜交鵝掌楸懸浮培養(yǎng)的單細(xì)胞作為遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，以GUS基因?yàn)閳?bào)告基因，通過細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)GUS基因的瞬間表達(dá)、長(zhǎng)期表達(dá)、通過分子生物學(xué)方法檢測(cè)等確定外源基因的高效轉(zhuǎn)化。本發(fā)明采用雜交鵝掌楸單細(xì)胞起源的體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系， 有利于外源基因的導(dǎo)入，并降低了嵌合體的產(chǎn)生，具有很好的實(shí)用性。


圖1是雜交鵝掌楸的懸浮細(xì)胞系的顯微照片 圖2是雜交鵝掌楸體胚苗的顯微照片 圖3是PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)化結(jié)果圖；圖中，泳道M為maker，泳道CK+為質(zhì)粒pBI 121，泳道CK_為未經(jīng)過轉(zhuǎn)化的馬褂木植株，泳道H2O為水，泳道1，2，3，4，5，6，7，8，9為隨機(jī)選取的⑶S細(xì)胞學(xué)檢測(cè)為陽性的馬褂木轉(zhuǎn)基因植株；
圖4是RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)化結(jié)果圖；圖中，泳道M為maker，泳道CK+為質(zhì)粒pBI 121，泳道CK_為未經(jīng)過轉(zhuǎn)化的馬褂木植株，泳道1，2，3，4，5為隨機(jī)選取的PCR檢測(cè)及⑶S細(xì)胞學(xué)檢測(cè)顯示陽性的植株。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。以下實(shí)施例中，所使用到的培養(yǎng)基配方如下，未特別列出的，為常規(guī)培養(yǎng)基。MS 基本培養(yǎng)基配方:1650mg/L NH4NO3,1900mg/L KNO3,170mg/L KH2PO4, 370mg/L MgSO4.7H20,440mg/L CaCl2, 27.8mg/L FeSO4.7H20, 37.3mg/L Na2EDTA, 22.3mg/LMnSO4.H20,8.6mg/L ZnSO4.7H20,6.2mg/L H3BO3,0.83mg/L KI,0.25mg/L Na2MoO4.2H20,
0.025mg/L CuS04.5H20，0.025mg/L CoCl2.6H20，100 mg/L MyO-1nositol, 2.0 mg/LGlycine,0.4 mg/L Thiamine *HCI,0.5 mg/L Nictinic acid,0.5 mg/L Pyridoxine *HCL.
雜交鵝掌楸單細(xì)胞培養(yǎng)基配方:3/4MS，附加0.2 mg/L ΝΑΑ,Ο.5 mg/L KT, 0.2 mg/L BA，5 g/L VC,0.5 g/L CH, 50 g/L 蔗糖。雜交鵝掌楸M13液體培養(yǎng)基配方:3/4MS，附加2.0 mg/L 2，4_D，0.2 mg/L 6_BA，0.5 g/L CH, 30 g/L 蔗糖。雜交鵝掌楸體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方:3/4MS，附加2 mg/L ABA, 5 g/L VC, 0.2 g/L LH,
2g/L AC,40 g/L 鹿糖，1.15 g/L Gel。LB 培養(yǎng)基配方:5 g/L Yeast extract, 10 g/L Tryptone, 5 g/L NaCl。實(shí)施例1雜交鵝掌楸轉(zhuǎn)化受體的建立。 成功的基因轉(zhuǎn)化首先依賴于良好的植物受體系統(tǒng)的建立。所謂植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)，是指用于轉(zhuǎn)化的外植體通過組織培養(yǎng)途徑或其他非組織培養(yǎng)途徑，能高效、穩(wěn)定地再生無性系，并能接受外源DNA整合，對(duì)轉(zhuǎn)化選擇抗生素敏感的再生系統(tǒng)。20世紀(jì)70年代以來，對(duì)植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的研究已經(jīng)進(jìn)行了大量的工作，先后建立了多種有效的受體系統(tǒng)，適應(yīng)于不同轉(zhuǎn)化方法的要求和不同的轉(zhuǎn)化目的。本實(shí)施例采用雜交鵝掌楸懸浮細(xì)胞系為受體材料。懸浮細(xì)胞系的建立與一些物理因素有關(guān)，如細(xì)胞起始密度，振蕩培養(yǎng)時(shí)搖床的轉(zhuǎn)速等。本實(shí)施例利用基于固體培養(yǎng)條件下建立的雜交鵝掌楸的胚性愈傷培養(yǎng)物，建立一個(gè)穩(wěn)定性、同步性和可重復(fù)性好，細(xì)胞活力旺盛的胚性細(xì)胞懸浮體系。相關(guān)研究報(bào)道，一個(gè)良好的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系必須滿足以下基本條件:一，懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細(xì)胞團(tuán)較小，一般在30 50個(gè)細(xì)胞以下；二，均勻性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同，培養(yǎng)液清澈透亮，細(xì)胞色澤鮮艷；三，細(xì)胞生長(zhǎng)迅速。因此為建立良好的雜交鵝掌楸的懸浮細(xì)胞系，選用繼代2周后的愈傷材料。具體步驟如下:
I)取繼代2周的雜交鵝掌楸愈傷組織細(xì)胞約5mL，將其接種到250mL的三角瓶中，并在瓶壁輕輕敲散。2)量取50mL雜交鵝掌楸Ml3液體培養(yǎng)基加入三角瓶中，將材料置于23°C，95r/min的恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)。3)每7天繼代一次。繼代3次后可用于轉(zhuǎn)化，所建立的懸浮細(xì)胞系如圖1所示。實(shí)施例2農(nóng)桿菌制備。農(nóng)桿菌的培養(yǎng)、生長(zhǎng)狀態(tài)及純度對(duì)轉(zhuǎn)化具有重要作用。如果農(nóng)桿菌本身生長(zhǎng)不良，則其侵染能力大大下降。如果農(nóng)桿菌中的目的基因已經(jīng)丟失，則無法用于轉(zhuǎn)化。因此制備純度高、生長(zhǎng)旺盛、侵染能力強(qiáng)的農(nóng)桿菌侵染液是轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。這種侵染菌液也稱為工程菌液。農(nóng)桿菌的培養(yǎng)可分為固體平板培養(yǎng)和液體振蕩培養(yǎng)固體培養(yǎng)一般需要2 3天，液體培養(yǎng)生長(zhǎng)更快，一般需要I 2天。農(nóng)桿菌接種在液體培養(yǎng)基后，并不立即開始增殖。一般需I 2小時(shí)才開始分裂。當(dāng)生長(zhǎng)開始后，細(xì)菌數(shù)目以一恒定的指數(shù)速率倍增，直至培養(yǎng)基成分改變和供養(yǎng)缺乏時(shí)才停止增殖。當(dāng)細(xì)菌增長(zhǎng)速率達(dá)到對(duì)數(shù)指數(shù)時(shí)稱之為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)。研究表明，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)的農(nóng)桿菌侵染能力最強(qiáng)。具體步驟如下:
I)將-70°C保存的帶有35S:GUS基因(用于轉(zhuǎn)化檢測(cè))和NPT-1I基因(用于篩選)EHA105菌液在冰上融化，用接種環(huán)蘸取少量菌液，接種到含有適量抗生素(卡那霉素50mg/L，鏈霉素30mg/L)的LB培養(yǎng)基上，將其置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2)待其長(zhǎng)出單菌落后，用接種環(huán)挑取單菌落，接種到含有適量抗生素的LB培養(yǎng)基上，再活化一次，然后將其置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
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3)待其長(zhǎng)出單菌落后，用滅過菌的槍頭挑取單菌落接種到含有IOmL加有適量抗生素的LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28°C、220r/min振蕩培養(yǎng)。4)約20h后，吸取2mL菌液，接種到含有50mL加有適量抗生素的LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28°C、280r/min振蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0.6-0.8。5)待農(nóng)桿菌培養(yǎng)到OD6tltl為0.6-0.8時(shí)，取25mL菌液于50mL離心管中，于5000r/min,4°C離心IOmin,去除上清,收集菌體。6)用雜交鵝掌楸Ml3液體繼代培養(yǎng)基重懸菌體，將菌液濃度稀釋至0.5左右。實(shí)施例3侵染。所謂侵染就是把工程菌接種到受體材料表面，方法就是將制備好的農(nóng)桿菌菌液加入受體材料培養(yǎng)液中，浸泡一定時(shí)間后，進(jìn)行共培養(yǎng)。在侵染過程中要掌握侵染時(shí)間，有助于減少后期培養(yǎng)過程中可能造成的污染，并可減輕細(xì)菌對(duì)植物的毒害作用。浸染時(shí)間太短，不能使足夠多的農(nóng)桿菌附著于外植體傷口處，從而降低遺傳轉(zhuǎn)化的頻率。浸染時(shí)間過長(zhǎng)，容易引起外植體的過敏反應(yīng)，同時(shí)在后繼培養(yǎng)過程中可能造成農(nóng)桿菌污染，最終導(dǎo)致外植體褐化死亡。具體操作如下:
將菌液(實(shí)施例2)搖勻，吸取3mL菌液加到繼代3天的雜交鵝掌楸懸浮細(xì)胞(實(shí)施例1)中，并加入乙酰丁香酮ΙΟΟμπιοΙ/L。靜置l-3min后,置于23°C,95r/min的恒溫?fù)u床繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，即共培養(yǎng)。接種菌體后的外植體在細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)的同時(shí)，農(nóng)桿菌在外植體切口面也增殖生長(zhǎng)，該兩者共同培養(yǎng)的過程稱為共培養(yǎng)。農(nóng)桿菌和外植體共培養(yǎng)是整個(gè)轉(zhuǎn)化過程中非常重要的環(huán)節(jié)，因?yàn)檗r(nóng)桿菌附著，T-DNA的轉(zhuǎn)移及整合都在這共培養(yǎng)時(shí)期內(nèi)完成，因此共培養(yǎng)技術(shù)條件的掌握是轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。研究表明，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化時(shí)，并不“侵入”到植物細(xì)胞中去，而是把T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞。農(nóng)桿菌附著后不能立即轉(zhuǎn)化，只有在創(chuàng)傷部位生存16h之后的菌株才能誘發(fā)腫瘤，這一段時(shí)間稱為“細(xì)胞調(diào)節(jié)期”。因此，共培養(yǎng)時(shí)間必須長(zhǎng)于16h。共培養(yǎng)時(shí)間太長(zhǎng)，由于農(nóng)桿菌的過度生長(zhǎng)，植物細(xì)胞因受到毒害而死亡。實(shí)施例4脫菌培養(yǎng)。與農(nóng)桿菌共培 養(yǎng)一段時(shí)間后的外植體表面及淺層組織中共生有大量的農(nóng)桿菌，為殺死和抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)必須進(jìn)行脫菌培養(yǎng)，使外植體更好地生長(zhǎng)發(fā)育。所謂脫菌培養(yǎng)即把共培養(yǎng)后的植物材料轉(zhuǎn)移到含有抗生素的培養(yǎng)基上。常用的抗生素有羧芐青霉素、頭孢霉素及羧噻吩青霉素。具體操作如下:
I)將實(shí)施例3共培養(yǎng)約36h后的雜交鵝掌楸懸浮細(xì)胞經(jīng)400目及150目的篩子過篩，待液體漏完，用50mL Z36雜交鵝掌楸單細(xì)胞培養(yǎng)基將400目的篩子上的單細(xì)胞反沖到250mL三角瓶中，置于23°C，95r/min的恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)。2)單細(xì)胞培養(yǎng)36h后，再用400目的篩子過篩一次，并用50mL加有頭孢霉素500mg/L的雜交鵝掌楸單細(xì)胞培養(yǎng)基將篩子上的單細(xì)胞反沖回三角瓶中。并將單細(xì)胞以2mL每皿的濃度鋪平板，培養(yǎng)基為加有頭孢霉素500mg/L。約21天繼代一次。3)繼代一次后，可以觀察到子葉胚。實(shí)施例5篩選培養(yǎng)。(I)待體子葉胚成熟，并長(zhǎng)到2cm左右，將其挑出，轉(zhuǎn)到MS基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其中加有頭孢霉素200mg/L，卡那霉素50mg/L。(2)約21天后更換一次培養(yǎng)基。一般繼代2次后，就可以用于移栽。選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞也是轉(zhuǎn)化過程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。選擇抗生素加入選擇培養(yǎng)基后，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生一種選擇作用，稱之為選擇壓。本實(shí)驗(yàn)中選擇標(biāo)記基因用的是NPT-1I (新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)。表達(dá)NPT-1I基因的細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)抗生素卡那霉素的抗性。因此本實(shí)施例中用卡那霉素作為選擇壓。按照選擇壓加入的時(shí)期不同，可以分為三種，即前期選擇、延遲選擇和后期選擇。前期選擇是外植體共培養(yǎng)后，在轉(zhuǎn)入愈傷組織或不定芽誘導(dǎo)的一開始就加入選擇壓，即先選擇后再生；后期選擇即先再生后選擇。由于未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在含選擇壓的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)能力太弱亦難于生長(zhǎng)形成轉(zhuǎn)化體；而在無選擇壓培養(yǎng)基中非轉(zhuǎn)化細(xì)胞同樣能生長(zhǎng)，并對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞有滋養(yǎng)作用，從而有利于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此本實(shí)驗(yàn)選用后期選擇。實(shí)施例6⑶S細(xì)胞學(xué)檢測(cè)
⑶S基因存在于某些細(xì)菌體內(nèi)，編碼β -葡萄糖苷酸酶(β -glucuronidase,⑶S)，該酶是一種水解酶，能催化許多β_葡萄糖苷酯類物質(zhì)的水解。絕大多數(shù)植物細(xì)胞內(nèi)不存在內(nèi)源的GUS活性，因而GUS基因被廣泛用作轉(zhuǎn)基因植物的報(bào)告基因。使用細(xì)胞學(xué)檢測(cè)⑶S基因是通過X-Gluc為底物，通過顯色反應(yīng)直接觀察到組織器官中GUS基因的活性。該方法不用將酶從組織中提取出來，而是使底物進(jìn)入被測(cè)的植物組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體之中。將被檢測(cè)的材料浸泡在含有底物的緩沖液中保溫，若材料成功發(fā)生了⑶S基因轉(zhuǎn)化，表達(dá)出⑶S，在適宜條件下該酶可將X-Gluc水解生成藍(lán)色物質(zhì)，可用肉眼或在顯微鏡下觀察到。
取植株長(zhǎng)約2cm的體胚苗為GUS染色材料。將準(zhǔn)備好的體胚苗浸泡在染液中，于37°C保溫2h至過夜。⑶S染液配方:
Cl) 50mmol/L磷酸鈉緩沖溶液(pH7.0):A液:稱取NaH2PO4.2H20 3.12g溶于無菌水，定容至100ml。B液:稱取NaH2PO4.12H20 7.17g溶于無菌水，定容至100ml。取39ml A液與61ml B液混合。(2)染色液:7.1ml 50mmol/L 憐酸鈉緩沖溶液,0.2ml 10mmol/T, Na2EDTA,0.2ml5mmol/L K4 [Fe (CN)6], 0.2ml K3 [Fe (CN)6]，0.05ml 0.05% (v/v)Triton-100, 2ml 20% 甲酉享,0.25ml 0.5mg/ml X-Gluc0 配制 IOmlGUS 染液備用。以⑶S基因?yàn)閳?bào)告基因，通過細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)⑶S基因的瞬間表達(dá)、長(zhǎng)期表達(dá)、通過分子生物學(xué)方法檢測(cè)等確定外源基因的高效轉(zhuǎn)化。肉眼或顯微鏡下觀察，材料中的藍(lán)色即為⑶S表達(dá)位點(diǎn)。如圖2所示，左圖是對(duì)照樣，右圖是⑶S轉(zhuǎn)化體胚苗。可見，外源基因已被高效轉(zhuǎn)化。實(shí)施例7
通過CTAB法，分別提取未經(jīng)轉(zhuǎn)化的雜交鵝掌楸植株DNA、經(jīng)帶有GUS標(biāo)記基因侵染的雜交鵝掌楸植株DNA、根癌農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA，用質(zhì)粒DNA作為正對(duì)照，未經(jīng)轉(zhuǎn)化的植株DNA作為負(fù)對(duì)照，用無菌水代替模板DNA為陰性對(duì)照，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測(cè)。從PCR結(jié)果的電泳圖譜上可以看出，泳道I為Marker,泳道2為質(zhì)粒DNA,泳道3為未經(jīng)轉(zhuǎn)化植株DNA,泳道4為水，泳道5至泳道34為經(jīng)農(nóng)桿菌侵染植株DNA。由圖3顯示，泳道9、12、13、16、18、19、20、21、22、23、24、25、28、29、30、32、33、34都出現(xiàn)了目的條帶，即初步檢測(cè)60%的經(jīng)農(nóng)桿菌侵染的植株中可以檢測(cè)到GUS基因，研究結(jié)果進(jìn)一步表明GUS基因整合進(jìn)轉(zhuǎn)化植株的基因組。按常規(guī)方法提取帶有GUS標(biāo)記基因侵染的雜交鵝掌楸植株的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，利用⑶S基因的特異引物進(jìn)行PC R反應(yīng)，檢測(cè)上述基因組PCR反應(yīng)陽性的植株中⑶S基因的表達(dá)情況，RT-PCR的結(jié)果表明(圖4)，⑶S基因不僅成功整合進(jìn)基因組、并且在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了表達(dá)。由以上細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)的研究結(jié)果可以看出，以胚性細(xì)胞為受體、通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生方式實(shí)現(xiàn)植株再生的雜交鵝掌楸遺傳轉(zhuǎn)化體系已經(jīng)建立起來。
權(quán)利要求
1.一種雜交鵝掌楸高效遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)雜交鵝掌楸轉(zhuǎn)化受體的建立:取繼代2周的雜交鵝掌楸愈傷組織細(xì)胞，接入含有雜交鵝掌楸M13液體培養(yǎng)基的三角瓶中，23°C，95r/min的恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)；每7天繼代一次，繼代3次后建立出懸浮細(xì)胞系，即為雜交鵝掌楸轉(zhuǎn)化受體； (2)農(nóng)桿菌制備:先活化EHA105單菌落，在含有卡那霉素50mg/L、鏈霉素30mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，28°C，280r/min振蕩培養(yǎng)至0D_為0.6-0.8，4°C離心收集菌體，用雜交鵝掌楸M13液體繼代培養(yǎng)基重懸菌體，將菌液濃度稀釋至0.5左右； (3)侵染:取3ml菌液加到雜交鵝掌楸轉(zhuǎn)化受體中，并加入乙酰丁香酮lOOymol/L； 靜置l_3min后，置于23°C、95r/min的恒溫?fù)u床中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)16 40h ； (4)脫菌培養(yǎng):將雜交鵝掌楸懸浮細(xì)胞經(jīng)400目及150目的篩子過篩，用Z36雜交鵝掌楸單細(xì)胞培養(yǎng)基將400目 的篩子上的單細(xì)胞懸浮，置于23°C、95r/min的恒溫?fù)u床，振蕩培養(yǎng)36h后，再用400目的篩子過篩一次，并用加有頭孢霉素500mg/L的Z36雜交鵝掌楸單細(xì)胞培養(yǎng)基將400目篩子上的單細(xì)胞收集；并將單細(xì)胞以2mL每皿的濃度鋪平板，培養(yǎng)基加頭孢霉素500mg/L，約21天繼代一次；繼代一次后，可以觀察到子葉胚； (5)篩選培養(yǎng):待子葉胚成熟，長(zhǎng)到2cm左右，將其挑出，轉(zhuǎn)到MS基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其中加有頭孢霉素200mg/L，卡那霉素50mg/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雜交鵝掌楸高效遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于:步驟(I)中，取繼代2周的雜交鵝掌楸愈傷組織細(xì)胞5mL，將其接種到250mL的三角瓶中，并在瓶壁輕輕敲散；量取50mL雜交鵝掌楸M13液體培養(yǎng)基加入三角瓶中，將材料置于23°C，95r/min的恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雜交鵝掌楸高效遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于:步驟(2)中，農(nóng)桿菌制備，具體操作為: 1)將_70°C保存的EHA105菌液在冰上融化，用接種環(huán)蘸取少量菌液，接種到含有卡那霉素50mg/L，鏈霉素30mg/L的LB培養(yǎng)基上，將其置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 2)待其長(zhǎng)出單菌落后，用接種環(huán)挑取單菌落，接種到含有卡那霉素50mg/L，鏈霉素30mg/L的LB培養(yǎng)基上,再活化一次,然后將其置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 3)待其長(zhǎng)出單菌落后，用滅過菌的槍頭挑取單菌落接種到含有IOmL加有卡那霉素50mg/L，鏈霉素30mg/L的LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28°C、220r/min振蕩培養(yǎng)； 4)約20h后，吸取2mL菌液，接種到含有50mL加有適量抗生素的LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28°C、280r/min 振蕩培養(yǎng)至 OD600 為 0.6-0.8 ； 5)待農(nóng)桿菌培養(yǎng)到OD6tltl為0.6-0.8時(shí)，取25mL菌液于50mL離心管中，于5000r/min，4°C離心IOmin,去除上清,收集菌體； 6)用雜交鵝掌楸液體繼代培養(yǎng)基重懸菌體，將菌液濃度稀釋至0D_為0.5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的雜交鵝掌楸高效遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于:所述的EHA105帶有35S KUS基因和NPT-1I基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雜交鵝掌楸高效遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于:步驟(3)中，共培養(yǎng)36 40h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雜交鵝掌楸高效遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于:步驟(5)中，每21天繼代一次，繼代2次后，就可用于移栽。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種雜交鵝掌楸高效遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括雜交鵝掌楸轉(zhuǎn)化受體的建立、農(nóng)桿菌制備、侵染、脫菌培養(yǎng)和篩選培養(yǎng)。本發(fā)明以雜交鵝掌楸懸浮培養(yǎng)的單細(xì)胞作為遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，以GUS基因?yàn)閳?bào)告基因，通過細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)GUS基因的瞬間表達(dá)、長(zhǎng)期表達(dá)、通過分子生物學(xué)方法檢測(cè)等確定外源基因的高效轉(zhuǎn)化。本發(fā)明采用雜交鵝掌楸單細(xì)胞起源的體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系，有利于外源基因的導(dǎo)入，并降低了嵌合體的產(chǎn)生。
文檔編號(hào)A01H5/00GK103088059SQ201310037010
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2013年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月31日
發(fā)明者陳金慧, 王丹, 施季森, 成鐵龍, 王鵬凱 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)