專利名稱：一株能促進木麻黃營養元素吸收的內生真菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株能促進木麻黃營養元素吸收的內生真菌。
背景技術：
植物內生菌的研究始于19世紀末,Vogl從黑麥草Lolium temulentum L.種子中分離出第一株內生菌[1]。但真正開始大量研究植株中的內生菌起始于上世紀八十年代，主要是在溫帶地區、亞熱帶地區和熱帶地區的植被中開展研究。前人從大部分植物中都能分離出內生菌，因此可以推測內生菌在植株中是普遍存在的。在全世界范圍內至少在80多個屬290多種的禾本科農作物中發現了內生菌[2]。目前從植物中分離的內生菌根據其具有的獨特功能可以分為:固氮菌、固鉀菌、固磷菌等植物促生菌[3~4]、具有抗病蟲害的生防菌[5~7]和具有促進植物對不良環境的修復能力的抗性菌。當前沿海木麻黃防護林在生產發展中遇到的主要難題是林分更新困難，連載使得生產力大幅下降，以致于防護功能的減退，土地的貧瘠以及人為的破壞導致木麻黃自身生態系統的循環受到嚴重影響。本章通過測定水培接菌方式下不同菌株處理苗木體內營養元素的含量，探討內生真菌的接種是否能夠緩解木麻黃自身營養不足導致的生產力下降的問題，從而為今后木麻黃林地可持續發展提供可靠的理論與實踐依據。木麻黃科植物是兼有弗蘭克氏菌菌(Frankia)、內生菌根菌和外生菌根菌的共生營養型植物，因此，關于木麻黃真菌學方面的研究方向目前較多涉及弗蘭克氏菌(Frankia)、青枯菌(Solanasearum)、青枯假單胞桿菌(Pseudomonas solanacearum Smith)等，雖然木麻黃人工接種菌根菌后的促生效果已毋庸置疑，但是僅停滯于根瘤菌根菌的研究，木麻黃內生真菌方面的研究尚未見報道[8_9]。前人的研究中應用菌株，多為外生真菌，同時也沒有從促進營養元素吸收能力的因素去尋找內生真菌，提高其科學性和可靠性[1°]。證實能促進營養元素吸收的內生菌方面尚未見報道。

發明內容
本發明的目的在于提供一株能促進木麻黃營養元素吸收的內生真菌。本發明提供的一株能促進木麻黃營養元素吸收的內生真菌，所述功能內生真菌為曲霉sp.)木麻黃根際真菌13,已于2012年6月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC N0.6306。該菌的分離、純化包括:
A、材料:將采集得到不同年份的根、枝條、鱗狀葉小枝分成三個部分，用自來水清洗干凈，分裝到自封袋內，于4°C冰箱保存；
B、消毒:70%酒精浸泡30s——無菌水浸`洗一次——10%次氯酸鈉浸泡7min——無菌水浸洗一次。當樣品最后一次浸洗后的水盛于滅菌的小燒杯中，在平板上劃線作為對照，以檢驗樣品的消毒是否徹底，若干天后如有菌落生成，則表明樣品表面消毒不徹底，需繼續調整消毒方法[11_13];
C、接種部位的選擇:鱗狀葉小枝:分取植株的上、中、下三個部分的鱗狀葉小枝，每個鱗狀葉小枝又分為枝尖部、枝中部和枝基部3個處理；枝條:上中下分為3部位，其中第3部位為枝莖交接處；根部:分為根尖和根基2個部分；
D、接種:將消毒后的外植體用接種刀切開，鋪放在培養基表面，于28°C恒溫培養箱內培養5— 7天后觀察菌落生長狀況。有的菌株繁殖迅速，可先將其產生的菌株進行分離純化；生長緩慢且數量較少的菌株可延長觀察時間，直到其生長穩定后純化。固體培養:使用改良馬丁固體培養基，配方為蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、瓊脂14.0g/L、其它為無菌水，pH值6.4±0.2，培養溫度為28°C，培養方式為平板培養，培養時間為48h ；
E、將分離繁殖出的不同種類的內生真菌接入平板培養基進行純化，經過2-3次點接純化、轉接后得到單一菌種的上述的Aspergillus sp.功能菌株；
其在平面培養基上，菌落為白色氈狀絨毛，菌落中鑲嵌有墨綠色顆粒狀突起絨毛，基質顏色為黃綠色。分生孢子梗直立，簡單，頂端球形，頂部著生小梗；分生孢子(梗孢子)單孢，球形；參照真菌鑒定手冊將其鑒定為曲霉屬(Aspergillus sp.),保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.6306。上述的一種能促進木麻黃營養元素吸收的內生真菌應用菌液的制備方法，是將上述的菌株接入液體培養基，搖床振蕩培養，培養溫度為28°c，培養時間48 72h，利用血球計數板計算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1.0-9.0X106cfu/ml即為成品備用；液體培養基:為改良馬丁培養基，其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、其它為無菌水、pH值6.4±0.2。上述的一種能 促進木麻黃營養元素吸收的內生真菌應用菌液的應用方法，是應用該菌株的菌液，苗木栽植前期蘸根和用于林地澆根。上述的一種能促進木麻黃營養元素吸收的內生真菌應用菌液的應用方法，是用9.0X105cfu/ml菌液，按每株IOOml在林地澆于每株木麻黃的根際。上述的一種能促進木麻黃營養元素吸收的內生真菌應用菌液的應用方法，是應用該菌株的菌液5.0X 105Cfu/ml在水培苗栽植前將苗蘸根lOmin。本發明涉及的菌株是從木麻黃植株中分離純化得到的，目標菌株為曲霉(Aspergillus sp.)木麻黃根際真菌13,已于2012年6月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏編號為CGMCC N0.6306。經接種于木麻黃水培苗，根據元素分析的各項指標綜合評判，進一步證實木麻黃根際真菌13對元素吸收具有促進作用以及實際對木麻黃的干物質的增效作用，尋找到對促進元素吸收有益的功能內生真菌可應用于生產。通過菌液浸泡的方法接種于木麻黃幼苗，接種30天后用測定植株的磷、鉀、鎂、鋅、錳元素含量。木麻黃根際真菌13所處理植株與對照相比，磷、鉀、鎂、鋅、錳元素含量分別提高了 22.05%,270%,5.83%、220%和230%。表明其對于促進植株的元素吸收具有極顯著效果。


圖1為不同處理對木麻黃苗木N吸收的影響。圖2為不同處理對木麻黃苗木P吸收的影響。圖3為不同處理對木麻黃苗木K吸收的影響。圖4為不同處理對木麻黃苗木Mg吸收的影響。圖5為不同處理對木麻黃苗木H吸收的影響。圖6為不同處理對木麻黃苗木Zn吸收的影響。

圖7為不同處理對木麻黃苗木Mn吸收的影響。
具體實施例方式1、水培繁殖中的應用
取配制好的上述內生真菌(木麻黃根際真菌13，以下菌株13號)應用菌液，制成
5.0X105cfu/ml菌液，在水培苗栽植前蘸根lOmin。可提高植苗成活率10%以上。2、根際土壤澆施應用
試驗材料為惠安一號水培苗，苗木于2011年7月盆栽于福建農林大學森林生態研究所田間試驗地。水培苗根系長齊后，將其移入黃心壤土和沙以3:1的比例混合的土壤，并分裝于約500個直徑22cm，高15cm的花盆中。每盆放入相等質量的3.36KG混合土壤，為了保證后期苗木接菌的準確性，往每盆土壤中滴入1(Γ15滴甲醛(福爾馬林)消毒液，并用塑料薄膜封蓋盆口，消毒時間為24h。待土壤內甲醛滲透消毒完全，除去塑料薄膜，將剩余的甲醛蒸發，以免影響幼苗的移植成活率。經過一個月的恢復性生長，在木麻黃根際施入菌株濃度為9.0X 105cfu/ml的菌液100ml，重復3次，用蒸餾水溶液處理作為空白對照。菌液的制備:將菌株13號接入液體培養基，培養基為改良馬丁培養基，每L含蛋白胨5.0g、酵母浸出粉2.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氫二鉀1.0g、硫酸鎂0.5g,其它為無菌水，pH值6.4±0.2。經過24h的培養，利用血球計數板計算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成
1.0X 106cfu/ml至9.0X 106cfu/ml備用。接種后30天后進行各指標的測定，檢測方法和結果如下:
2.1菌株澆施后木麻黃元素分析
將烘干的苗木全株用小型粉碎機全部粉碎至粉末狀，采用硝酸一高氯酸混合液消煮，供磷、鉀、鎂、鋅、錳的測定，氮、氫用EA3000 CHNS/0元素分析儀直接測定。^全磷采用鑰銻抗比色法，結果計算為，式中:Wp為磷含量，g/kg ；二
e為工作曲線上查得顯色液磷(JF )的濃度，yg/ml ;7為顯色液體積，50ml ;&為分取倍
數■力烘干樣質量，g;
鉀、鈣、鎂、鋅、錳用原子吸收分光光度計測定，結果計算:
r-cxfrx^iom,式中A為鉀含量:，g/kg ；為工作曲線上查得測讀液中鉀()的濃
■T 17 IHXlCf一*度，μ g/ml ;F為測讀液體積，即消煮待測液定容體積50ml: 為分取倍數； 為烘干樣質量，g ;
gixj^x 蒙
③sV=^ixl00li，式中:W|為鎂含量，g/kg;^為鎂工作曲線上查得鎂(Mg)的濃度，μ g/ml ; F為測讀液體積，50ml 為分取倍數；》 為烘干樣質量，g ；
④HF1，式中Jzn為鋅含量，mg/kg ；為工作曲線上查得鋅()的濃度，μ g/
- MtT
cΛ
ml ; F為測讀液體積，50ml t力分取倍數； Β為烘干樣質量，g ；
,式中=Wifo為錳含量，mg/kg ；為工作曲線上查得錳(M )的濃度，μ g/
ml P力測讀液體積,50ml &力分取倍數；!《為烘干樣質量，g。所有數據處理以及圖表制
作均采用Excel和SPSS軟件處理。3結果分析
植物的正常生長發育離不開各種營養元素，由于元素間的功能各不相同，且與植株本身的基因和生長環境等內外因素密切相關，因此在植物體內的含量分布也不同。N、P、K、Ca、Mg、C、H均是植物體 內的大量營養元素，維持著植物正常的生理需要:C、N、P、H是合成有機質的基礎，N還是合成蛋白質和葉綠素的組成成分，K是酶的活化劑，能使細胞充水膨脹，有利于光合和代謝作用，Ca和Mg則參與植物體內一些調節生命的活動；Zn和Mn雖是植物體內的微量營養元素，卻起到了不可或缺的作用，因為它們參與活化劑一酶和輔酶的組成，也可能存在于維生素和生長素中，對植物的新陳代謝起到重要調節作用。3.1不同處理對木麻黃水培苗吸收N、P、K、Ca、Mg等元素的影響
試驗通過標準的元素測定方法測得了水培接菌方式不同處理下木麻黃苗木體內的N、P、K、Ca、Mg、C、H元素含量,結果顯示如圖1所示。單因素方差分析顯示，菌株13處理下木麻黃苗木體內的N相對含量與對照相比差異達到顯著水平(sig=0.000，顯著水平為0.05)，菌株13號為對照苗木N相對含量的12.78倍。如圖2所示，菌株13號的磷含量較對照增加了 22.05%。方差分析結果表明，菌株13處理下苗木K含量與對照相比差異達到顯著水平(sig=0.000，顯著水平為0.05)，菌株13號處理苗木體內K元素的含量較對照苗木相比，達到3.7倍(圖3)。Mg元素被稱為植物的中量營養元素，有參與調節植物體的生命活動。菌株13處理下苗木體內的Mg含量較對照相比，增幅達到5.83% (圖4)。H元素作為植物體生活物質的構成部分，但H主要來源于土壤，在植物體內平均含量排名第三，相對含量約為6%。方差分析顯示，菌株13處理H含量與對照相比差異顯著，菌株13號處理下木麻黃體內的H兀素相對含量達到對照苗木的9.5倍(圖5)。3.2不同處理對木麻黃水培苗吸收Zn、Mn微量元素的影響
試驗通過標準的元素測定方法測得了水培接菌方式菌株13處理下木麻黃苗木體內的Zn、Mn微量元素含量，見圖6和圖7。作為微量元素，植物體內Zn元素的含量約占植物體的0.002%,但是只要是細微的增加，都將有利于植物體的新陳代謝以及促進各種酶和輔酶的形成。方差分析結果顯示，處理13 Zn含量與對照的差異達到顯著水平(sig=0.000，顯著水平為0.05)，說明內生真菌的接種有利于提高苗木對土壤中微量元素Zn的吸收，從圖6可以看出，菌株13號對木麻黃苗木Zn含量的增長效果最顯著，為對照苗木的3.2倍。與Zn元素相同，植物體內Mn元素的含量也很微小，約占植物體的0.005%, Mn含量的稀少并沒有影響內生真菌發揮其促進增長作用，與Zn元素的測定結果較為一致，方差分析結果顯示，處理間Mn含量的差異也達到顯著水平(sig=0.000，顯著水平為0.05)，說明內生真菌的接種同樣有利于提高苗木對土壤中微量元素Mn的吸收，從圖7可以看出，菌株13號處理下苗木體內的Mn元素含量為對照苗木的3.3倍以上。菌株13號所處理植株與對照相比，磷、鉀、鎂、鋅、錳元素含量分別提高了 22.05%、270%,5.83%、220%和230%。表明其對于促進植株的元素吸收具有極顯著效果。本發明發現一株能促進木麻黃元素吸收的內生真菌，將該株木麻黃內生真菌菌株采用蘸根或菌液澆施的方法接種于木麻黃幼苗。通過接種后植株的元素分析，得出菌株的提高元素吸收能力均較大程度高于對照，表明其對于促進植株的元素吸收作用效能具有很大功用，從而進一步證實得到該株內生真菌能促進木麻黃元素吸收。
參考文獻
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權利要求
1.一株能促進木麻黃營養元素吸收的內生真菌，其特征在于:所述內生真菌為曲霉{Aspergillus sp.)木麻黃根際真菌13,已于2012年6月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC N0.6306。
2.一種如權利要求1所述的內生真菌的應用菌液，其特征在于:所述應用菌液的制備方法，是將所述的曲霉sp.)木麻黃根際真菌13接入液體培養基,搖床振蕩培養，培養溫度為28°C，培養時間48 72h，利用血球計數板計算菌液濃度，將菌液用超純水稀釋成1.0-9.0X106cfu/ml，備用；液體培養基:為改良馬丁培養基，其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、其它為無菌水、pH 值 6.4±0.2。
3.—種如權利要求2所述的應用菌液的用途，其特征在于:所述應用菌液用于林地澆根或苗木栽植前期蘸根 。
全文摘要
本發明涉及一株能促進木麻黃營養元素吸收的內生真菌。所述內生真菌為曲霉(Aspergillussp.)木麻黃根際真菌13，已于2012年6月28日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCCNo.6306。經接種于木麻黃水培苗，根據元素分析的各項指標綜合評判，進一步證實木麻黃根際真菌13對元素吸收具有促進作用以及實際對木麻黃的干物質的增效作用，尋找到對促進元素吸收有益的功能內生真菌可應用于生產。
文檔編號A01N63/04GK103173361SQ20131006879
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月5日 優先權日2013年3月5日
發明者洪偉, 吳承禎, 謝安強, 林燕青, 林晗 申請人:福建農林大學