專利名稱：一種營養繁殖花卉水仙超低溫保存及植株再生方法
技術領域：
本發明涉及到一種植物種質資源的保存及植株再生方法，，尤其涉及到一種營養繁殖花卉的超低溫保存及植株再生方法，具體的說是涉及到一種崇明水仙的超低溫保存及植株再生方法，屬植物細胞工程技術領域。
背景技術：
崇明水仙(Akrci1S1SW1S tazetta var.是上海市特色花丼品種之一,早在明朝就有栽培。它花香優雅、花期長，株型矮小，園林上適合配植在草地邊緣或布置花壇、花境，具有廣泛應用前景，近年來已銷售國際市場。在常規生產及保存過程中，由于病毒病嚴重及種源退化，嚴重阻礙了崇明水仙的產業化發展:因崇明水仙為同源三倍體，具高度不孕性，無法通過種子保存資源。通常采用鱗莖在圃地保存的方式，并通過分離小籽球的方法進行繁殖，I個種球I年僅能繁殖3 4個籽球，年繁殖系數低。此外，我國水仙病毒病危害非常嚴重，作為種源用的鱗莖在長年持續栽培下，病毒積累日益嚴重，造成產量逐年萎縮，種性退化，失去觀賞價值和商品性。通過組織培養保存除了需定期繼代，需要大量人力及物力外，還有污染及品種退化的危險。因此，建立一套經濟高效的崇明水仙種質保存體系，探索快速、有效、穩定的崇明水仙離體脫毒方法，對有效保護崇明水仙種質資源，提純復壯、加速產業化進程具有現實意義。超低溫保存是指在液氮(_196°C)下的低溫保存。在此條件下，植物的生物化學活性近乎停止，貯藏過程中的生理和遺傳變化能夠控制在最低限度內，被認為是植物遺傳資源長期保存的最優選擇。它避免了田間保存易受自然災害影響而導致種質變異或毀滅，以及組織培養保存中因多次繼代引起遺傳性狀變異或污染的危險。關于植物超低溫保存的研究，在進入到20世紀90年代后，保存技術的多樣化與簡易化方面不斷取得進步，能夠保存的植物物種數也在不斷地增長，但多數集中在蘋果、櫻桃、柑桔、香蕉、木薯等木本植物以及馬鈴薯、紅薯、草莓等薯類植物為主的植物遺傳資源的超低溫保存。在超低溫保存技術方面，崇明水仙屬球宿根植物，目前對此類植物中百合及大蒜的相關報導較多，水仙同科(石蒜科)植物中，上海市農業生物基因中心(申報單位)已對紅花石蒜成功進行超低溫保存并申請相關專利(中國:CN1934941: 2007)。

發明內容
本發明的目的是提供一種營養繁殖花卉水仙的超低溫保存及植株再生方法。為了實現上述的目的，本發明采用的技術方案是提供一種營養繁殖花卉的超低溫保存及植株再生的方法，所述超低溫保存方法包含以下步驟:將營養繁殖花卉的鱗莖進行誘導，切取大小2 5_的莖尖，將所述帶有根原基和芽原基的莖尖進行預培養，然后置于預處理溶液中在室溫下處理15 30mi n，將預處理溶液中處理過的莖尖轉入玻璃化保護劑中進行冰浴處理60 120min，將冰浴處理的莖尖轉移至裝有預冷過的新鮮玻璃化保護劑的冷凍管中，然后將冷凍管迅速投入到液氮中保存。
本發明采用的優選實施方案是，所述的營養繁殖花卉為崇明水仙。本發明采用的優選實施方案是，所述誘導包含的步驟有:選取3 4年生崇明水仙鱗莖；將崇明水仙的鱗莖用70%酒精消毒I min, 0.1%的升萊消毒l(T20min,然后用無菌水沖洗；將沖洗過的鱗莖切塊接種于含I mg.Γ1 BA及I mg.Γ1 NAA的MS培養基上誘導出
小鱗莖。本發明采用的優選實施方案是，所述MS培養基上誘導的培養溫度為23 27°C，光照12 h.(Γ1,光照強度36 Mmol πΓ2 s4,繼代為3個月。

本發明采用的優選實施方案是，所述預培養是指將誘導后的莖尖接種到含
0.3 0.5 mol.L-1蔗糖的MS培養基內在25°C下培養I 5天。本發明采用的優選實施方案是，所述預處理溶液為2 mol -Γ1甘油和0.4 mol -Γ1蔗糖的MS液體培養基。本發明采用的優選實施方案是，所述玻璃化保護劑為3.26 mol.Γ1甘油、2.42mol.L 1 乙二醇、1.9 mol.L 1 DMSO 和 0.4 mol.L 1 鹿糖。本發明采用的另一種實施方案是，提供一種植株再生的方法，其包含以下步驟:取保存后帶有莖尖的冷凍管立即放入40°C水浴中快速解凍2 4 min，將解凍后的莖尖在室溫下用含1.2 mol -Γ1蔗糖的MS培養液洗滌2 3次，洗滌時間為每次5 10 min，將洗滌后的莖尖用濾紙吸干，將吸干的莖尖轉移至含I mg.L-1 BA、0.5 mg.L-1 NAA和0.5mg-L-1 GA3的MS半固體培養基中進行暗光或弱光培養5 7天，然后轉入含I mg *L_1 BA和I mg.L-1 NAA的MS固體培養基中培養。本發明提供的營養繁殖花卉崇明水仙的超低溫保存及植株再生方法簡便易行，穩定可靠，保存后崇明水仙恢復生長狀況良好，成活率可達80%。本發明還對其他球宿根類植物遺傳資源的超低溫保存提供了很好的參考價值。


圖1、本發明的保存方法操作流程 圖2、本發明的誘導方法操作流程 圖3、本發明植株再生的操作流程圖。(a、將營養繁殖花卉水仙的鱗莖進行誘導，切取大小2 5mm的莖尖；b、將所述帶有根原基和芽原基的莖尖進行預培養，然后置于預處理溶液中在室溫下處理15 30min ;c、將預處理溶液中處理過的莖尖轉入玻璃化保護劑中進行冰浴處理60 120min ;d、將冰浴處理的莖尖轉移至裝有預冷過的新鮮玻璃化保護劑的冷凍管中；e、將上述冷凍管迅速投入到液氣中保存；
a’、選取3 4年生崇明水仙鱗莖山’、將步驟a’的鱗莖用70%酒精消毒I min，0.1%的升汞消毒l(T20min，然后用無菌水沖洗；c’、將步驟b’的鱗莖切塊接種于含I mg.L—1BA及I mg.Γ1 NAA的MS培養基上誘導出小鱗莖。A、取權利要求1所述的冷凍管立即放入40°C水浴中快速解凍2 4 min ;B、將解凍后的莖尖在室溫下用含1.2 mol.Γ1蔗糖的MS培養液洗滌2 3次，洗滌時間為每次5 10 min ;C、將洗滌后的莖尖用濾紙吸干；D、將吸干的莖尖轉移至含I mg -L-1 BA、0.5mg-L-1 NAA和0.5 mg-L-1 GA3的MS半固體培養基中進行暗光或弱光培養5 7天，然后轉入含1 mg.L-1 BA和I mg.L-1 NAA的MS固體培養基中培養。)
具體實施例方式為了更好的說明本發明的實施方案，下面結合本發明附圖以及實施例對本發明做進一步的說明，本發明敘述的實施例雖用來說明本發明，但不能用于限制本發明的保護范圍。實施例1、崇明水仙小鱗莖的誘導
如圖2所示，說明的是本發明的崇明水仙小鱗莖的誘導操作流程圖，其操作步驟是:a’、選取3 4年生崇明水仙鱗莖；b’、將步驟a’的鱗莖用70%酒精消毒I min，0.1%的升汞消毒l(T20min，然后用無菌水沖洗；c’、將步驟b’的鱗莖切塊接種于含I mg -Γ1 BA及Img.Γ1 NAA的MS培養基上誘導出小鱗莖，其中，在培養基上的誘導培養溫度為25±2°C，光照12 h.Cf1，光照強度36 Mmol m_2 s—1，誘導3個月，得到直徑0.5 lcm的小鱗莖。實施例2、崇明水仙預優培養
如圖1所示，說明的是本發明的保存方法操作流程圖，保存方法的操作方法是:a、將營養繁殖花卉水仙的鱗莖進行誘導，切取大小2 5mm的莖尖；b、將所述帶有根原基和芽原基的莖尖進行預培養，然后置于預處理溶液中在室溫下處理15 30min ;c、將預處理溶液中處理過的莖尖轉入玻璃化保護劑中進行冰浴處理60 120min ;d、將冰浴處理的莖尖轉移至裝有預冷過的新鮮玻璃化保護劑的冷凍管中；e、將上述冷凍管迅速投入到液氮中保存。實施例3、莖尖大小對崇明水仙超低溫保存成活率的影響
將I 1.5 mm、2 3 mm、4 5 mm的莖尖在鹿糖濃度為0.3 mo I *L_1的MS培養基內預培養5天后，用預處理液處理20 min,然后用玻璃化保護劑冰浴處理60 120min，優選的處理時間為80 min，凍存后恢復培養的結果表明:莖尖直徑為2 3mm的成活率最高，可達80%。莖尖小于2 mm的成活率僅為40%，莖尖大于4 mm的成活率僅為10%。實施例4、玻璃化試劑處理時間對莖尖成活率的影響
取2 3 mm的石蒜莖尖放在蔗糖濃度為0.4 mo I.Γ1的MS培養基上培養5天后，用預處理液處理20 min并以預冷過的玻璃化保護劑分別進行30、60、80、120、150 min的冰浴處理，步驟d為將莖尖轉移至裝有預冷過的新鮮玻璃化保護劑的2 mL冷凍管中，其中10個莖尖 管步驟e顯示是把冷凍管迅速投入液氮中保存。恢復培養的結果表明:處理時間少于30 11^11，莖尖凍存后沒有存活，601^11時成活率僅為30%，80 min時最高可達80%。后隨處理時間延長，成活率略有下降，至150 min時，成活率仍可達50%。實施例5、莖尖恢復培養與植株再生
如圖3所示，其操作步驟是:A、取權利要求1所述的冷凍管立即放入40°C水浴中快速解凍2 4 min ;B、將解凍后的莖尖在室溫下用含1.2 mo 1-T1蔗糖的MS培養液洗滌2 3次，洗滌時間為每次5 10 min ;C、將洗滌后的莖尖用濾紙吸干；D、將吸干的莖尖轉移至含I mg.L-1 BA、0.5 mg.L-1 NAA和0.5 mg.L-1 GA3的MS半固體培養基中進行暗光或弱光培養5 7天，然后轉入含I mg -L-1 BA和I mg -L-1 NAA的MS固體培養基中培養，在培養條件與鱗莖誘導的條件相同。莖尖解凍后接種在培養基上約5 7天后，未成活的莖尖發生褐變或漂白，而成活的莖尖則轉成淡黃至黃褐色。繼續培養約14 28天后便恢復生長，但最長的需40 60天才能在莖尖見到有芽萌動，再生率可達50%。
權利要求
1.一種營養繁殖花卉水仙的超低溫保存及植株再生的方法，其特征在于， 所述超低溫保存的方法包含步驟有:將營養繁殖花卉的鱗莖進行誘導，切取大小2飛mm的莖尖，將帶有根原基和芽原基的莖尖進行預培養，然后置于預處理溶液中在室溫下處理15 30min，將在預處理溶液中處理過的莖尖轉入玻璃化保護劑中進行冰浴處理60 120min，將冰浴處理的莖尖轉移至裝有預冷過的新鮮玻璃化保護劑的冷凍管中，然后將冷凍管迅速投入到液氮中保存。
2.根據權利要求1所述的營養繁殖花卉水仙的超低溫保存及植株再生的方法， 其特征在于，所述的營養繁殖花卉為崇明水仙。
3.根據權利要求1或2所述的營養繁殖花卉水仙的超低溫保存及植株再生的方法，其特征在于，所述誘導包含的步驟有:選取3 4年生崇明水仙鱗莖，然后將水仙鱗莖用70%酒精消毒I min，0.1%的升汞消毒l(T20min，再用無菌水沖洗，沖洗后將鱗莖切塊接種于含I mg.Γ1 BA及I mg.Γ1 NAA的MS培養基上誘導出小鱗莖。
4.根據權利要求3所述的營養繁殖花卉水仙的超低溫保存及植株再生的方法，其特征在于，所述MS培養基上誘導的培養溫度為23 27°C ,光照12 h.d \光照強度36 Mmolm_2 s_\繼代為3個月。
5.根據權利要求1所述的營養繁殖花卉水仙的超低溫保存及植株再生的方法，其特征在于，所述預培養是指將誘導后的莖尖接種到含0.3^0.5 mol -L-1蔗糖的MS培養基內在25°C下培養I 5天。
6.根據權利要求1所述的營養繁殖花卉水仙的超低溫保存及植株再生的方法，其特征在于，所述預處理溶液為2 mol.Γ1甘油和0.4 mol.Γ1蔗糖的MS液體培養基。
7.根據權利要 求1所述的營養繁殖花卉水仙的超低溫保存及植株再生的方法，其特征在于，所述玻璃化保護劑為3.26 mol.I/1甘油、2.42 mol.Γ1乙二醇、1.9 mol.I/1 DMSO和 0.4 mol.L 1 鹿糖。
8.一種營養繁殖花卉水仙的超低溫保存及植株再生的方法，其特征在于，所述植株再生的方法包括如下步驟:取權利要求廣7所述帶有保存后莖尖的冷凍管立即放入40°C水浴中快速解凍2 4 min，將解凍后的莖尖在室溫下用含1.2 mol.Γ1蔗糖的MS培養液洗滌2 3次，洗滌時間為每次5 10 min，將洗滌后的莖尖用濾紙吸干，將吸干的莖尖轉移至含I mg.L-1 BA、0.5 mg.L-1 NAA和0.5 mg.L-1 GA3的MS半固體培養基中進行暗光或弱光培養5 7天，然后轉入含I mg -L-1 BA和I mg -L-1 NAA的MS固體培養基中培養。
全文摘要
本發明涉及到一種營養繁殖花卉水仙的超低溫保存及植株再生方法，其包括如下步驟將水仙的鱗莖進行誘導，切取其帶有根原基和芽原基的莖尖進行預培養，然后放于預處理溶液中在室溫下進行處理，再轉入玻璃化保護劑中進行冰浴處理，后將莖尖轉移至裝有預冷過的新鮮玻璃化保護劑的冷凍管中，然后把冷凍管迅速投入液氮中保存，使用時從液氮中取出凍存的冷凍管，立即放入39～41℃水浴中快速解凍，再置于培養基中培養。本發明記載的營養繁殖花卉水仙超低溫保存方法簡便易行，穩定可靠，保存后水仙恢復生長狀況良好，其對鱗莖和球宿根類植物遺傳資源的超低溫保存，具有很好的參考價值。
文檔編號A01H4/00GK103141473SQ20131007608
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月11日 優先權日2013年3月11日
發明者林田, 楊華, 龍萍, 朱天生, 劉灶長, 李天菲, 羅利軍 申請人:上海市農業生物基因中心