專利名稱：防治辣椒疫病的生防菌株g1及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種防治辣椒疫病的生防菌株Gl及其應用。
背景技術：
辣椒疫病是由辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)引起的一種卵菌病害。疫霉菌隸屬卵菌門、霜霉目、腐霉科、疫霉屬。疫霉菌在土壤中存活不是以一種形態，而是以不同形態即菌絲體、孢子囊、厚垣孢子和卵孢子等多種互變方式存活。該病可以通過雨水與灌溉水，農用器具進行傳播，是一種危害性很強的土傳病害。隨著我國辣椒大量種植，辣椒疫病在露地、保護地與大棚也大面積發生，因為該病害發病周期短，流行速度快，常導致辣椒植株成片死亡，給辣椒產業帶來嚴重的經濟損失。一般病株率為20 - 30%，嚴重時達80%以上，此病害是影響我國辣椒產業經濟發展的主要因素之一。辣椒疫霉是一種異宗配合的微生物，它有2種主要的交配型:A1型和A2型。Groves等認為，由于近年來殺菌劑的廣泛使用，使辣椒疫霉菌產生了抗藥性，從而誘導其交配型的變化，給該病害的防治帶來很多困難。苯基酰胺類殺菌劑甲霜靈(metalaxyl)和精甲霜靈(mefenoxam)等專用殺菌劑被廣泛用于防治該病害，是目前國內外廣泛使用的卵菌病害防治藥劑中活性高、使用量大的一類殺菌劑，并取得了良好的防治效果。但由于該類藥劑屬于特異性位點抑制劑，對病原菌作用位點單一，長期使用極易產生抗藥性，導致防治效果下降。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑是防治辣椒疫病的又一重要的內吸性殺菌劑，由于其作用機制新穎，與苯基酰胺類殺菌劑無交互抗性，目前被廣泛使用。但已有研究表明，某些病原菌靶標對該類藥劑產生抗藥性自發突變頻率較高，在藥劑的高選擇壓力下病原菌易形成抗藥性群體。 綜上所述，開發新的、有效和安全的微生物殺菌劑控制辣椒疫病的發生是提高辣椒生產總量的需求，同時更是辣椒產業經濟、辣椒食用安全及農業可持續發展的需要。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa菌株Gl0本發明提供的多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa菌株Gl,其保藏號為CGMCC N0.6762。本發明的另一個目的是提供一種制備防治辣椒疫病菌劑的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟:發酵上述的多粘類芽孢桿菌Paenibacilluspolymyxa菌株G1，得到發酵產物，即得到菌劑。上述方法中，在所述得到發酵產物后，還包括如下步驟:收集所述發酵產物中的菌體沉淀，再懸浮所述菌體沉淀，得到菌劑。上述懸浮所用的懸浮液為水。上述方法中，所述收集發酵產物中的菌體沉淀采用離心的方式。具體離心為IllOOXg 離心 IOrnin0上述方法中，所述發酵的條件如下:26-28°C、180-200rpm振蕩培養24_36h ;所述發酵的條件具體如下:26°C、ISOrpm振蕩培養24h。由上述方法制備的菌劑；所述菌劑中的活菌總濃度具體為IXlO7 — IxiO10Cfu/mL，在本發明的實施例中菌劑中的活菌總濃度為IX 107cfu/mL。本發明的第三個目的是提供一種防治辣椒疫病或抗菌產品。本發明提供的產品，其活性成分為上述的多粘類芽孢桿菌PaenibacilluspoIymyxa菌株Gl或上述菌劑。上述產品中，所述辣椒疫病為由辣椒疫霉Phytophthora capsici引起；上述辣椒疫霉 Phytophthora capsici 具體為辣椒疫霉 Phytophthora capsici 菌株 SD-33 ；所述抗菌為抗 如下6種病原菌中的至少一種:楊樹腐爛病菌Valsa sordida、灰霉病菌 Botrytis cinerea、板栗疫病菌 Cryphonectria parasitica、瓜果腐霉 Pythiumaphanidermatum、立枯絲核菌 Rhizoctonia solani Kiihn 和辣椒疫霉 Phytophthoracapsici ο上述的多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa菌株Gl或上述的菌劑在防治辣椒疫病或抗菌中的應用也是本發明保護的范圍。上述應用中，所述辣椒疫病為由辣椒疫霉Phytophthora capsici引起；上述辣椒疫霉 Phytophthora capsici 具體為辣椒疫霉 Phytophthora capsici 菌株 SD-33 ；所述抗菌為抗如下6種病原菌中的至少一種:楊樹腐爛病菌Valsa sordida、灰霉病菌 Botrytis cinerea、板栗疫病菌 Cryphonectria parasitica、瓜果腐霉 Pythiumaphanidermatum、立枯絲核菌 Rhizoctonia solani Kiihn 和辣椒疫霉 Phytophthoracapsici ο上述生防菌劑防治辣椒疫病的應用方法為:在溫室辣椒育苗時用活菌總濃度為I X 107Cfu/mL菌劑浸種I小時，播種時，再澆灌活菌總濃度為IX IO7的菌劑；待辣椒幼苗長至7-8葉期時，先將20mLGl菌劑(活菌總濃度為I X 107cfu/mL)均勻噴灑在整盆辣椒苗上，IOmin后再將每盆用30mLGl菌劑(活菌總濃度為I X 107cfu/mL)灌根處理。細菌Gl,為多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa,于2012年11月2日，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所)，菌種保藏號為=CGMCC N0.6762。本發明的實驗證明，本發明針對目前辣椒疫病沒有較高防效的生防制劑現狀，提供開發一種防治辣椒疫病的單一細菌多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa Gl及其菌齊U，專用于辣椒疫病的防治，該細菌或其菌劑對這種重要的土傳病害有較高的防治效果，溫室辣椒疫病的防治效果達71.18%。由于本發明的菌株Gl是專門針對辣椒疫病篩選開發的生防菌株，因而在防治辣椒疫病方面與目前其它廣譜生物殺菌劑相比，防治效果顯著。由于是生物制劑，完全沒有因化學農藥的使用所帶來的一系列問題，因而有利于作物的無公害生產，農民可以不用或減少其它防治辣椒疫病化學農藥的用量，這不僅可以為農民節省開支，也有利于辣椒產品的出口。同時該生防制劑還有增產功能，可為農民增加經濟收入。


圖1為生防細菌對辣椒疫病的防治效果
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、生防細菌Gl的分離與鑒定1、菌種分離與鑒定(I)菌株的分離將從山東農業大學科技創新園區采集的辣椒植物用自來水沖洗干凈，分為根、莖、葉三部分，再用無菌水沖洗2次，無菌濾紙吸干表面水分。無菌條件下，75%乙醇浸泡lmin，無菌水沖洗3次，轉入3%次氯酸鈉消毒液浸泡5min，無菌水沖洗3次，無菌濾紙吸干表面水分。將已表面消毒的根、莖、葉分別置于滅菌研缽中剪碎后，加適量無菌水后研磨，再稀釋成10'10_2、10_3三個梯度，分別取10_2、10_3稀釋梯度的研磨液和最后一次沖洗液各200 μ L移入LA培養基平板內，涂布均勻，最后一次沖洗液做對照CK，每處理重復3次，置28°C培養，逐日觀察。選擇CK中無菌落，而研磨液中有菌落長出的菌株，根據菌落形態、顏色等特征挑取單菌落，多次平板劃線純化后，將純化好的菌株進行編號，斜面保存備用。1^培養基:蛋白胨1(^，酵母粉58，似(:158，瓊脂粉178，蒸餾水10001111^!1值7.0。(2)拮抗菌的篩選采用平板對峙法進行拮抗細菌的篩選，將供試植物病原真菌楊樹腐爛病菌(Valsasordida)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)、瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kiihn)和辣椒疫霉(Phytophthora capsici)菌株SD-33 (辣椒疫霉菌拮抗細菌的篩選，山東農業科學，2012，44(9):90 - 92 ;公眾可從山東農業大學獲得)分別接種于PDA平板中央，待測細菌點接于距病原菌左右2cm處，每處理三皿，28°C恒溫倒置培養4天后，測定其抑菌率(結果見表I)。抑菌率=(對照平板菌落直徑一對峙平板菌落直徑)/對照平板菌落直徑X 100%。選擇對辣椒疫霉具有較強拮抗活性的內生細菌菌株，編號為GI，于5 O %甘油中-80°C下保存。表I為菌株Gl對不同病原菌的抑菌率
病原菌抑菌率(％)
辣椒疫霉 P.capsici78.15±0.71a
楊樹腐爛病菌 K sordida68.22±0.73c
灰霉病菌 B.cinerea71.0l士0.45c
板栗疫病菌 C.parasitica64.52±1.89d
瓜果腐霉 P.aphanidermatum59.35±1.89e
立枯絲核菌 i .so/aw/Ktihn73.67±1.43b注:同列數據后的不同字母表示0.05水平上差異顯著。2、Gl的形態及生理生化特征檢測
(I)菌落和菌株形態特征菌株Gl在LA培養基上呈淡黃色不透明菌落，表面粘稠，菌落邊緣不規則。菌體桿狀，革蘭氏染色反應為陽性，周生鞭毛，芽孢端生，卵圓形。(2)生理生化特征檢測可以利用碳源:糊精、糖原、L-阿拉伯糖、D-果糖、D-半乳糖、a -D-匍萄糖、a -D-乳糖、麥芽糖、D-甘露醇、D-多汁乳燕糖、D-蜜二糖、β -甲基-D-匍萄糖苷、D_阿洛酮糖、D-棉子糖、蔗糖、D-海藻糖、松二糖、丙三醇、a -D-丙三醇磷酸鈉。

不可以利用碳源:a -環糊精、吐溫40、吐溫80、N-乙酰葡糖胺、D-阿拉伯糖醇、L-巖藻糖、龍膽二糖、m-纖維糖、L-鼠李糖、D-山梨糖醇、木糖醇、丙酮酸甲基酯、琥珀酸單甲酯、醋酸、D-半乳糖酸內酯、D —半乳糖醛酸、肌苷、尿核甙、腐胺、a -羥基丁酸、β -羥基丁酸、羥基丁酸、P-羥苯基乙酸、a -酮戊二酸、D，L-乳酸、丙酸、琥珀酸、琥珀酸酰胺、D-丙氨酸、L-丙氨酸、L-丙氨酰-甘氨酸、L-天門冬酰胺、L-谷氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸、L-吡咯型谷氨酸、L-絲氨酸、丁二醇、D-葡萄糖-6-磷酸鹽。3、Gl的Biolog微生物自動鑒定系統分析將細菌菌株Gl劃線接種到LA平板培養基上，28°C下培養48h，長出單菌落后，送到山東大學微生物技術國家重點實驗室進行Biolog系統鑒定。鑒定步驟如下:用Biolog專用培養基將純種擴大培養。按要求配制一定濁度(細胞濃度)的菌懸液。將菌懸液接種至微孔鑒定板(MiCToplate)。培養一定時間，將培養后的鑒定板放入讀數儀中讀數，軟件自動給出鑒定結果。啟動 Biolog Microstation 工作站 MicroLog ,進入 MicroLog 3.4.20系統。點擊SET UP，初始化設置。輸入樣品編號(Sample Number)，選擇鑒定板類型(PlateType):GP2,選擇菌株類型(Strain type):GP_Rod SB,選擇培養時間(Incubation Time):16_24h。將培養后的鑒定板放入讀數儀的托架上，取下蓋子。按“Read Next”鍵開始讀數，讀數儀掃描鑒定板后，自動彈出，結果顯示在電腦屏幕上。啟動Biolog Microstation 工作站MicroLog ,進入MicroLog 3.4.20 系統。Biolog Microbial Identification System鑒定結果顯示菌株Gl的Species ID是:Paenibacillus polymyxa,即多粘類芽孢桿菌。經B10L0G鑒定，菌株Gl為革蘭氏陽性好氧菌，基于完全的底物利用圖譜(substrate utilizationprof iles)的檢測結果，菌株Gl 為多粘類芽抱桿菌Paenibacilluspolymyxa (species ID)。其中與標準菌株匹配程度SIM>0.5 ;可以與其它鑒定系統比較的參數 PR0B%=100%。系統給出鑒定結果，每個結果用三個指標反映:即可能性Probability (PR0B)，相似性 Similarity (SM)和位距 Distance (DIS)0 PROB 接近 100%，SM 彡 0.5，即可確定一個菌種，而Gl這兩者的值分別為100%和0.765，說明鑒定結果是可靠的。至此，暫定菌株Gl屬于多粘類芽抱桿菌Paenibacillus polymyxa。4、菌株Gl的分子生物學鑒定使用TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNAKit Ver.2.0 試劑盒提取菌株Gl的基因組DNA。采用細菌的通用引物27F (5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ )和1492R(5’ -TACGGTTAC CTTGTTACGATT-3’)，以菌株 Gl 的基因組 DNA 為模板擴增 16SrDNA。采用 25μ I 反應體系:10XPCR Buffer2.5μ L ；25mM Mg2+L 5μ L ；2.5mM dNTP2 μ L ;引物27F1 μ L ;引物 1492R1 μ L ；5U/y L Taq 酶 0.2μ L ;基因組模板 DNAl μ L ；jjp dd H2O 至Ij 25 μ L。PCR 反應程序為 94°C 5min,94°C 30s, 50°C lmin,72°C lmin，30 個循環；72°C IOmin0 反應結束后，擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，觀察結果。找到16S rDNA目的條帶1500bp，切膠回收。將目的片段連接至載體Peasy-T3，送華大基因測序。測序結果為Gl的16S rDNA的核苷酸序列為序列表中的序列I。同Genbank數據庫中已知的16S rDNA序列進行BLAST同源性序列比對分析，結果用MEG4.0軟件進行分析。最終鑒定結果菌株Gl為多粘類芽孢桿菌Paenibacilluspolymyxa。Gl菌株,分類命名為多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa,于2012年11月2日，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所)，菌種保藏號為=CGMCC N0.6762。

實施例2、細菌Gl在防治辣椒疫病中的應用1、Gl菌劑的制備(I)種子液的制備:將實施例1分離保藏的多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa GICGMCCN0.6762接種在含濃度為500 μ g/mL硫酸鏈霉素(Ster)抗藥性標記的LA培養基上28°C培養活化后，移入裝有IOOmL LB培養液的250mL的三角瓶中，28°C，180rpm振蕩培養24h，得到Gl種子液。LA培養基:蛋白胨1(^，酵母粉58，似(:158，瓊脂粉178，蒸餾水10001111^!1值7.0;LB培養基:不加瓊脂粉，其它成分與LA培養基相同。(2)菌劑的制備:當Gl種子液培養至OD值在0.5時，將Gl種子液以1:100體積比加入LB培養液中，26°C，180rpm振蕩培養24h ;然后以11100 Xg離心IOmin去除上清液收集菌體沉淀。將菌體沉淀用無菌水懸浮稀釋得到Gl菌劑，菌劑濃度為I X IO7 — IX 101(lCfu/mL。2、細菌Gl在防治辣椒疫病中的應用( I)盆栽土壤的準備采用基質與大田土 2:1的比例攪拌均勻，高壓蒸汽滅菌后待用。( 2 )辣椒盆栽種植
辣椒(品種為特大茄門甜椒，由內蒙古赤峰市展欣種業公司生產銷售)種子28°C保濕催芽3天，萌發后用Gl菌劑(Gl菌劑中的活菌總濃度為I X 107cfu/mL)浸種Ih后播種到營養缽中。每缽澆灌Gl菌劑(Gl菌劑中的活菌總濃度為IXlO7) 50mL，以自來水處理為對照。每處理3個重復，每重復5盆，每盆6粒種子。當辣椒幼苗長至7-8葉期時，進行Gl菌劑強化接種處理，具體如下:先將20mLGl菌劑(活菌總濃度為I X 107cfu/mL)均勻噴灑在整盆辣椒苗上，IOmin后再將每盆用30mLGl菌劑(活菌總濃度為lX107cfu/mL)灌根處理。陰性對照組用自來水處理；陽性對照組采用相同方法制備的相同濃度和相同量的多粘類芽孢桿菌菌株XM (辣椒疫霉菌拮抗細菌的篩選，山東農業科學，2012,44(9):90 - 92 ;公眾可從山東農業大學獲得)的菌懸液處理。(3)辣椒疫霉接種Gl菌劑強化接種后第二天，用濃度為IX 105cfu/mL的辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株SD-33 (記載在辣椒疫霉(Phytophthora capsici)果膠甲基酯酶Pcpme3基因真核表達及功能研究，中國農業科學2009，42(6): 1988-1993 ;公眾可從山東農業大學獲得)游動孢子懸浮液灌根法接種，每株澆灌游動孢子懸浮液5mL。接種前提前將苗缽灌透水，接種后保濕24h，置于室內，適時澆水保持濕潤。接種后第7d調查發病(辣椒疫病)情況并計算防治效果，根據病害發生程度分為6級(林柏青等，辣椒品種抗疫病鑒定方法的初步研究[J].中國蔬菜，1994，(4):21-25):O級:無病；I級:幼苗莖基部稍有變黑，但植株健康不萎焉；2級:幼苗莖基部變黑達l-2cm，葉片不可恢復性萎焉，下部葉片偶有脫落；3級:幼苗莖基部變黑達2cm以上，葉片明顯萎焉或明顯脫落；
``
4級:幼苗莖基部變黑縊縮，除生長點外全部落葉或整株萎焉；5級:植株全部枯死。病情指數=[Σ (病級株數X代表級數)/總株數X最高級代表級數]X 100防治效果％=(對照病情指數-處理病情指數)/對照病情指數X 100苗期盆栽試驗結果如表I和圖1所示，可以看出，施用Gl菌劑的辣椒表現出較好的防治效果，達71.18%。表2生防細菌對辣椒疫病的溫室防治效果
權利要求
1.多粘類芽抱桿菌PaenibacilluspoIymyxa菌株Gl,其保藏號為CGMCC N0.6762。
2.一種制備防治辣椒疫病菌劑的方法，包括如下步驟:發酵權利要求1所述的多粘類芽孢桿菌Paenibacillus poIymyxa菌株Gl,得到發酵產物，即得到菌劑。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于:在所述得到發酵產物后，還包括如下步驟:收集所述發酵產物中的菌體沉淀，再懸浮所述菌體沉淀，得到菌劑。
4.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述收集發酵產物中的菌體沉淀采用離心的方式。
5.根據權利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于:所述發酵的條件如下:26-28°C、180-200rpm振蕩培養24_36h ;所述發酵的條件具體如下:26°C、180rpm振蕩培養24h。
6.由權利要求2-5中任一所述方法制備的菌劑；所述菌劑中的活菌總濃度具體為IXlO7 — lX10lclcfu/mL。
7.一種防治辣椒疫病或抗菌產品，其活性成分為權利要求1所述的多粘類芽孢桿菌Paenibacillus poIymyxa菌株Gl或權利要求6所述的菌劑。
8.根據權利要求7所述的產品，其特征在于:所述辣椒疫病為由辣椒疫霉Phytophthora capsici 弓I起； 所述抗菌為抗如下6種病原菌中的至少一種:楊樹腐爛病菌Valsa sordida、灰霉病菌 Botrytis cinerea、板栗疫病菌 Cryphonectria parasitica、瓜果腐霉 Pythiumaphanidermatum、立枯絲核菌 Rhizoctonia solani Kiihn 和辣椒疫霉 Phytophthoracapsici ο
9.權利要求1所述的多粘類芽孢桿菌PaenibacilluspoIymyxa菌株Gl或權利要求6所述的菌劑在防治辣椒疫病或抗菌中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于:所述辣椒疫病為由辣椒疫霉Phytophthora capsici 弓I起； 所述抗菌為抗如下6種病原菌中的至少一種:楊樹腐爛病菌Valsa sordida、灰霉病菌 Botrytis cinerea、板栗疫病菌 Cryphonectria parasitica、瓜果腐霉 Pythiumaphanidermatum、立枯絲核菌 Rhizoctonia solani Kiihn 和辣椒疫霉 Phytophthoracapsici ο
全文摘要
本發明公開了一種防治辣椒疫病的生防菌株G1及其應用。本發明提供了多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa菌株G1，其保藏號為CGMCC No.6762。本發明還提供了一種制備G1菌劑的方法，包括如下步驟發酵上述的多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa菌株G1，收集發酵產物，即得到G1菌劑。本發明的實驗證明，本發明針對目前辣椒疫病沒有較高防效的生防制劑現狀，提供開發一種防治辣椒疫病的單一細菌及其制劑，專用于辣椒疫病的防治，該細菌菌劑對這種重要的土傳病害有較高的防治效果，溫室辣椒疫病的防治效果達71.18%。
文檔編號A01N63/00GK103173386SQ20131007928
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月12日 優先權日2013年3月12日
發明者高克祥, 劉曉光, 趙影, 何邦令, 王慶華, 張修國 申請人:山東農業大學