專利名稱：一種煙草抗旱種質的快速、高通量篩選方法
技術領域：
本發明涉及煙草種質篩選方法，具體是一種煙草抗旱種質的快速、高通量篩選方法。
背景技術：
干旱是影響植物生長發育的主要環境因子之一。煙草在生長過程中，特別是從團棵期進入旺長期時常常遭遇干旱，干旱已經成為影響其營養生長的重要因素。因此，通過對煙草抗旱材料的篩選、利用，可望研究植物的抗旱機制，選育抗旱的煙草品種，以解決生產中的干旱問題。目前，前人在抗旱研究中得出了一些行之有效的抗旱篩選方法，這些方法有田間直接鑒定、旱棚鑒定、盆栽鑒定、室內模擬干旱發芽期鑒定等等，由于田間直接鑒定、旱棚鑒定與盆栽鑒定受自然條件、作物自身發育特性影響較大，試驗誤差較大；相比而言，由于室內模擬干旱具有條件可控性強、試驗周期短、方法簡單、適用于大批量篩選、鑒定，所以，室內模擬干旱的方法是較為常用的方法，但由于處理方法、測試時間和評價標準不同，試驗的結論也存在較大的誤 差。

發明內容
本發明針對現有技術存在的不足之處，提供一種煙草抗旱種質的快速、高通量篩選方法，該方法通過在種子發芽后的小苗期，采用高濃度、高分子量的聚乙二醇(PEG)滲透溶液模擬小苗生長的干旱脅迫條件，研究在高滲透溶液下煙草種子的根生長量和萎焉植株率，以減小誤差，提高篩選方法的準確性。本發明實現發明目的采用如下技術方案:一種煙草抗旱種質的快速、高通量篩選方法，其特點在于按如下步驟進行:( I)煙草種子的消毒處理精選大小一致、無破損的種子，用體積濃度8-12%H202處理lOmin，再用蒸餾水洗
3-4次后，晾干，待用；(2)煙草種子發芽試驗培養皿中以雙層濾紙為發芽床，然后放入步驟(I)消毒處理過的種子放入培養皿中，用蒸餾水進行發芽，蓋好培養皿后，放入晝溫度為28°C、10h，夜溫度為25°C、14h的氣候培養箱進行培養；(3)定苗、控水連續培養7-10天后，取出，進行定苗，剔除未發芽種子、弱苗，留長勢較好的小苗，傾斜放置培養皿，控水至濾紙吸水至飽和，用移液器吸出多余水份；(4)PEG-6000 處理加入等同濾紙吸收飽和所需蒸餾水量的50%PEG-6000，至皿中PEG-6000終質量濃度為25%，然后蓋好培養皿，用石蠟膜封口，放入晝溫度為28°C、10h，夜溫度為25°C、14h的氣候培養箱進行培養；以蒸餾水處理為對照；(5)煙草萎焉比率和根長變化量的測定步驟(3)長勢較好的小苗經步驟(4)的氣候培養箱培連續培養5天后，取出，記錄煙草小苗萎焉植株數，測定小苗的根長，計算小苗萎焉植株數和根長生長變化量。計算公式①、②①萎焉率(％)=(萎焉小苗植株數/小苗總數)X 100%②根長伸長比(％)= (PEG處理后小苗根長-PEG處理前小苗根長)/ (PEG處理前小苗根長)X 100%·
其中，對不同的材料，萎焉率越小、根長變化比越大，表明材料的抗旱性越好。與已有技術相比，本發明有益效果體現在:本發明通過對種子發芽后的萎焉率和根長伸長比比較來篩選抗旱煙草材料，其操作簡單，快速，誤差小，準確性好，能有效、快速的進行煙草抗旱材料的大批量篩選。


圖1是本發明篩選方法中采用PEG-6000處理條件下的不同品種(系)小苗萎焉率比較。圖2是本發明篩選方法中采用PEG-6000處理條件下的不同煙草品種根長伸長比比較。圖3是傳統篩選方法中采用PEG-6000處理條件下的不同品種發芽率比較。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發明做進一步詳細的說明:實施例1本發明具體實施方式
采用的材料及儀器:儀器:人工氣候培養箱、移液器、培養皿、直尺材料:PEG-6000、蒸餾水、濾紙、石蠟膜如下實施例材料:歪把子、云煙87、安選一號、云煙97、K326、長脖黃、NC89、中煙100、吉煙9號、6517、NC82、Coker411、春雷三號、中煙14 ;均由安徽省農業科學院煙草研究所提供。實施例:( I)煙草種子的消毒處理:取上述煙草材料(歪把子、云煙87、安選一號、云煙97、K326、長脖黃、NC89、中煙100、吉煙9號、6517、NC82、Coker411、春雷三號、中煙14)種子每份0.08g (約1000粒)裝入網袋中，先用蒸餾水水洗3次，然后用體積濃度10%H202處理lOmin，再用蒸餾水洗3_4次后，晚干，待用。(2) 50%高濃度PEG-6000滲透液的配置以IOOOml為例，精確稱取PEG-6000 500g，加入蒸餾水充分溶解，而后定容至IOOOml0(3)煙草種子發芽試驗
以9cm雙層濾紙為發芽床，以IlOmm培養皿為載體，放入步驟(I)消毒處理過的種子，每個培養皿均勻放入130粒，分6個重復，用蒸餾水進行發芽，蓋好培養皿后，放入晝溫度為28°C (IOh)，夜溫度為25°C (14h)的氣候培養箱進行培養。(4)定苗、控水連續培養10天后，取出，進行定苗，剔除未發芽種子、弱苗，每皿留長勢較好的小苗100株，傾斜放置培養皿，控水至濾紙吸水至飽和，用移液器吸出多余水份。(5)PEG_6000 處理以9cm雙層濾紙吸水至飽和時，總含水量為3ml，加入3ml50%PEG_6000，至皿中PEG-6000終質量濃度為25%，而后蓋好培養皿，用石蠟膜封口，放入晝溫度為28°C (IOh)，夜溫度為25V (14h)的氣候培養箱進行培養。以蒸餾水處理為對照，處理與對照各設分3個重復。(6)煙草萎焉比率和根長變化量的測定步驟5培養5天后，取出，記錄煙草小苗萎焉植株數，測定小苗的根長，計算小苗萎焉植株數和根長生長變化量。計算公式①、②①萎焉率(％)=(萎焉小苗植株數/小苗總數)X 100%②根長伸長比(％)= (PEG處理后小苗根長-PEG處理前小苗根長)/ (PEG處理前小苗根長)X 100% 實驗室快速鑒定結果與分析1、PEG-6000對不同煙草品種小苗萎焉率的影響利用PEG-6000處理歪把子、云煙87、安選一號、云煙97、K326、長脖黃、NC89、中煙100、吉煙9號、6517、NC82、Coker411、春雷三號、中煙14共14個烤煙品種(系)進行品種抗旱性的萎焉率指標研究。結果表明:三組重復中，萎焉率大小差異均表現為6517〈中煙14〈吉煙9號〈長脖黃〈云煙97〈安選一號〈中煙100〈NC89〈春雷三號<K326〈Coker411〈 NC82<云煙87〈歪把子，部分品種(系)間差異顯著，重復性好，圖1為其中一組重復中不同烤煙品種的萎焉率比較。2.PEG-6000對不同煙草品種根長伸長比的影響利用PEG-6000處理歪把子、云煙87、安選一號、云煙97、K326、長脖黃、NC89、中煙100、吉煙9號、6517、NC82、Coker411、春雷三號、中煙14共14個烤煙品種(系)進行品種抗旱性的根生長伸長比的指標研究。結果表明:三組重復中，根長伸長比差異均表現為為6517〉中煙14>吉煙9號〉云煙97>長脖黃 > 安選一號 > 中煙100>NC89>春雷三號>K326>Coker411> NC82>云煙87>歪把子，部分品種(系)間差異顯著，重復性好，且與小苗萎焉率表現基本一致，如圖2所示，為其中一組重復中不同烤煙品種的根長伸長比比較。實施例2用常規PEG-6000浸種方法篩選抗旱材料本發明具體實施方式
采用的材料及儀器:儀器:人工氣候培養箱、移液器、培養皿材料:PEG-6000、蒸餾水、濾紙、石蠟膜如下實施例材料:歪把子、云煙87、安選一號、云煙97、K326、長脖黃、NC89、中煙100、吉煙9號、6517、NC82、Coker411、春雷三號、中煙14均由安徽省農業科學院煙草研究所提供。實施例:( I)煙草種子的消毒處理:取上述煙草材料(歪把子、云煙87、安選一號、云煙97、K326、長脖黃、NC89、中煙100、吉煙9號、6517、NC82、Coker411、春雷三號、中煙14)種子每份0.08g (約1000粒)裝入網袋中，先用蒸餾水水洗3次，然后用體積濃度10%H202處理lOmin，再用蒸餾水洗3_4次后，晚干，待用。(2) 25%高濃度PEG-6000滲透液的配置以IOOOml為例，精確稱取PEG-6000 250g，加入蒸餾水充分溶解，而后定容至IOOOml0(3)煙草種子發芽試驗以9cm雙層濾紙為發芽床，以IlOmm培養皿為載體，放入步驟(I)消毒處理過的種子，每個培養皿均勻放入100粒，而后加入25%的PEG-6000滲透液進行發芽試驗，以蒸餾水作為對照，分3個重復，蓋好培養皿后，用石蠟膜封口，放入晝溫度為28°C (IOh)，夜溫度為250C (14h)的氣候培養箱進行培養。(4)發芽率計數連續培養10天后，拿出培養皿，清點發芽的種子數與不發芽種子數，計算發芽率。計算公式:
發芽率(％)=(發芽種子數/小苗總數)X 100%實驗室快速鑒定結果與分析利用PEG-6000處理歪把子、云煙87、安選一號、云煙97、K326、長脖黃、NC89、中煙100、吉煙9號、6517、NC82、Coker411、春雷三號、中煙14共14個烤煙品種(系)種子進行品種抗寒性的發芽率比較，結果表明，PEG-6000處理后，三組重復中，按種子發芽率由大到小排列分別為中煙14>6517>云煙97>吉煙9號〉長脖黃> NC89>Coker411>安選一號 > 中煙100>K326>春雷三號 > 歪把子 > 云煙87>NC82 ；6517>云煙97>中煙14>吉煙9號〉長脖黃> NC89>Coker411>NC82>安選一號 > 中煙100>K326>春雷三號 > 歪把子 > 云煙87 ;云煙97>6517>中煙14>吉煙9號〉長脖黃> Coker411>NC89>安選一號 > 中煙100>K326>春雷三號〉歪把子〉云煙87>NC82 (如圖3所示)；各重復結果存在一定的差異，這主要由于種子自身品質特性存在差異造成的，試驗中發現，雖是同年收獲的同一品種種子，但正常條件下，種子自身發芽率也存在差異，因此，利用傳統的PEG-6000浸種方法依據發芽率進行抗旱材料篩選，誤差相對較大。
權利要求
1.一種煙草抗旱種質的快速、高通量篩選方法，其特征在于按如下步驟進行: (1)煙草種子的消毒處理 精選大小一致、無破損的種子，用體積濃度8-12%H202處理lOmin，再用蒸餾水洗3_4次后，晚干，待用； (2)煙草種子發芽試驗 培養皿中以雙層濾紙為發芽床，然后放入步驟(I)消毒處理過的種子放入培養皿中，用蒸懼水進行發芽，蓋好培養皿后，放入晝溫度為28°C、10h,夜溫度為25°C、14h的氣候培養箱進行培養； (3)定苗、控水 連續培養7-10天后，取出，進行定苗，剔除未發芽種子、弱苗，留長勢較好的小苗，傾斜放置培養皿，控水至濾紙吸水至飽和，用移液器吸出多余水份； (4)PEG-6000 處理 加入等同濾紙吸收飽和所需蒸餾水量的50%PEG-6000，至皿中PEG-6000終濃度為25%，然后蓋好培養皿，用石蠟膜封口，放入晝溫度為28°C、10h，夜溫度為25°C、14h的氣候培養箱進行培養；以蒸餾水處理為對照； (5)煙草萎焉比率和根長變化量的測定 步驟(3)長勢較好的小苗經步驟(4)的氣候培養箱培連續培養5天后，取出，記錄煙草小苗萎焉植株數，測定小苗的根 長，計算小苗萎焉植株數和根長生長變化量。
全文摘要
本發明公開了一種煙草抗旱種質的快速、高通量篩選方法，其方法是煙草發芽試驗過程中，待煙草完全發芽，子葉完全展開后，利用高濃度、高分子量的聚乙二醇滲透液模擬煙草幼苗發根和生長的干旱脅迫條件，研究在高滲溶液下煙草小苗的根生長量和植株萎焉比率，從而快速篩選抗旱的煙草，本發明的意義在于規避了煙草種質間在后期生長過程中，由種質生長特性而造成的差異，提供了一種操作簡單，快速，準確性好的煙草高通量抗旱篩選方法，為煙草抗旱機理的研究及抗旱材料的利用奠定了基礎，有助于煙草的抗旱分離群體篩選。
文檔編號A01C1/00GK103109687SQ20131008080
公開日2013年5月22日 申請日期2013年3月14日 優先權日2013年3月14日
發明者李廷春, 周應兵, 楊華應 申請人:安徽省農業科學院煙草研究所