專利名稱：香港牡蠣精子超低溫冷凍保存以及激活方法
技術領域：
本發明屬于精子超低溫冷凍技術領域，特別是一種香港牡蠣精子超低溫冷凍保存以及激活方法。
背景技術：
香港牡販(Cra1S1SO1Sirea riraJaris)隸屬瓣觸綱,牡販目，牡販科。是我國常見的具有經濟價值的貝類。香港牡蠣是廣西海水養殖業的主要養殖對象，廣西沿海是香港牡蠣主要原產地。近年來，養殖的香港牡蠣發生大規模死亡，產量不斷下滑，效益下降。種質退化及苗種短缺是香港牡蠣養殖業發展的首要制約因素，開展香港牡蠣良種選育及規模化苗種繁育的研究迫在眉睫。目前精子冷凍在豬、牛、羊、犬等哺乳動物和人類中技術較為成熟，水生動物中的魚類、馬氏珠母貝、太平洋牡蠣精子冷凍也有報道，查到如下相關文獻:
1.申請號:200710156398.8，發明名稱:豬精液冷凍保存管及其豬精液冷凍保存方法，其豬精液冷凍保存方法的要點是:將豬精液預處理和精液冷卻處理后的冷凍稀釋后的精液裝入該發明的豬精液冷凍保存管的環形容器中，然后將豬精液冷凍保存管插入液氮上，熏蒸數分鐘后，直接投入液氮中長期保存。優點在于:具有在冷凍過程中增加精液和液氮的接觸面積，加快精液冷凍速率，降低冷凍對精子的損傷，提高冷精活率；還具有成本低，操作便當，功效聞，保證受:胎率等優點。2.申請號:200710043611.4，發明名稱:褐牙鲆精子快速冷凍保存方法，其技術方案是將天然海水稀釋，以不能激活精子的稀釋海水作為保存精子的稀釋液；采用濃度為14g/100ml乙二醇作為冷 凍劑；將稀釋液+抗凍劑作為褐牙鲆精子的低溫冷凍保護液，將冷凍保護液在4°C的恒溫箱預冷；精子與保護液按1:1至1: 3比例均勻混合放入離心管中，將離心管置于液氮罐口下_20°C平衡lmin，然后快速投入液氮中保存。該發明的優點是操作簡便，能快速保存褐牙鲆精子。3.申請號:201110258042.1，發明名稱:太平洋鱈魚精子保存冷凍劑及太平洋鱈魚精子保存方法，其冷凍劑由冷凍稀釋液和抗凍劑按照9: I (體積比)的比例混合而成，其中冷凍稀釋液的組分含量為:NaCl:42-48mM, KHCO3:2.5-3.5mM, CaCl2:2.5-3.5mM，葡萄糖:35-45mM, Tris:1.5-2.5mM，谷胱甘肽:1.5-2.5mM，牛血清蛋白:1.5-2.5g/L，所述的冷凍稀釋液的PH值范圍是:6.7-6.9 ;所述的冷凍劑中的抗凍劑為二甲亞砜(DMS0)。以及利用這種冷凍劑進行太平洋鱈魚精子超低溫保存的方法。這種冷凍劑及這種保存方法，能夠長期保存太平洋鱈魚精子，并能保證解凍后精子活力仍能夠達到80%以上。
4.李贊，賀桂珍，王品虹；超低溫保存前后太平洋牡蠣精子(Grassos treagigas(Thunberg))超微結構觀察，青島海洋大學學報，2002，32 (4):526 532 ;僅提到應用掃描電鏡和透射電鏡技術，研究超低溫冷凍前后太平洋牡蠣精子形態與超微結構。超低溫冷凍保存，是指在超低溫(_196'198°C )條件下抑制精子細胞內一切新陳代謝活動，并使精子細胞被長期保存而不喪失活性的一種保存技術。在超低溫條件下精子細胞之所以能長期保存，是因為精子細胞內一切新陳代謝過程中的化學變化被超低溫所抑制，即隨著溫度的逐漸下降，細胞內的化學反應能力也在逐漸降低，當溫度降到一定限度時，細胞內所有的化學變化也就處于一種“暫停”狀態而使細胞得以長期保存；低溫保存的細胞以一定的方式復蘇后，又具有存活的能力。影響冷凍效果的因素主要包括精子的來源、冷凍稀釋液和防凍劑的選擇、冷凍和解凍方法的選擇。在精子的冷凍過程中外來的壓力，如冷休克、防凍劑的毒性、冰晶的形成、滲透壓的改變，都會造成精子結構和功能的損傷，其損傷程度則由精子自身對外來壓力的耐受能力來決定。不同物種其冷凍保存的基礎液、抗凍保護劑、降溫方法、及復蘇都有差異。目前，尚未查到關于香港牡蠣精子超低溫冷凍保存以及激活方法的報道。

發明內容
本發明的目的是為了解決香港牡蠣良種選育中優良種質的保存技術難題，提供一種香港牡蠣精子超低溫冷凍保存以及激活方法，通過本發明提高了香港牡蠣精子成活率、活力、受精率及孵化率，可以加快香港牡蠣的育種進程，為今后香港牡蠣育種的發展及良種的規模化苗種繁育提供幫助，在香港牡蠣種質資源的保存和生物多樣性的保護研究方面意義重大。為了實現上述目的，本發明是通過以下技術方案實現的:
一種香港牡蠣精子超低溫冷凍保存方法，包括香港牡蠣精子采集、稀釋和冷凍，所述稀釋是用由基礎液和抗凍劑組成的稀釋液對香港牡蠣精子進行稀釋、平衡；所述冷凍是采用程序降溫法進行冷凍，最終在液氮中保存。在本發明中，香港牡蠣精子的采集也是重要的一個環節，同一物種不同個體間的精液品質有很大不同。一般情況下，冷凍前精液質量越好，解凍后精子的活力就會越好。因此，本發明中所選取的香港牡蠣，個體長5 7cm，寬3 5cm，高l(Tllcm。作為進一步的說明，以上所述基礎液是由檸檬酸鈉和甘氨酸組成的溶液或生理鹽水溶液。作為優選，以上所述檸檬酸鈉和甘氨酸組成的溶液，其配方為:檸檬酸鈉
0.Γ0.3mol/L,甘氨酸0.2^0.4mol/L,余量為無菌蒸餾水。作為優選，以上所述生理鹽水溶液的質量濃度為0.6^0.9%。在本發明中，所選用的基礎液及所限定的濃度范圍，主要作用是優化香港牡蠣精子所處環境的滲透壓與PH值，為香港牡蠣精子提供能量，防止精子細胞內磷脂的流失并起著防凍劑的作用，防止細菌污染，給精子適應外界環境創造有利條件。作為優選，以上所述抗凍劑由二甲基亞砜和海藻糖組成，二甲基亞砜在稀釋液中的體積含量為10% 14%，海藻糖在稀釋液中含量為0.25 0.45mol/L。因不同物種的精子對不同防凍劑毒害作用的承受能力和其滲透性也不同，本發明經過篩選、組合和調節，對抗凍劑進行優化，可以有效減少香港牡蠣精子冷凍過程中的冷凍損傷，并且毒害作用低，對香港牡蠣精子復蘇過程的影響也較小。作為進一步的說明，以上所述稀釋液是按體積比2(Γ80: I加入精液中進行稀釋。作為進一步的說明，以 上所述平衡是將稀釋液與精液混勻后在3飛。C條件下平衡l(T60min。其目的是保證精子有一段適應低溫的過程，同時又能使抗凍劑充分滲透進香港牡蠣精子細胞內發揮作用，減少、甚至避免了精子的冷休克損傷，進而起到抗凍保護作用。作為進一步的說明，以上所述程序降溫法是將稀釋后的精液從4°C以_5°C /min的降溫速率降至_20°C，在_20°C平衡5min，再從_20°C以-10°C /min的速率降至_80°C，在-80°C平衡5min，最后將其從程序降溫儀中取出放進棉布網兜內，再投入-196°C _198°C液氮罐中保存。在精子的冷凍過程中，冷凍速率會影響到精子細胞內外溶液的滲透壓和PH的平衡，是超低溫冷凍保存的一個決定性因素。程序降溫法是利用程序降溫儀，按照預先設計的降溫程序將精子所處的環境降至一定溫度，然后將其放入液氮中保存。這是一種降溫速度較慢的冷凍模式。過慢的冷卻過程會使溶液的電解質濃度逐漸增高，而當精子在高濃度的溶液中暴露時間過長時，會導致精子細胞膜脂蛋白復合體被破壞和膜被分解。當細胞膜脫水收縮達到臨界最小體積時，又會使細胞膜的滲透性產生不可逆的損傷，原來不能透過膜的溶質變成可滲透性的、進而造成細胞損傷或死亡。冷卻速度越慢，由電解質濃度增高所引起的滲透壓損傷就越大；如果提高降溫速度，則可造成細胞內冰晶的形成而引起損傷，冷卻速率越快，冰晶形成的數量越多，損傷就越大。因此，本發明所優選的冷凍程序，是精子超低溫保存獲得最佳降溫速率的范圍。如上所述的香港牡蠣精子激活方法，包括解凍和激活步驟，所述解凍，是將液氮保存精子取出，在35 55°C恒溫水浴解凍至完全融解；所述激活，是向解凍復蘇后精子中添加終質量濃度為0.1563 0.6250%。的氨海水，即氨海水與精液混合后精液中氨質量含量為0.1563 0.6250%。，使其恢復受精能力。激活后精子活力為56°/Γ77%，成活率為70°/Γ87%。本發明中，在香港牡蠣精子激活后，隨后進行精子質量檢測，對精子的動、靜態特征進行量化分析，從而對精子質量作出全面評價，得到存活率高、活力強、受精率高的的香港牡蠣精子。所述的精子質量檢測是利用計算機識別技術和圖像處理技術，對精子的動態和靜態特征進行全面的量化分析，檢測精子的運動軌跡、運動速率、分布、精子外形、精子數量、粘稠度和活力。 與現有技術相比，本發明的有益效果是:
1.本發明所選用的稀釋液，基礎液是由檸檬酸鈉和甘氨酸組成的溶液或生理鹽水溶液，抗凍劑由二甲基亞砜和 海藻糖組成，其毒害作用低，并且優化了香港牡蠣精子所處環境的滲透壓與PH值，為香港牡蠣精子提供能量，防止精子細胞內磷脂的流失并起著防凍劑的作用，防止細菌污染，給精子適應外界環境創造有利條件。2.本發明采用程序降溫法，選定了最佳降溫速率，既減少了降溫速度過高造成細胞內冰晶的形成而引起損傷，也避免了降溫速度過低導致精子細胞膜脂蛋白復合體被破壞和膜被分解。3.本發明將液氮保存精子在35 55°C恒溫水浴解凍至完全融解，再向復蘇后精子中添加終質量濃度為0.1563 0.6250%。的氨海水，其細胞損傷率最低，激活率最高。4.本發明能夠超低溫冷凍保存香港牡蠣精子，復蘇后其精子成活率高，活力強，可運用于實際生產需要，并能達到隨時取用的目的；打破了不同物種繁殖季節限制為遠緣雜交、培育優質品種提供了新途徑；為野生種質資源保護、良種種質保存、遺傳多樣性保護提供技術支撐。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式并不局限于實施例表示的范圍。實施例1:
O精子采集:選取廣西欽州龍門鎮水域養殖的香港牡蠣，選擇個體長5cm、寬3cm、高IOcm香港牡蠣進行解剖，選取經鑒定為雄性的個體5只將其精子混勻后使用。2)稀釋液:配置IOOml稀釋液，其中檸檬酸鈉含量0.1124mol/L，甘氨酸含量
0.2667 mol/L，海藻糖0.25 mol/L，二甲基亞砜10% (v/v)，余量為無菌蒸餾水；；
3)程序降溫儀程序設置:從4°C以_5°C /min的降溫速率降至_20°C，在_20°C平衡5min，再從 _20°C 以 _10°C /min 的速率降至 _80°C，在 _80°C平衡 5min。4)精液與稀釋液按照體積比1:80稀釋，保存在1.5ml塑料冷凍管中，在4°C冰箱平衡30min后，即放入已設好程序的程序降溫儀中開始程序降溫。5)程序結束后保存在-198 C液氣iig中冷凍保存，保存48h后在35 C恒溫水浴中完全解凍，向復蘇后精子中添加終質量濃度為0.1563%。的氨海水，開始檢測。6)利用實驗室現有的精子質量分析系統(CASA)進行精子質量的計算機輔助檢測，利用現代化的計算機識別技術和圖像處理技術，對精子的動靜態特征進行全面的量化分析。檢測分析結果:精子活力為56.88 68.14%，成活率為70.69 79.58%。實施例2:
O精子采集:選取廣西欽州龍門鎮水域養殖的香港牡蠣，選擇個體長6cm、寬4cm、高
10.5cm香港牡蠣進行解剖，選取經鑒定為雄性的個體4只將其精子混勻后使用。2)稀釋液:配置IOOml稀釋液，其中檸檬酸鈉含量0.lmol/L，甘氨酸含量0.4mol/L，海藻糖0.30 mol/L，二甲基亞砜12% (v/v)，余量為無菌蒸餾水；；
3)程序降溫儀程序設置:從4°C以_5°C /min的降溫速率降至_20°C，在_20°C平衡5min，再從 _20°C 以 _10°C /min 的速率降至 _80°C，在 _80°C平衡 5min。4)精液與稀釋液按照體積比1:60稀釋，保存在1.5ml塑料冷凍管中，在:TC冰箱平衡IOmin后，即放入已設好程序的程序降溫儀中開始程序降溫。5)程序結束后保存在-196 C液氣iig中冷凍保存，保存48h后在45 C恒溫水浴中完全解凍，向復蘇后精子中添加終質量濃度為0.2489%。的氨海水。開始檢測。6)利用實驗室現有的精子質量分析系統(CASA)進行精子質量的計算機輔助檢測，利用現代化的計算機識別技術和圖像處理技術，對精子的動靜態特征進行全面的量化分析。檢測分析結果:精子活力為55.72 67.65%，成活率為69.88 78.40%。實施例3:
O精子采集:選取廣西欽州龍門鎮水域養殖的香港牡蠣，選擇個體長7cm、寬5cm、高Ilcm香港牡蠣進行解剖，選取經鑒定為雄性的個體5只將其精子混勻后使用。2)稀釋液:配置IOOml稀釋液，其中檸檬酸鈉含量0.3mol/L，甘氨酸含量0.2mol/L，海藻糖0.45 mol/L，二甲基亞砜14% (v/v)，余量為無菌蒸餾水；；
3)程序降溫儀程序設置:從4°C以_5°C /min的降溫速率降至_20°C，在_20°C平衡5min，再從 _20°C 以 _10°C /min 的速率降至 _80°C，在 _80°C平衡 5min。4)精液與稀釋液按照體積比1:20稀釋，保存在1.5ml塑料冷凍管中，在5°C冰箱平衡60min后，即放入已設好程序的程序降溫儀中開始程序降溫。
5)程序結束后保存在-197 C液氣iig中冷凍保存，保存48h后在45 C恒溫水浴中完全解凍，向復蘇后精子中添加終質量濃度為0.3945%。的氨海水。開始檢測。6)利用實驗室現有的精子質量分析系統(CASA)進行精子質量的計算機輔助檢測，利用現代化的計算機識別技術和圖像處理技術，對精子的動靜態特征進行全面的量化分析。檢測分析結果:精子活力為58.04 71.23%，成活率為71.54 80.02%。實施例4:
O精子采集:選取廣西欽州龍門鎮水域養殖的香港牡蠣，選擇個體長6cm、寬3cm、高IOcm香港牡蠣進行解剖，選取經鑒定為雄性的個體4只將其精子混勻后使用。2)稀釋液:配置IOOml稀釋保護液，其中氯化鈉為0.8% (m/m)，海藻糖0.25 mol/L, 二甲基亞砜10% (ν/ν)ο3)程序降溫儀程序設置 .從4V以-5 V /min的降溫速率降至-20V，在-20 V平衡5min，再從-20°C以-10°C /min的速率降至_80°C，在_80°C平衡5min。4)精液與稀釋液按照體積比1:80稀釋，保存在1.5ml塑料冷凍管中，在4°C冰箱平衡30min后，即放入已設好程序的程序降溫儀中開始程序降溫。5)程序結束后保存在-198 C液氣iig中冷凍保存，保存48h后在35 C恒溫水浴中完全解凍，向復蘇后精子中添加終質量濃度為0.5466%。的氨海水。開始檢測。6)利用實驗室現有的精子質量分析系統(CASA)進行精子質量的計算機輔助檢測，利用現代化的計算機識別技術和圖像處理技術，對精子的動靜態特征進行全面的量化分析。檢測分析結果:精子活力為60.91 76.07%，成活率為77.61 86.92%。實施例5:`
O精子采集:選取廣西欽州龍門鎮水域養殖的香港牡蠣，選擇個體長6cm、寬3cm、高IOcm香港牡蠣進行解剖，選取經鑒定為雄性的個體4只將其精子混勻后使用。2)稀釋液:配置IOOml稀釋保護液，其中氯化鈉為0.6% (m/m)，海藻糖0.40 mol/L，二甲基亞砜13% (v/v)，余量為無菌蒸餾水。3)程序降溫儀程序設置 .從4V以-5 V /min的降溫速率降至_20V，在_20 V平衡5min，再從-20°C以-10°C /min的速率降至_80°C，在_80°C平衡5min。4)精液與稀釋液按照體積比1:80稀釋，保存在1.5ml塑料冷凍管中，在4°C冰箱平衡30min后，即放入已設好程序的程序降溫儀中開始程序降溫。5)程序結束后保存在-198 C液氣iig中冷凍保存，保存48h后在35 C恒溫水浴中完全解凍，向復蘇后精子中添加終質量濃度為0.6250%。的氨海水。開始檢測。6)利用實驗室現有的精子質量分析系統(CASA)進行精子質量的計算機輔助檢測，利用現代化的計算機識別技術和圖像處理技術，對精子的動靜態特征進行全面的量化分析。檢測分析結果:精子活力為59.81 75.85%，成活率為78.12 87.98%。實施例6:
O精子采集:選取廣西欽州龍門鎮水域養殖的香港牡蠣，選擇個體長6cm、寬3cm、高IOcm香港牡蠣進行解剖，選取經鑒定為雄性的個體4只將其精子混勻后使用。2)稀釋液:配置IOOml稀釋保護液,其中氯化鈉為0.9% (m/m),海藻糖0.45 mol/L, 二甲基亞砜10% (ν/ν)ο3)程序降溫儀程序設置 .從4V以-5 V /min的降溫速率降至-20V，在-20 V平衡5min，再從-20°C以-10°C /min的速率降至_80°C，在_80°C平衡5min。4)精液與稀釋液按照體積比1:80稀釋，保存在1.5ml塑料冷凍管中，在4°C冰箱平衡30min后，即放入已設好程序的程序降溫儀中開始程序降溫。5)程序結束后保存在-198 C液氣iig中冷凍保存，保存48h后在35 C恒溫水浴中完全解凍，向復蘇后精子中添加終質量濃度為0.5421%。的氨海水。開始檢測。6)利用實驗室現有的精子質量分析系統(CASA)進行精子質量的計算機輔助檢測，利用現代化的計算機識別技術和圖像處理技術，對精子的動靜態特征進行全面的量化分析。檢測分析結果:精子活力為61.27 77.46%，成活率為78.61 87.72%。實施例7:
O精子采集:選取廣西欽州龍門鎮水域養殖的香港牡蠣，選擇個體長7cm、寬5cm、高Ilcm香港牡蠣進行解剖，選取經鑒定為雄性的個體3只將其精子混勻后使用。2)稀釋液:配置IOOml稀釋保護液，其中D_Hank’s液(I升溶液中含氯化鉀0.4g,磷酸二氫鉀0.06g,氯化鈉8.0Og,碳酸氫鈉0.35g，7水磷酸氫二鈉0.09g,酚紅0.0lg)，海藻糖 0.25 mol/L, 二甲基亞砜 10% (v/v)。 3)程序降溫儀程序設置 .從4V以-5 V /min的降溫速率降至-20V，在-20 V平衡5min，再從-20°C以-10°C /min的速率降至_80°C，在_80°C平衡5min。4)精液與稀釋液按照體積比1:80稀釋，保存在1.5ml塑料冷凍管中，在4°C冰箱平衡30min后，即放入已設好程序的程序降溫儀中開始程序降溫。5)程序結束后保存在-198 C液氣iig中冷凍保存，保存48h后在35 C恒溫水浴中完全解凍，向復蘇后精子中添加終質量濃度為0.6250%。的氨海水。開始檢測。6)利用實驗室現有的精子質量分析系統(CASA)進行精子質量的計算機輔助檢測，利用現代化的計算機識別技術和圖像處理技術，對精子的動靜態特征進行全面的量化分析。檢測分析結果:精子活力為44-47.28%，成活率為71.86-72.58%。實施例7為對應實驗，通過實施例f 6與實施例7對比，可以看出本方法的稀釋液可以提聞精子活力和成活率。
權利要求
1.一種香港牡蠣精子超低溫冷凍保存方法，包括香港牡蠣精子采集、稀釋和冷凍，其特征在于:所述稀釋是用由基礎液和抗凍劑組成的稀釋液對香港牡蠣精子進行稀釋、平衡；所述冷凍是采用程序降溫法進行冷凍，最終在液氮中保存。
2.根據權利要求1所述的香港牡蠣精子超低溫冷凍保存方法，其特征在于:所述基礎液是由檸檬酸鈉和甘氨酸組成的溶液或生理鹽水溶液。
3.根據權利要求2所述的香港牡蠣精子超低溫冷凍保存方法，其特征在于:所述檸檬酸鈉和甘氨酸組成的溶液，其配方為:檸檬酸鈉0.Γ0.3mol/L，甘氨酸0.2^0.4mol/L，余量為無菌蒸懼水。
4.根據權利要求2所述的香港牡蠣精子超低溫冷凍保存方法，其特征在于:所述生理鹽水溶液的質量濃度為0.6^0.9%。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的香港牡蠣精子超低溫冷凍保存方法，其特征在于:所述抗凍劑由二甲基亞砜和海藻糖組成，二甲基亞砜在稀釋液中的體積含量為10% 14%，海藻糖在稀釋液中含量為0.25 0.45mol/L。
6.根據權利要求5所述的香港牡蠣精子超低溫冷凍保存方法，其特征在于:所述稀釋液是按體積比2(Γ80: I加入精液中進行稀釋。
7.根據權利要 求5所述的香港牡蠣精子超低溫冷凍保存方法，其特征在于:所述平衡是將稀釋液與精液混勻后在3 5°C條件下平衡l(T60min。
8.根據權利要求1-4和6-7中任一項所述的香港牡蠣精子超低溫冷凍保存方法，其特征在于:所述程序降溫法是將稀釋后的精液從4°C以_5°C /min的降溫速率降至_20°C，在-20°C平衡5min，再從-20°C以-10°C /min的速率降至_80°C，在_80°C平衡5min，最后取出投入_196°C _198°C液氮罐中保存。
9.一種如權利要求廣8中任一項所述的香港牡蠣精子激活方法，包括解凍和激活步驟，其特征在于:所述解凍，是將液氮保存精子取出，在35 55°C恒溫水浴解凍至完全融解；所述激活，是向復蘇后精子中添加終質量濃度為0.1563 0.6250%。的氨海水。
全文摘要
本發明公開香港牡蠣精子超低溫冷凍保存方法，包括香港牡蠣精子采集、稀釋和冷凍，其特征在于所述稀釋是用由基礎液和抗凍劑組成的稀釋液對香港牡蠣精子進行稀釋、平衡；所述冷凍是采用程序降溫法進行冷凍，最終在液氮中保存。經上述步驟冷凍保存的香港牡蠣精子激活方法，包括解凍和激活步驟，所述解凍，是將液氮保存精子取出，在35～55℃恒溫水浴解凍至完全融解；所述激活，是向復蘇后精子中添加終質量濃度為0.1563～0.6250‰的氨海水。通過本發明提高了香港牡蠣精子成活率、活力、受精率及孵化率，可以加快香港牡蠣的育種進程，為今后香港牡蠣育種的發展及良種的規模化苗種繁育提供幫助，在香港牡蠣種質資源的保存和生物多樣性的保護研究方面意義重大。
文檔編號A01N1/02GK103141472SQ201310087708
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月19日 優先權日2013年3月19日
發明者李詠梅, 楊春玲, 陳秀荔, 彭敏, 蔣偉明 申請人:廣西壯族自治區水產研究所