專利名稱：紅掌盆栽品種的離體組織培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及紅掌盆栽品種外植體的離體組織培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
^LliAnthuriuin aflt/raea/w )為天南星科花燭屬多年生草本花丼,原產(chǎn)于南美洲熱帶雨林，喜高溫和高濕的環(huán)境條件。紅掌莖短縮、節(jié)上多氣生根，株高50 80cm，葉聚生莖頂、革質(zhì)，葉心形、橢圓形等?；ㄅc葉輪流生長，一片葉下抽出一枝花，佛焰苞心狀卵形，顏色有紅色、粉色、白色、綠色等，肉穗花序無柄、黃色，適宜的生長條件下全年均可開花。因其花葉奇特，花期長達數(shù)月之久，廣泛應(yīng)用于室內(nèi)外花卉的裝飾。紅掌生長周期較長，常規(guī)的種子繁殖和分株繁殖很難滿足花卉市場的需求，植物組織培養(yǎng)技術(shù)無疑是縮短繁殖周期、大量供應(yīng)種苗的有效途徑，并能保證母本的優(yōu)良品種特性。自上個世紀七十年代，國外Pierk等人利用葉片外植體成功建立紅掌組織培養(yǎng)體系以來，組織培養(yǎng)繁殖方法逐步取代了傳統(tǒng)繁殖方法，我國在成功引進紅掌栽培以來，因其葉花特色，受到國人的喜愛，國內(nèi)市場對紅掌種苗的需求日益擴大，國內(nèi)紛紛對其組織培養(yǎng)再生技術(shù)進行了研究，并取得了一定的進展，但還存在一定問題，如外植體選擇、處理方法、培養(yǎng)基組成、激素條件等方面尚無相對統(tǒng)一的說法，結(jié)論呈多樣性，這與研究者選擇的試驗品種不同有關(guān)，由于品種間差異造成了結(jié)論各異。因此，有必要針對紅掌不同品種進行離體組織培養(yǎng)與植株再生技術(shù)的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種脫分化、再分化及增殖培養(yǎng)效率高，適用于現(xiàn)行紅掌盆栽品種離體組織形成再生植株的培養(yǎng)方法，能快速大量繁殖優(yōu)良紅掌盆栽品種。實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)`方案是提供一種紅掌盆栽品種的離體組織培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
1、外植體選擇:取展葉5 10d的葉片、未展開葉的葉柄、初花5 8 d的花序、佛焰苞片、以及側(cè)芽為外植體材料，用洗液洗凈材料表面，流水下沖洗30 50 min，取出后晾干；
2、外植體滅菌:將清洗過的葉片、葉柄和佛焰苞片外植體材料，用質(zhì)量濃度為0.05%
0.1%的HgCl2處理3 IOmin ;將清洗過的花序和側(cè)芽外植體材料，先經(jīng)體積濃度為70% 75%的酒精處理10 20s，再用質(zhì)量濃度為0.05% 0.1%的HgCl2處理6 12 min,無菌水沖洗5 6次；
3、初代培養(yǎng):將滅菌后的外植體材料接種于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度22 26°C，光照12 14 h/d，光強1500 2000 lx，經(jīng)40 60 d后形成具有分化能力的愈傷組織；
4、愈傷組織繼代與不定芽分化培養(yǎng):將步驟3中得到的愈傷組織，繼代培養(yǎng)I 2次后，每次為25 30 d，愈傷組織分化產(chǎn)生不定芽；
5、試管苗的增殖培養(yǎng):以2 4芽帶愈傷組織的不定芽叢，接種至試管苗增殖培養(yǎng)基，30 40 d后，試管苗生長良好，株高達到2 4cm，并伴有少量氣生根產(chǎn)生，平均每次繼代I瓶可轉(zhuǎn)接3 4瓶；
6、生根培養(yǎng):將株高3 cm以上、具3 4葉的試管苗，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，25 30 d后獲得完整根系的再生植株。用于葉片愈傷組織誘導(dǎo)時，步驟3所述的培養(yǎng)基包括:基本培養(yǎng)基1/2MS+0.5
5.0 mg/L的玉米素+0.1 1.0 mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸+質(zhì)量濃度為2 3%的鹿糖，pH為5.6 5.8。用于葉柄愈傷組織誘導(dǎo)時，步驟3所述的培養(yǎng)基包括:基本培養(yǎng)基1/2MS+0.5 6.0 mg/L的噻苯隆+0.1 1.0 mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸+質(zhì)量濃度為2 3%的鹿糖，pH為5.6 5.8。步驟5所述的試管苗增殖培養(yǎng)基包括:基本培養(yǎng)基1/2 MS+0.5 3.0 mg/L的6-芐基腺嘌呤+0.1 1.0 mg/L的α -萘乙酸+100 150 mg/L的水解酪蛋白+質(zhì)量濃度為2 3%的蔗糖，pH為5.6 5.8。步驟6所述的生根培養(yǎng)基包括:基本培養(yǎng)基1/2 MS+ 0.1 1.0 mg/L的α -萘乙酸+300 1000 mg/L的活性炭，pH為5.6 5.8。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明技術(shù)通過誘導(dǎo)葉片、葉柄等脫分化形成愈傷組織，進而誘導(dǎo)分化不定芽叢的途徑，高效穩(wěn)定地獲得再生植株，實現(xiàn)了優(yōu)良紅掌盆栽品種的快速大量繁殖，并針對不同品種的特點，篩選了合適的外植體材料及其培養(yǎng)基條件。本發(fā)明的效果主要體現(xiàn)在脫分化、再分化及增殖培養(yǎng)的高效率上，適用于現(xiàn)行優(yōu)良紅掌盆栽品種。具體表現(xiàn)為脫分化出愈率高，最高可達94.12% ;不定芽分化率高，最高可達86.67% ;不定芽分化數(shù)多，每塊愈傷組織最多可分化18.2個，一般都可達到4 8個；增殖培養(yǎng)的繁殖系數(shù)可達3 5 ;試管苗成活率可達95%以上。因此，在優(yōu)良紅掌盆栽品種的組培快繁中具有良好應(yīng)用價值。
具體實施例方式實施例1:
選取紅掌盆栽品種展葉5 d的葉片、未展開葉的葉柄為外植體，用洗液洗凈材料表面，流水下沖洗30 50 min，取出后晾干；將清洗過的葉片、葉柄，用質(zhì)量濃度為0.05% 0.1%的HgCl2處理3 lOmin，無菌水沖洗5 6次。在超凈工作臺內(nèi)，將葉片外植體接種于培養(yǎng)基1/2 MS+ TDZ 2.0 mg/L+ 2，4-D 0.2 mg/L+3%蔗糖，葉柄外植體接種于培養(yǎng)基1/2 MS+TDZ 4.0 mg/L+ 2，4-D 0.2 mg/L+3% 蔗糖；光照 12 h/d，光強 2000 lx。培養(yǎng) 30 d 后，葉柄切口兩端膨大，產(chǎn)生黃綠色愈傷組織，出愈率為41.67%，繼續(xù)培養(yǎng)60 d后，平均每塊愈傷組織分化不定芽數(shù)為5 ;葉片培養(yǎng)50 d后產(chǎn)生愈傷組織，切口邊緣產(chǎn)生黃綠色愈傷組織，出愈率達到90%，繼續(xù)培養(yǎng)60 d后，平均每塊愈傷組織分化不定芽數(shù)為18.2個。當(dāng)不定芽叢苗高2 3 cm時，轉(zhuǎn)入試管苗繼代培養(yǎng)基1/2 MS+ 6-BA 1.0 mg/L+ NAA 0.3 mg/L +CH 100mg/L+2%蔗糖，45 60 d后，試管苗繁殖系數(shù)達到14 ;生根培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.lmg/L+活性炭500mg/L，生根率為100%。實施例2:
選取紅掌盆栽品種展葉5 d的葉片、未展開葉的葉柄為外植體，用洗液洗凈材料表面，流水下沖洗30 50 min，取出后晾干；將清洗過的葉片、葉柄，用質(zhì)量濃度為0.05% 0.1%的HgCl2處理3 lOmin，無菌水沖洗5 6次。在超凈工作臺內(nèi)，將葉片、葉柄外植體接種于培養(yǎng)基 1/2MS+ TDZ 4.0 mg/L+ 2, 4-D 0.2 mg/L+3%蔗糖，光照 12 h/d，光強 2000 lx。培養(yǎng)30 d后，葉柄切口兩端膨大，產(chǎn)生黃綠色愈傷組織，出愈率為87.5%，繼續(xù)培養(yǎng)60 d后，平均每塊愈傷組織分化不定芽數(shù)為12。葉片在培養(yǎng)50 d后產(chǎn)生愈傷組織，切口邊緣產(chǎn)生黃綠色愈傷組織，出愈率達到80%，繼續(xù)培養(yǎng)60 d后，平均每塊愈傷組織分化不定芽數(shù)為2.4。在繼代培養(yǎng)過程中，以2-4芽帶愈傷組織的外植體，轉(zhuǎn)入試管苗繼代培養(yǎng)基1/2 MS+ 6-BA1.0 mg/L+ IBA 0.3mg/L +CH 100 mg/L+2% 蔗糖，45 60 d 后，增殖系數(shù)為 14.4，生根培養(yǎng)基為 1/2 MS+NAA 0.lmg/L+ 活性炭 300 mg/L,生根率為 96%。實施例3:
選取紅掌盆栽品種展葉8 d的葉片、未展開葉的葉柄為外植體，用洗液洗凈材料表面，流水下沖洗30 50 min，取出后晾干；將清洗過的葉片、葉柄，用質(zhì)量濃度為0.05% 0.1%的HgCl2處理3 lOmin，無菌水沖洗5 6次。將葉片、葉柄外植體接種于培養(yǎng)基1/2 MS+ZT 2.0 mg/L+ 2，4-D 0.2 mg/L+3% 蔗糖，光照 12 h/d，光強 2000 lx。培養(yǎng) 30 d 后，葉柄切口兩端膨大，產(chǎn)生黃綠色愈傷組織，出愈率為45.83%，葉片在培養(yǎng)50 d后產(chǎn)生愈傷組織，切口邊緣產(chǎn)生黃綠色愈傷組織，出愈率達到59.34%。繼續(xù)培養(yǎng)60 d，葉片外植體再分化不定芽，平均每塊愈傷組織分化不定芽數(shù)為2.6，葉柄無不定芽分化。試管苗繼代培養(yǎng)基1/2MS+ 6-BA 1.0 mg/L+ NAA 0.3 mg/L +YE 50mg/L+2% 蔗糖，45 60 d 繼代一后，增殖系數(shù)為8。生根培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.lmg/L+活性炭500 mg/L，生根率為100%。實施例4:
選取紅掌盆栽品種展葉8 d的葉片、未展開葉的葉柄為外植體，用洗液洗凈材料表面，流水下沖洗30 50 min，取出后晾干；將清洗過的葉片、葉柄，用質(zhì)量濃度為0.05% 0.1%的HgCl2處理3 lOmin，無菌水沖洗5 6次。將葉片外植體接種于上述培養(yǎng)基1/2 MS+ZT 2.0 mg/L+ 2，4-D 0.2 mg/L+3%蔗糖+PVP 300 mg/L，葉柄外植體接種于培養(yǎng)基 1/2 MS+TDZ 2.0 mg/L+ 2, 4-D 0.2 mg/L+3% 蔗糖，光照 12 h/d，光強 2000 lx。培養(yǎng) 30 d 后，葉柄切口兩端膨大，產(chǎn)生黃綠 色愈傷組織，出愈率為50%，繼續(xù)培養(yǎng)愈傷組織無不定芽分化。葉片在培養(yǎng)50 d后產(chǎn)生愈傷組織，切口邊緣產(chǎn)生黃綠色愈傷組織，出愈率為79.63%。繼續(xù)培養(yǎng)60 d后，葉片產(chǎn)生的愈傷組織分化不定芽，平均每塊愈傷組織分化不定芽數(shù)為5.4個。試管苗增殖階段選用培養(yǎng)基 1/2 MS+ 6-BA 1.0mg/L+ NAA 0.5mg/L +CH 100 mg/L+2% 蔗糖，45 60 d后，增值系數(shù)為10。生根培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.lmg/L+活性炭1000 mg/L,生根率為100%。
權(quán)利要求
1.紅掌盆栽品種的離體組織培養(yǎng)方法，其特征在于包括如下步驟: 1)外植體選擇:取展葉5 10d的葉片、未展開葉的葉柄、初花5 8 d的花序、佛焰苞片、以及側(cè)芽為外植體材料，用洗液洗凈材料表面，流水下沖洗30 50 min，取出后晾干; 2)外植體滅菌:將清洗過的葉片、葉柄和佛焰苞片外植體材料，用質(zhì)量濃度為0.05% 0.1%的HgCl2處理3 IOmin ;將清洗過的花序和側(cè)芽外植體材料，先經(jīng)體積濃度為70% 75%的酒精處理10 20s，再用質(zhì)量濃度為0.05% 0.1%的HgCl2處理6 12 min,無菌水沖洗5 6次； 3)初代培養(yǎng):將滅菌后的外植體材料接種于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度22 26°C，光照12 14 h/d，光強1500 2000 lx，經(jīng)40 60 d后形成具有分化能力的愈傷組織； 4)愈傷組織繼代與不定芽分化培養(yǎng):將步驟3中得到的愈傷組織，繼代培養(yǎng)I 2次后，每次為25 30 d，愈傷組織分化產(chǎn)生不定芽； 5)試管苗的增殖培養(yǎng):以2 4芽帶愈傷組織的不定芽叢，接種至試管苗增殖培養(yǎng)基，30 40 d后，試管苗生長良好，株高達到2 4cm，并伴有少量氣生根產(chǎn)生，平均每次繼代I瓶可轉(zhuǎn)接3 4瓶； 6)生根培養(yǎng):將株高3cm 以上、具3 4葉的試管苗，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，25 30 d后獲得完整根系的再生植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的紅掌盆栽品種的離體組織培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟3所述的培養(yǎng)基，用于葉片愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基包括:基本培養(yǎng)基1/2MS+0.5 5.0 mg/L的玉米素+0.1 1.0 mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸+質(zhì)量濃度為2 3%的蔗糖，pH為5.6 ~ 5.8o
3.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的紅掌盆栽品種的離體組織培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟3所述的培養(yǎng)基，用于葉柄愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基包括:基本培養(yǎng)基1/2 MS+0.5 6.0 mg/L的噻苯隆+0.1 1.0 mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸+質(zhì)量濃度為2 3%的蔗糖，pH為5.6 ~ 5.8o
4.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的紅掌盆栽品種的離體組織培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟5所述的試管苗增殖培養(yǎng)基包括:基本培養(yǎng)基1/2 MS+0.5 3.0 mg/L的6-芐基腺嘌呤+0.1 1.0 mg/L的α -萘乙酸+100 150 mg/L的水解酪蛋白+質(zhì)量濃度為2 3%的蔗糖，pH 為 5.6 5.8。
5.根據(jù)權(quán)利要求書I所述的紅掌盆栽品種的離體組織培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟6所述的生根培養(yǎng)基包括:基本培養(yǎng)基1/2 MS+ 0.1 1.0 mg/L的α -萘乙酸+300 1000mg/L的活性炭，pH為5.6 5.8。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種紅掌盆栽品種的離體組織培養(yǎng)方法。以葉片、葉柄、花序、佛焰苞片或側(cè)芽為外植體材料，經(jīng)過滅菌處理后，接種到合適培養(yǎng)基上，培養(yǎng)40～60d后脫分化形成愈傷組織，出愈率可達87.5%；繼續(xù)培養(yǎng)40～60d后再分化形成不定芽，分化率高達94.12%；經(jīng)增殖培養(yǎng)可大量快繁試管苗，待試管苗生長一定高度后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，生根后移栽成活率可達95%以上。采用本發(fā)明的組織離體培養(yǎng)技術(shù)，經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)不定芽途徑，可高效穩(wěn)定地獲得再生植株，實現(xiàn)紅掌盆栽品種的快速大量繁殖，并針對紅掌不同品種的特點，篩選了合適的外植體材料及培養(yǎng)基條件，在優(yōu)良紅掌品種的種苗生產(chǎn)中具有極高應(yīng)用用價值。
文檔編號A01H4/00GK103181326SQ201310123009
公開日2013年7月3日 申請日期2013年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月10日
發(fā)明者談建中, 周麗麗, 張樹初, 鄭必平, 王晶, 閆俊芳, 牛瑞鶴, 陳馳 申請人:蘇州大學(xué)