專利名稱：岷江百合抗真菌基因Lr14-3-3及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學以及基因工程相關技術研究領域，特別是一種岷江百合的具有抗真菌活性的14-3-3蛋白基因Lrl4-3-3及應用。
背景技術：
植物病害是農業生產中一個非常棘手的問題，特別是真菌病害，由其引起的病害約占植物總病害的80%，不僅造成作物產量的巨大損失，還嚴重影響糧食及其他食品的品質。控制植物真菌病害傳播的方法主要是依靠培育抗性品種和化學農藥，或者是采取輪作等耕作制度。雖然也取得了一定成效，但是也存在嚴重的弊端，如使用起來費時費力、周期長、化學農藥殘留高、危害人畜健康且易對環境造成污染等，所以傳統病害防治方法不能從根本上解決病害問題。隨著重組DNA技術的創立和發展，利用轉基因技術培育植物新品種來應對真菌病害已取得初步成效，是一種可以徹底解決真菌病害的育種新方法。當植物受到病 原菌攻擊或處于其他逆境脅迫時，植物會產生復雜的生物化學和生理學上的響應，如植物感受逆境信號后通過信號轉導過程隨后調節細胞內抗逆相關蛋白基因的表達。作為真核生物中普遍存在的一類信號調控因子，14-3-3與植物的防衛反應密切相關。14-3-3是一類序列高度保守的蛋白，在大多數物種中由一個基因家族編碼。現已確定植物中14-3-3的靶蛋白超過300種，暗示其參與多種信號傳導途徑和植物的生理過程。14-3-3廣泛參與細胞生長分化、細胞周期和凋亡的調控、信號轉導和遷移等生理生化過程。此外，14-3-3與能量代謝的關鍵酶結合，從而調控其代謝過程；14-3-3還通過結合質膜H+-ATPase來控制物質的跨膜運輸過程。14-3-3蛋白的氨基酸序列在物種種間和種內都高度保守，每個14-3-3蛋白均由3部分組成:特定的氨基末端，高度保守的核心區域和特定的羧基末端。根據同工型核心區域高度保守的氨基酸序列將植物14-3-3S分為e和非e兩大類。14-3-3蛋白結合靶蛋白的保守結構域有2種:RSXpSXP (mode I)和RXY/FXpSXP (mode II)，pS為磷酸絲氨酸(Ottmann C,Marco S，Jaspert N,Marcon C，Schauer N,Weyand M，Vandermeeren C，Duby G，Boutry M,Wittinghofer A，et al.Structure of a 14—3—3 Coordinated Hexamer of thePlant Plasma Membrane H+-ATPase by Combining X-Ray Crystallography and ElectronCryomicroscopy.Molecular Cell，2007，25: 427 - 440)。14-3-3 蛋白可以通過與蛋白相互作用，或者結合靶蛋白的磷酸絲氨酸/磷酸蘇氨酸來實現其調控功能(Li XY DhaubhadelS.Soybean 14—3—3 gene family:1denti cation and molecular Characterization.Planta，2011，233: 569 - 582)。近年來的研究顯示14-3-3能參與植物對病害的防御。如14-3-3入表達下調的擬南芥植株對白粉病菌感染的抗性減弱，而的超表達能夠增加其抗性，并引起植物超敏反應，14-3-3通過與水楊酸信號通路中的RPW8.2蛋白(一種R基因產物)相互作用增強對白粉病真菌的抗性。(Yang X,ffang ff,Coleman M,Orgil U,Feng J,Ma X,Ferl R,TurnerJG, Xiao S.Arabidopsis 14—3—3 lambda is a positive regulator of RPW8-mediateddisease resistance.Plant J, 2009,60: 539 - 550)。分布于胞外空間的 14-3-3 也參與對病害的防御，如在雨生紅球藻(ococctts pluvial is")的細胞壁和小麥aestira )幼苗根的細胞壁中都能檢測到 14-3-3 (Wang SB, Hu Q, Sommerfeld M, Chen F.Cell wall proteomics of the green alga Haematococcus pluvial is (Chlorophyceae).Proteomics,2004,4: 692 - 708 ；Kong FJ,Oyanagi A,Komatsu S.Cell wall proteome ofwheat roots under flooding stress using gel-based and LC MS/MS-based proteomicsapproaches.Biochim Biophys Acta, 2010,1804: 124 - 136)。將豌豆sativum
Linn)根尖與R18肽(能與14_3_3受體特異結合，從而去除14_3_3受體)同時處理，根腐病的發生增強，降低了根對病原真菌血紅叢赤殼(Afectra的抗性(Wen F,
VanEtten HD, Tsaprailis G, Hawes MC.Extracellular proteins in pea root tip andborder cell exudates.Plant Physiol, 2007,143:773 - 783)。在豌豆和玉米(Zea中利用免疫突光方法(Immunofluorescence, IF)將制備的抗體與擬南芥14_3_3相互作用，在根邊緣細胞檢測到胞外熒光，暗示14-3-3可協助細胞外的蛋白質參與植物應對病原菌的入侵。14-3-3還能響應番爺潰瘍性病菌syringae pv的效應毒性蛋白，從而參與番茄中PTO (—種R基因的產物)介導的程序化細胞凋亡(programmedcell death,PCD) (Konagaya K,Kasahara YMM,Nyunoya H.Members of 14-3-3 proteinisoforms interacting with the resistance gene product N and the elicitor ofTobacco mosaic virus.J Gen Plant Pathol, 2004,70: 221 - 231)。促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)途徑參與植物對生物脅迫的防御反應，且能正調節程序性細胞凋亡以應對A syringae0感染A 的番爺細胞中14-3-3 (77T7)與番茄MAPKKK蛋白激酶和其下游激酶MAPKK存在相互作用(Oh CSjPedleyKF,Martin GB.Tomato 14—3—3 protein 7 positively regulates immunity-associatedprogrammed cell death by enhancing protein abundance and signaling ability ofMAPKKK {alpha}.Plant Cell, 2010, 22: 260 - 272)。14-3-3 蛋白在穩定 MAPKKK 蛋白的過程中起作用，因而它可以激活下游MAPK級聯導致PCD。下游激酶MAPKK的突變體與14_3_3結合能力降低卻仍然能夠有效誘導PCD，可見PCD的誘導不依賴于14-3-3與MAPKK的結合，而是14-3-3在胞內可以把MAPKKK a和MAPKK聯系在一起。本發明的14-3-3蛋白基因來自ill民江百合(Zi7iw Wilson)。山民江百合又名王百合，多年生草本植物，是我國的百合特有種。僅分布于四川西岷江流域海拔800 2700m的河谷到山腰的巖石縫中，具有極強的抗真菌、抗病毒等特性，是百合抗病育種的優良種質資源。

發明內容
本發明的目的是提供一種從岷江百合中克隆獲得具有抗真菌活性的14-3-3蛋白的全長基因Lr 14-3-3，抗真菌基因Lr 14-3-3的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，該基因全長1067bp，包含一個780bp的開放讀碼框，54bp的5’非翻譯區及233bp的3’非翻譯區，編碼如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白質。

本發明中抗真菌基因的編碼區是序列表SEQ ID NO:1中第55_834位所示的核苷酸序列。本發明分離克隆岷江百合的一個抗真菌相關基因的完整cDNA片段，利用根癌農桿菌介導法將目的基因轉入受體植物中并過量表達，通過進一步實驗驗證該基因是否具有抗真菌的活性，為后期利用該基因改良煙草以及其他植物抵御真菌病害的能力奠定基礎，發明人將這個基因命名為。14-3-3是真核生物中的一類信號調控因子，在植物抗病防衛反應中起重要作用，植物14-3-3通過調節關鍵的生理過程以應對不斷變化的外部環境，14-3-3廣泛參與細胞生長分化、細胞周期和凋亡的調控、信號轉導和遷移等生理生化過程；此外，14-3-3與參與能量代謝的關鍵酶結合，從而調控其代謝過程，如14-3-3通過調節硝酸還原酶、蔗糖磷酸合酶、海藻糖-6磷酸合酶、甘油三磷酸脫氫酶、谷氨酰胺合成酶等碳、氮代謝關鍵酶的活性參與植物碳、氮代謝途徑等，采取蛋白與蛋白的直接作用方式調節靶蛋白參與的一系列生理活動，在植物抵抗病原真菌入侵及其它氧化脅迫過程中起重要作用。本發明涉及分離包含的DNA片段并鑒定其功能，具有該基因片段的植物在一定程度上具有抵抗特定真菌侵染的表型，其中所述DNA片段如序列表SEQ ID:1所不。對該基因進行序列分析，表明Lrl4_3_3全長序列為1067bp,包含一個780bp的開放閱讀框(Open reading frame, ORF), 54bp 的 5，非翻譯區(untranslated region, UTR)以及233bp的3’ UTR，編碼259個氨基酸。Lrl4_3_3編碼蛋白具有14_3_3蛋白的保守結構域，Lrl4-3-3 與麝香百合(Zi7iw 1ngiflorimd 14-3-3 (AAF05737)的同源性為 99%，與來自擬南芥 )、棉花(Gossypium hirsutum)、水稻)、煙草{NiCo tiana a t tenua 乙e )、油菜(Brass!ca campes tri51)、番方ti {Lycopersicon esculen turn )以及其它物種的14-3-3蛋白高度相似，表明其屬于岷江百合中的14-3-3，超量表達序列表SEQ ID:2所示序列可以增強煙草對葡萄座腔菌、擬莖點霉屬真菌、尖孢鐮刀菌、交鏈孢菌的抗性。本發明另一目的是將岷江百合抗真菌基因Lrl4-3_3應用在提高煙草對葡萄座腔菌、擬莖點霉屬真菌、尖孢鐮刀菌、交鏈孢菌抗性中，具體操作如下:
(1)采用擴增的特異引物，從接種尖孢鐮刀菌后的岷江百合根中提取總RNA，通過RT-PCR擴增出的全長編碼區，然后將其連接到pMD_18T載體上，經測序獲得具有目的基因的克隆；
(2)用限制性內切酶I和&oRI酶切pMD-18T-Zr7￥-J-J載體，通過膠回收得到目的基因片段，用同樣的內切酶對植物表達載體pCAMBIA2300s進行酶切，膠回收獲得所需載體大片段；將所獲得基因片段與pCAMBIA2300s載體大片段連接，構建植物超表達載體，之后將所構建的重組載體通過根癌農桿菌介導轉入煙草中表達；
(3)以重組載體T-DNA上具有的抗性標記篩選轉化子，并通過聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)以及 RT-PCR (Reverse Transcription-PCR)方法得到真正的轉基因植株，分析轉基因植物蛋白對真菌生長的抑制作用，最后篩選出對真菌抗性明顯增強的轉基因植株。本發明為提高植物對真菌病害的抗性提供了一種新的方法，通過基因工程手段培育抗病植物能克服傳統育種的不足，不僅育種周 期縮短，而且操作簡單，容易獲得高抗材料。本發明來自岷江百合的基因能增強植物對真菌的抗性，將該基因導入煙草中，可以產生具有真菌抗性的新品種和新材料；利用基因工程技術減少真菌帶來的病害具有明顯的優勢和不可取代的重要性；它可以為大規模生產作物、花卉等提供方便，大量減少化學農藥的使用，還可以為農業生產節約成本、減小環境污染且提高管理水平，因此本發明具有廣闊的市場應用前景。


圖1是本發明中部分轉基因煙草基因組DNA的PCR檢測結果示意圖，其中=Marker是DL2000 DNA Marker (大連寶生物)，由 2，OOObp、1，000bp、750bp、500bp、250bp 以及 IOObp六條DNA片段組成；正對照是質粒pMD-18T-Zr7￥-J-J為模板的PCR反應；WT是非轉基因煙草(野生型)總DNA為模板進行的PCR ；
圖2是本發明中部分陽性轉基因煙草中轉錄水平的表達分析結果示意圖，其中:Marker是DL2000 DNA Marker (大連寶生物);WT是非轉基因煙草總RNA逆轉錄cDNA為模板的PCR產物；正對照是質粒pMD-18T-Zr7￥-J-J為模板的PCR產物；
圖3是本發明中轉基因煙草體外抗真菌活性的抑菌效果示意圖，其中:a、b、c、d圖示中的真菌分別是葡萄座腔菌、擬莖點霉屬真菌、尖孢鐮刀菌、交鏈孢菌;WT為野生型煙草的總蛋白；CK為空白對照，即用于提取蛋白的緩沖液。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明作進一步詳細說明，但本發明的內容并不局限于此，本實施例中方法如無特殊說明的均按常規方法操作，所用試劑如無特殊說明的采用常規試劑或按常規方法配置的試劑。實施例1全長基因克隆以及序列分析
用尖孢鐮刀菌接種岷江百合，取接種24 h后的根提取總RNA，用液氮將處理過的岷江百合的根研磨成粉末，轉 入離心管中，采用異硫氰酸胍法提取總RNA ;采用逆轉錄酶M-MLV(promega)以總RNA為模板合成cDNA第一鏈，反應體系和操作過程為:取5 u g TotalRNA，依次加入50 ng oligo (dT)、DEPC水至反應體積為12.5 U L ;混勻后，70°C加熱變性5min后迅速在冰上冷卻5min,然后依次加入4 u L 5 XFirst-stand buffer、2 u L dNTP(2.5mM each)、0.5 u L RNasin (200 U)、l u L M-MLV (200 U)，混勻并短時離心，42。〇溫浴1.5 h，取出后70 °C加熱10 min，終止反應。cDNA第一鏈合成后置于-20 °C保存備用。以合成的第一鏈cDNA為模板，擴增目的基因Lr 14-3-3，所用上下游引物序列分別為 5，CTGCAGTCCTCGCTCCTATCTAGGTTTCACC3，、5，GAATTCAGCCACACAATAGGTTT GCTGAGC3，；米用 Advantage 2 PCR Enzyme (Clontech)擴增出目的基因，PCR 反應條件:95°C Imin ；95°C 30s, 64 °C 30s, 72°C 70s，30 個循環；72°C 2min。反應體系(20 y L)為 2 u L cDNA、
2u L 10XAdvantage 2 PCR Buffer、0.5 u L 50X dNTP Mix (IOmM each)、0.2 u L 正向引物(10 u M)、0.2 u L 反向引物(10 u M)、0.2 U L Advantage 2 PCR Polymerase Mix、14.9UL PCR-Grade water。PCR結束之后取5 U L進行瓊脂糖凝膠電泳，用于檢測擴增產物的特異性以及大小。PCR產物只有一條DNA帶，故直接對PCR產物進行TA克隆，使用的試劑盒為PMD18-T vector kit (大連寶生物)，反應體系和操作過程為:取1.5 u L PCR產物，依次加A I U L pMD18_T vector (50 ng/ u L)和 2.5 u L 2XLigation solution I，混勻置于
16V過夜反應。采用熱激轉化法將連接產物轉入大腸桿菌DH5 a中。使用含有氨芐青霉素(ampicillin, Amp)的LB固體培養基篩選陽性克隆。挑選若干個單菌落，搖菌后用擴增Lr 14-3-3的特異引物鑒定出多克隆位點插入的克隆。將所鑒定的克隆進行測序，最終獲得的^^"以_^>_^>全長。0嫩為 1067匕口,通過1'031 ORF finder (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析發現其包含一個780bp的開放讀碼框(見序列表),Zr7編碼一個含259個氨基酸的蛋白質Lrl4-3-3，其分子量約為29.03KDa，等電點為4.79，含有2個半胱氨酸殘基(C),位于第103和198位，因此單體蛋白可能形成一個Cysl03-Cysl98 二硫鍵，借助生物信息學軟件SignalP 4.1分析編碼的蛋白序列，檢測其是否具有N端信號肽。結果表明在該蛋白中沒有檢測到信號肽的存在。實施例2:植物表達載體構建
采用SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒(上海生工)從大腸桿菌中提取插入Lr 14-3-3的質粒pMD-18T-Zr7￥-J-J以及植物表達載體pCAMBIA2300s的質粒，取I y L用于瓊脂糖凝膠電泳以檢測所提取質粒的完整性和濃度高低。用限制性內切酶&…工(TaKaRa)和 At I (TaKaRa)分別對質粒 pMD-18T_Zr7^-J-J 和 pCAMBIA2300s 進行雙酶切(100 U L體系)，反應體系和操作過程為:取20 u L pMD-18T-Zr7￥-J-J和pCAMBIA2300s質粒、依次加入 10 u L 10XH buffer,5 u L BcoRl,5 M L Pst 1、60 u L ddH20，混勻后短時離心，置于37°C過夜反應；將所有酶切產物點于瓊脂糖凝膠中進行電泳，販％ Lr 14-3-3片段和pCAMBIA2300s大片段分別進行膠回收，整個過程使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工)。取I UL回收產物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測回收片段的大小以及濃度，置于-20°C保存備用。利用T4 DNA Ligase (TaKaRa)，將回收的 Zr7￥UDNA 片段和 pCAMBIA2300s 載體片段連接起來，反應體系(20 u L)和操作過程為:取10 uL Lrl4-3~3mk片段依次加入
2uL pCAMBIA2300s 載體 DNA、2 u L 10XT4 DNA Ligase BufferU u L T4 DNA Ligase,
5uL ddH20，混勻后短時離心，然后置于16°C水浴過夜反應。接著采用熱激轉化法將連接產物轉入大腸桿菌DH5 a中，用含有50 mg/L卡那霉素(kanamycin, Km)的固體培養基篩選陽性克隆。挑選單菌落搖菌，以菌液為模板用擴增的特異引物進行PCR，挑選出Lrl4-3-3與pCAMBIA2300s成功連接的克隆，所檢測的菌株若為陽性，加入甘油并置于-80°C保存備用。采用SanPrep柱式質粒抽提試劑盒(上海生工)提取并純化上述大腸桿菌中的pCAMBIA2300s-Zr7￥-J-J質粒，隨后用液氮凍融法將上述構建的植物表達載體pCAMBIA2300s-Zri^-J-J轉入所制備的根癌農桿菌LBA4404感受態細胞中，操作步驟為:取
0.2 ii g pCAMBIA2300s-Zr7￥-J-J質粒加入含有200 U L感受態細胞的離心管中，輕輕混勻后冰浴5 min,接著轉入液氮中冷凍I min,然后迅速置于37°C水浴5 min,之后立即冰浴2min，加入800 u L LB液體培養基，28°C振蕩培養4 h。將活化后的農桿菌涂于含有50 mg/L Km的LB固體培養基上，28°C靜止培養。挑選單菌落搖菌，用擴增的特異性引物進行PCR，檢測pCAMBIA2300s-Zr7￥-J-J是否轉入農桿菌中。對于陽性克隆，加入甘油后置于-80°C保存備用。實施例3:農桿菌介導的植物遺傳轉化以及轉基因植物篩選本實驗的轉基因受體是煙草OVico(ia/ a tabacum L.),將煙草種子用75%的酒精浸泡30s,用無菌水洗漆后用0.1%的HgCl2浸泡8 min,然后再用無菌水洗漆若干次,播種于1/2MS培養基上，28°C暗培養5-8 d，發芽后轉至光照培養箱(25°C，16h/d光照)，以后每月用MS
培養基繼代一次。從_80°C冰箱中取出保存的含有pCAMBIA2300s-Zr7￥-J-J質粒的農桿菌LBA4404菌種，接種于5 mL含有50 mg/L Km和20 mg/L利福平的LB液體培養基中，28°C培養至培養基渾濁。吸取I mL渾濁的菌液涂布于含有50 mg/L Km的LB固體培養基上，28°C培養48ho將LB固體培養基上的農桿菌刮下適量接種于附加有20 mg/L的乙酰丁香酮的MGL液體培養基中，28°C振蕩培養2-3 h以活化農桿菌。取煙草無菌苗葉子切成I cm2左右的葉盤，完全浸泡于上述含有活化農桿菌的MGL液體培養基中，浸染時間為15 min，用無菌濾紙吸干葉盤表面的菌液，將葉盤置于共培養基上進行室溫培養，煙草轉化的共培養基為MS+0.02 mg/L 6-BA+2.1 mg/L NAA+30 g/Lsucrose+6 g/L瓊脂,22°C無光條件下共培養2 d。將共培養后的葉盤轉到加有抗生素的MS篩選培養基中分化成苗，同時篩選轉基因植株。煙草篩選培 養基為 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L sucrose+6 g/L 瓊脂+50 mg/L Km+200 mg/L 頭抱霉素(cefotaxime sodium salt, Cef);篩選培養時將培養瓶轉移至光照培養箱培養(25°C，16h/d光照，8h/d黑暗)，出芽后用含有50 mg/L Km和200mg/L Cef的MS培養基繼代培養，將煙草再生苗移至含有50 mg/L Km的MS培養基上使其生根，最后選用生根較好的再生苗做進一步的檢測。采用CTAB法提取轉基因煙草植株葉片的基因組DNA，將提取的基因組DNA取IU L通過瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性和濃度；以轉基因植株的基因組DNA為模板用擴增Lrl4-3-3的特異引物進行PCR，PCR結束后，取8 u L產物用于瓊脂糖凝膠電泳以檢測陽性轉基因植株，部分煙草轉基因植株的擴增結果如圖1所示，轉基因煙草共篩選到25株陽性轉基因植株。實施例4 'Lr 14-3-3表達分析以及轉基因植株抗真菌活性分析
取陽性轉基因單株以及非轉基因煙草(野生型)的嫩葉提取總RNA，逆轉錄生成cDNA第一鏈，并以此為模板用擴增的特異引物進行PCR，根據PCR結果分析各轉基因單株中Lr 14-3-3轉錄水平的表達。總RNA提取以及RT-PCR的方法與步驟與實施例1中相同，PCR結束后，取5 UL用于瓊脂糖凝膠電泳，部分單株的檢測結果如圖2所示，共檢測到17株轉基因單株中在轉錄水平有表達，這些單株的編號為I 17。將實驗室保存的幾種病原真菌接種于PDA固體培養基(200 g/L馬鈴薯，15 g/L瓊脂，20 g/L葡萄糖)上，28°C暗培養，待菌落生長至直徑為2 3cm時添加蛋白，分析轉基因植株體外抗真菌活性，供試真菌共有5種:葡萄座腔菌(SotmspAaeria t/o(Aiofea),尖孢鍵刀菌(/^saria 擬莖點霉屬真菌sp.),交鏈抱菌 C47temariasp.),灰葡萄抱菌cinerea\為了防止其它雜菌污染所提取的蛋白，整個植物蛋白提取過程均是無菌操作，首先取I g轉基因煙草單株(編號分別為1、2、5、7、10)或野生型葉片放入研缽中，加入I mL蛋白提取液(I M NaCl, 0.1 M乙酸鈉，1% PVP，pH6)，充分研磨。轉入1.5 mL離心管中，混勻后4°C靜置過夜。4°C離心30 min (12,000 g/min)，取上清于新的1.5 mL離心管中，并取適量用紫外分光光度儀測定總蛋白濃度。將轉基因和野生型植株的總蛋白濃度調整至0.2 Ug/yL，然后分別取20 UL滴于各真菌培養基的無菌濾紙上。在每個真菌的平板上除了添加不同轉基因煙草植株的總蛋白，同時平行添加野生型煙草的總蛋白和空白對照(CK，提取蛋白所用的溶液)。28°C培養幾天后觀察各處理抑菌真菌生長的情況，并據此來評取Lrl4-3-3轉基因煙草的體外抗真菌活性，結果如圖3 WHLrl4-3-3轉基因煙草蛋白對葡萄座腔菌、 擬莖點霉屬真菌的生長具有很強的抑制作用，對交鏈孢菌、尖孢鐮刀菌也有明顯的抑制活性。
權利要求
1.一種岷江百合抗真菌基因其特征在于:所述抗真菌基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，該基因全長1067bp，包含一個780bp的開放讀碼框，54bp的5’非翻譯區及233bp的3’非翻譯區，編碼如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的岷江百合抗真菌基因其特征在于:抗真菌基因Lr 14-3-3的編碼區是序列表SEQ ID NO:1中第55-834位所示的核苷酸序列。
3.權利要求1或2所述的岷江百合抗真菌基因在提高煙草對葡萄座腔菌、擬莖點霉屬真菌、尖孢鐮刀菌、交鏈孢菌抗性中的應用。
4.根據權利要求3所述的岷江百合抗真菌基因的應用，其特征在于提高煙草的真菌抗性的具體操作如下: (1)將上述抗真菌基因與植物表達載體pCAMBIA2300s連接，構建植物超表達載體； (2)將上述構建的重組載體通過根癌農桿菌介導轉入目標植物中； (3)以重組載體T-DNA上具有的抗性標記篩選轉化子，并通過聚合酶鏈式反應獲得真正的轉基因植株，分析轉基因植 物蛋白對真菌生長的抑制作用，最后篩選出對真菌抗性明顯增強的轉基因植株。
全文摘要
本發明公開了一種具有抗真菌活性的岷江百合基因Lr14-3-3，該Lr14-3-3基因核苷酸序列如SEQIDNO1所示，編碼14-3-3蛋白，本發明通過功能基因組學相關技術證實Lr14-3-3基因具有提高植物抗真菌的功能，將本發明抗真菌Lr14-3-3基因構建到植物表達載體上并轉入煙草中過量表達，轉基因煙草植株具有很強的體外抗真菌活性，表達Lr14-3-3的轉基因煙草對葡萄座腔菌、擬莖點霉屬真菌、尖孢鐮刀菌、交鏈孢菌的生長具有明顯的抑制作用。
文檔編號A01H5/00GK103194456SQ20131014390
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月24日 優先權日2013年4月24日
發明者劉迪秋, 李紅麗, 何華, 張南南, 葛鋒, 陳朝銀 申請人:昆明理工大學