水稻轉錄因子Os01g36630基因CDS序列的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及水稻轉錄因子Os01g36630基因CDS序列的應用，其是利用轉錄因子激活基序VP64與水稻轉錄因子Os01g36630融合構建得到組成型轉錄因子，并將編碼所述組成型轉錄因子的基因轉化到農作物如水稻中，從而改良水稻籽粒性狀，例如增加水稻籽粒長度。對于詳細闡明調控種子發育機理具有重要的理論價值，并且可以通過轉基因手段，改良水稻的粒型，因此在生產實踐中也具有重要意義。
【專利說明】水稻轉錄因子0s01g36630基因 CDS序列的應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程領域，具體地說，涉及水稻轉錄因子0s01g36630基因⑶S序 列的應用。

【背景技術】
[0002] 水稻（Oryza sativa L.)是我國和全世界最重要的三大糧食作物之一，是世界一 半以上人口的主食，也是一個重要的功能基因研究的模式植物。與其相關的遺傳學和分子 生物學研究一直倍受研究者的重視，轉錄水平的調控是基因表達調控的重要方式。當前水 稻增產的研究較依賴于有限的水稻種質資源，傳統的雜交育種優勢正在逐漸減弱，而水稻 轉基因技術有可能發掘水稻進一步增產的潛力。
[0003] 在植物界中，能形成種子的植物約占植物總數的三分之二以上，作為重要的繁殖 器官，種子同時也為人們提供食物來源，水稻就是其中的重要代表，種子來源于受精后的胚 珠。從分子生物學的角度來說，種子的發育和萌發是一個有次序的、選擇性的基因表達過 程。而轉錄因子在基因表達的精確調控中起到了關鍵性的作用。
[0004] 禾谷類作物的產量很大程度上取決于其籽粒的大小，因此水稻籽粒性狀的基因調 控是重要的研究領域。Jumonji(JMJ)家族轉錄因子主要調控組蛋白的甲基化，組蛋白修飾 酶，包括組蛋白去乙?；福℉istone deacetylases，HDACs),組蛋白甲基轉移酶（Histone methyltransferases，HMTs),以及組蛋白去甲基化酶（Histonedemethylase，HDMs)等，在 動植物發育過程中發揮著重要的作用。然而在單子葉植物模式物種水稻中，對這些修飾酶 的功能研究還相對較少。植物中第一個報道的具有去甲基化酶活性的jmjC家族基因是 IBMlQncrease in BONSAI methylation，JMJ25)。通過篩選 EMS 誘變的突變體庫，檢測可 以使BNS (BONSAI)基因的DNA甲基化升高的突變體，Saze等克隆了一個含有jmjc結構域的 基因 IBMl，其突變失活后引起多種表型，包括葉片卷曲變小，植株矮小，種子發育異常等，還 引起BNS基因 DNA甲基化增加，另外還證實IBMl可執行H3K9去甲基化酶的功能（Saze H， Shiraishl A,Miura A,Kakutanl T. (2008)Control of genic DNA methylation by ajmjC domain-containing protein in Arabidopsis thaliana. Science.)〇
[0005] 組蛋白賴氨酸甲基化是一個重要的表觀遺傳修飾，即可以激活也可以抑制相關基 因的表達。研究表明，在植物以外的模式系統中，含有Jumonji C(jmjC)結構域的蛋白可以 去除組蛋白甲基化。中國學者證明了在植物里含有jmjC結構域的蛋白與哺乳動物的同源 蛋白相比在功能上既有保守性也有特異性。特別是屬于JMJD2家族的水稻jmjC基因 JMJ706 編碼了一個異染色質富集蛋白。JMJ706蛋白能夠在體外特異的去除組蛋白H3K9的二甲基 化和三甲基化。功能缺失突變體表現為H3K9的二甲基化和三甲基化增加，并影響了小穗發 育，同時伴有花器官形態和數目的改變?；虮磉_及組蛋白修飾分析實驗證明了 JMJ706蛋 白調控一小組花發育調節基因。綜合實驗結果，表明水稻中JMJ706基因編碼一個異染色質 相關的H3K9去甲基化酶，并在水稻花發育過程中起調控作用（Qianwen Sun and Dao-Xiu Zhou. (2008)Rice jmjC domain-containing gene JMJ706encodes H3K9demethyIase required for floral organ development. PNAS.XJMJ706 為定位在異染色質區域的核蛋 白，其突變后引起水稻花器官發育異常并導致H3K9me2及me3甲基化修飾程度積累。JMJ706 全長cDNA互補轉化其突變體jmj6后，轉基因植株花發育異常的表型得以恢復：amiRNA抑 制野生型JMJ706基因后，可產生類似jmj6的表型(孫前文.（2009)水稻組蛋白末端修飾 酶基因的功能研究，華南農業大學博士論文)。JMJ家族的另外一個基因 JMJ703,是水稻中 一種活性H3K4特異性去甲基酶，能特異的降低組蛋白H3K4的甲基化水平，參與控制轉座子 的活性。JMJ703功能喪失性突變體具有多種表型，表現為植株矮化，倒一、二、三節間明顯 比野生型短，葉片直立，二級枝梗減少，突變體種子長、寬以及厚度都減少（Xiekui Cui. et al. (2013)Control of transposon activity by a histone H3K4demethylase in rice. Proc Natl Acad Sci USA)?？傊?，控制水稻籽粒發育是一個復雜過程，涉及到多基因多條 途徑的協調控制，目前發現調控該性狀的基因不多，調控籽粒發育的分子機理尚未闡明，因 此，尋找控制籽粒性狀發育的基因和新的發掘手段對作物改良并提高作物產量具有重要意 義。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的是提供水稻轉錄因子0s01g36630基因⑶S序列的應用。
[0007] 為了實現本發明目的，本發明首先提供一種組成型水稻轉錄因子，即融合蛋白 (VP16) 4-Linker-0s01g36630。
[0008] 其中，VP16為來自單純皰疹病毒的VP16蛋白，將4個VP16功能域基序融合在一起 可構成一類增強子，增強轉錄因子的功能，從而在轉基因植株中出現更明顯的表型變化。上 述融合蛋白中涉及的（VP16) 4，即VP64是由4個VP16蛋白的氨基酸序列以Gly-Ser為間隔 形成的融合蛋白，其氨基酸序列和核苷酸序列分別如SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 4所示。
[0009] 上述融合蛋白中涉及的Linker由39個柔性氨基酸串聯而成，其氨基酸序列如SEQ ID No. 9所示，編碼該Linker的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
[0010] 上述融合蛋白中涉及的0s01g36630為水稻轉錄因子0s01g36630,其氨基酸序列 如SEQ ID No. 2所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能 的氨基酸序列；水稻轉錄因子0s01g36630基因的⑶S序列為：SEQ ID No. 1所示的核苷酸 序列。
[0011] 本發明還提供編碼所述組成型水稻轉錄因子的基因，以及在嚴格條件下，可與該 基因的核苷酸序列發生雜交的核苷酸序列。
[0012] 本發明還提供含有編碼所述組成型水稻轉錄因子的基因的載體、工程菌及細胞 系。
[0013] 所述載體的構建方法如下：
[0014] (1)在植物轉錄因子數據庫（http://rice, plantbiology. msu. edu/analyses_ search_locus. shtml)中找到0s01g36630基因，根據其序列設計PCR擴增引物對，其為正向 引物F :5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCGATGCGGGAGITT-3' 和反向引物 R :5' -CAAGAAAGCTGGGTC CTATCTATCAGAGAGAGCA-3' 。
[0015] (2)以野生日本晴'kitaake'水稻總cDNA為模板，利用上述引物F和R進行PCR， 獲得0s01g36630基因完整的CDS序列。
[0016] (3)將上述PCR產物克隆到pDONER克隆載體上，經測序鑒定得到與目的基因完全 相同的序列。
[0017] (4)以植物雙元表達載體pCambial301_UbiN (圖6)左右邊界包含的序列為骨架 序列，通過體外重組，將ubi promoter-VP64-Gateway表達單兀、35S promoter-asRED表達 單元和35S promoter-hyg表達單元與之融合構建，得到載體nVP64-hyg-asRED的全序列如 SEQ ID No. 5 所示。
[0018] (5)通過LR反應將0s01g36630基因的CDS序列構建到其目的基因的5'端連有 VP64編碼基因的植物表達載體nVP64-hyg-asRED上，獲得攜帶有編碼所述組成型水稻轉錄 因子 VP64-Linker-0s01g36630 基因的表達載體 ubi :VP64-0s01g36630,其全序列如 SEQ ID No. 6所示。
[0019] 上述表達載體可通過使用Ti質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、微注射、電穿 孔等常規生物技術方法導入植物細胞中（Weissbach，1998, Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第 411-463 頁；Geiserson 和 Corey，1998, Plant Molecular Biology,2nd Edition)。
[0020] 本發明還提供一種轉基因水稻植株的構建方法，具體為：采用農桿菌介導的方法， 將上述表達載體轉入水稻愈傷組織中，用含誘導劑和農桿菌的AAM培養液進行轉化，轉化 后的材料經過共培養-篩選-分化-生根-轉基因苗的鍛煉和移栽，篩選轉基因水稻植株。
[0021] 本發明還提供編碼所述組成型水稻轉錄因子的基因在改良水稻籽粒性狀(例如增 加水稻粒長及千粒重）中的應用。
[0022] 本發明還提供了用于擴增水稻轉錄因子0s01g36630基因⑶S序列的引物對，包括 正向引物 F : 5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCGATGCGGGAGITT-3' 和反向引物 R : 5' -CAAGAAAGCTG GGTCCTATCTATCAGAGAGAGCA-3' 。
[0023] 本發明進一步提供水稻轉錄因子0s01g36630基因⑶S序列在調控水稻籽粒性狀 中的應用。利用轉錄因子激活基序VP64(SEQ ID No. 10)與水稻轉錄因子0s01g36630融合 構建得到組成型轉錄因子，并將編碼所述組成型轉錄因子的基因轉化到農作物如水稻中， 從而改良轉基因水稻籽粒的性狀。
[0024] 前述的應用，是將水稻轉錄因子0s01g36630基因的⑶S序列構建到轉錄因子激活 基序VP64編碼基因 （SEQ ID No. 4)的下游，轉化水稻，從而改良轉基因水稻籽粒的性狀。優 選將水稻轉錄因子0s01g36630基因的CDS序列通過Gateway系統轉錄因子激活基序VP64 編碼基因的下游。
[0025] 本發明首次利用轉錄因子激活基序VP64 (即4個轉錄因子激活基序VP16)與水稻 轉錄因子0s01g36630融合構建得到組成型轉錄因子，并將編碼所述組成型轉錄因子的基 因轉化到農作物如水稻中，從而改良水稻籽粒性狀，例如水稻籽粒長度的增加。對于詳細闡 明調控種子發育機理具有重要的理論價值，并且可以通過轉基因手段，改良水稻的粒型，因 此在生產實踐中也具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為本發明實施例1中nVP64-hyg_asRED載體圖譜。
[0027] 圖2為本發明實施例1中ubi :VP64-0s01g36630載體圖譜。
[0028] 圖3為本發明實施例3中PCR檢測VP64_0s01g36630轉基因陽性株系，其中WT為 野生型水稻 'kitaake'，NV0584H-27、NV0584H-29 為 VP64-0s01g36630 轉基因水稻株系。
[0029] 圖4為本發明實施例4中轉基因水稻籽粒性狀的表型長度的比較；其中WT為野生 型水稻 'kitaake'，NV0584H-27、NV0584H-29 為 VP64-0s01g36630 轉基因水稻株系。
[0030] 圖5為本發明實施例4中轉基因水稻籽粒性狀的數據統計分析結果；其中WT為野 生型水稻 'kitaake'，NV0584H-27、NV0584H-29 為 VP64-0s01g36630 轉基因水稻株系。
[0031] 圖6為本發明實施例1中pCambial301_UbiN載體圖譜。

【具體實施方式】
[0032] 以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例 中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。
[0033] 實施例1
[0034] 0s01g36630基因⑶S序列的獲得及植物表達載體的構建
[0035] 10s01g36630基因 CDS序列的獲得
[0036] 在植物轉錄因子數據庫（http://rice. plantbiology. msu. edu/analyses_ search_locus. shtml)中找到0s01g36630基因，根據其序列設計PCR擴增引物，正向引物 F :5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCGATGCGGGAGTTT-3' 和反向引物 R :5' -CAAGAAAGCTGGGTCCTAT CTATCAGAGAGAGCA-3'。以野生型日本晴'kitaake'水稻總cDNA為模板，利用引物F和R進 行PCR，獲得0s01g36630基因完整的CDS序列（如SEQ ID No. 1所示)。
[0037] 2植物表達載體的構建
[0038] 將水稻轉錄因子0s01g36630基因的CDS序列通過Gateway系統構建到4個轉錄 因子激活基序VP16編碼基因（如SEQ ID No. 4所示）的下游。
[0039] 2. 1將上述PCR產物克隆到pDONER克隆載體上
[0040] 按照PrimeSTAR聚合酶擴增體系和反應程序進行PCR。此過程中包含兩輪 PCR，第一輪PCR的引物用加部分adaptor attB接頭的基因引物（F和R)，而第二輪的 模板用第一輪的PCR產物，并且引物用完整的adaptor attB引物（attB5' adaptor : 5'-GTGGGGACAAGTTTG TACAAAAAAGCAGGCTTC-3'，attB3' adaptor :5'-GTGGGGACCAC TTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3'）。將 PCR 產物克隆到 pDONER 克隆載體(購自 Invitrogen)上， 經測序鑒定得到與目的基因完全相同的序列。
[0041] 2. 2植物表達載體的構建
[0042] 以植物雙元表達載體pCambial301_UbiN (圖6)左右邊界包含的序列為骨架序列， 通過體外重組，將ubi promoter-VP64-Gateway表達單兀、35S promoter-asRED表達單兀和 35S promoter-hyg表達單元與之融合構建，得到載體nVP64_hyg_asRED的全序列如SEQ ID No. 5所示，載體圖譜見圖1。
[0043] 表達載體nVP64-hyg_asRED含有Gateway重組系統，pDONR帶有目的基因的質粒 作為入門載體（Entery vector),通過LR反應可完成目的基因表達載體的構建。
[0044] 通過LR反應將0s05g27980基因的CDS序列構建到其目的基因的5'端連有VP64 編碼基因的植物表達載體nVP64-hyg-asRED上，獲得攜帶有編碼所述組成型水稻轉錄因 子 VP64-Linker-0s05g27980 基因的表達載體 ubi :VP64-0s05g27980,其全序列如 SEQ ID No. 6所示，載體圖譜見圖2。
[0045] LR反應體系如下：
[0046] 表達載體 lyl(30-50ng)
[0047] 入門載體（pDONR-gene) 1 μ I (30_50ng)
[0048] LR Clonase Enzyme Mix I μ I
[0049] ddH20 2 μ I
[0050] 總體積 5μ I
[0051] 于25°C反應過夜。用反應體系轉化大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆。
[0052] 實施例2轉基因水稻植株的獲得
[0053] 取水稻'kitaake'成熟種子，人工或機械脫殼，挑選飽滿光潔無菌斑的種子經消毒 之后接種到誘導培養基上進行誘導培養。選擇外觀良好，生長力好的水稻愈傷組織為受體 材料，采用農桿菌介導法將ubi :VP64-0s01g36630轉入水稻愈傷組織中，用含有100 μ M的 乙酰丁香酮和OD值為0. 7的農桿菌的AAM培養液進行轉化，將轉化液浸泡過的愈傷組織置 于共培養基上進行共培養，25°C暗培養3d后置于篩選培養基上培養約30d，每IOd繼代一 次。然后將篩出的抗性愈傷轉移到分化培養基上分化約20d，每IOd繼代一次。將分化出綠 色小苗的抗性愈傷轉移到生根培養基上生根，待約7d長出發達根系后煉苗，并計算轉化所 獲轉基因苗數。煉苗7d后轉移至大田生長。獲得30株轉基因苗。
[0054] 本實施例中涉及的培養基配方如下：
[0055] 誘導培養基：N6大量+B5微量+NB有機+鐵鹽+銅鈷母液+2. 5mg/L2, 4D+0. 6g/L 酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L鹿糖，以水配制，調pH至5. 8? 5. 9后加入植物凝膠4g/L。
[0056] 共培養基：N6大量+B5微量+NB有機+鐵鹽+2. 5mg/L2, 4D+0. 5g/L谷氨酰胺 +0. 6g/L酸水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L鹿糖，以水配制，調pH至5. 2后加入植物凝膠 4g/L。滅菌后，50°C左右加入AS (乙酰丁香酮）100?200yg/mL。
[0057] 篩選培養基：N6大量+B5微量+NB有機+鐵鹽+銅鈷母液+2. 5mg/L2, 4D+0. 6g/L 酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L鹿糖，以水配制，調pH至5. 8? 5. 9后加入植物凝膠4g/L。滅菌后加入35mg/L潮霉素(購自上海紐津生物技術有限公司）。
[0058] 分化培養基：MS無機+MS-B5微量+MS有機+鐵鹽+MS-銅鈷母液+0. 05mg/L NAA+2. Omg/L Kinetin (激動素）+30g/L山梨醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L鹿糖，以水配制， 調pH至5. 8?5. 9后加入植物凝膠4g/L。
[0059] 實施例3轉基因陽性株系的鑒定
[0060] 為檢測實施例2獲得的VP64-0s01g36630轉基因水稻株系中ubi : VP64-0s01g36630基因在T2代轉基因水稻（NV0584H-27、NV0584H-29)中的過表達情況，本 實施例在載體與目的基因接頭處設計引物（正向引物：5' -GTGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAG GCTTC-3' 和反向引物：5'-GTGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3'）進行 PCR 檢測，得到了 明顯的特異性條帶。由圖3可見，擴增出的條帶大小在IOOObp以上，且引物是在載體與目 的基因接頭處設計的，擴增出的片段大小與目的基因（1188bp)基本一致。因此可以說明， 實施例2獲得的轉基因水稻株系NV0584H-27、NV0584H-29中含有VP64-0s01g36630融合基 因。
[0061] 實施例4轉基因水稻表型分析和考種分析
[0062] 將實施例2獲得的轉基因水稻株系NV0584H-27、NV0584H-29和野生型水稻種子進 行比較，從表型上可以明顯的看出，發現轉基因材料的籽粒明顯變長（圖4)?？挤N數據分析 表明（圖5)，本發明獲得的VP64-0s01g36630轉基因水稻籽粒的粒長顯著大于野生型水稻 籽粒。
[0063] 雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在 本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
【權利要求】
1. 一種組成型水稻轉錄因子，其特征在于，其為融合蛋白（VP16)4~Linker-〇s01g36630 ； 其中，VP16為來自單純皰疹病毒的VP16蛋白，（VP16)4是由4個VP16蛋白的氨基酸 序列以Gly-Ser為間隔形成的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No. 10所示；Linker由39 個柔性氨基酸串聯而成，其氨基酸序列如SEQ ID No. 9所示；0s01g36630為水稻轉錄因子 0s01g36630,其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個 氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2. 編碼權利要求1所述組成型水稻轉錄因子的基因。
3. 含有權利要求2所述基因的載體。
4. 含有權利要求2所述基因的工程菌。
5. -種轉基因水稻植株的構建方法，其特征在于，采用農桿菌介導的方法，將權利要求 3所述的載體轉入水稻愈傷組織中，用含誘導劑和農桿菌的AAM培養液進行轉化，轉化后的 材料經過共培養-篩選-分化-生根-轉基因苗的鍛煉和移栽，篩選轉基因水稻植株。
6. 權利要求2所述的基因在改良水稻籽粒性狀中的應用。
7. 用于擴增水稻轉錄因子0s01g36630基因CDS序列的引物對，其特征在于， 包括正向引物 F :5'-CAAAAAAGCAGGCTTCATGTC GATGCGGGAGITT-3' 和反向引物 R : 5'-CAAGAAAGCTGGGTCC TATCTATCAGAGAGAGCA-3' ； 其中，水稻轉錄因子0s01g36630基因的⑶S序列為： SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
8. 水稻轉錄因子0s01g36630基因CDS序列在調控水稻籽粒性狀中的應用。
9. 根據權利要求8所述的應用，其特征在于，其是利用轉錄因子激活基序VP64與水稻 轉錄因子0s01g36630融合構建得到組成型轉錄因子，并將編碼所述組成型轉錄因子的基 因轉化水稻，從而改良轉基因水稻籽粒的性狀； 其中，所述轉錄因子激活基序VP64的氨基酸序列如SEQ ID No. 10所示。
10. 根據權利要求8所述的應用，其特征在于，其是將水稻轉錄因子0s01g36630基因 的⑶S序列通過Gateway系統構建到轉錄因子激活基序VP64編碼基因的下游，轉化水稻， 從而改良轉基因水稻籽粒的性狀； 其中，所述轉錄因子激活基序VP64編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。
【文檔編號】A01H5/00GK104371023SQ201310351663
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年8月13日 優先權日:2013年8月13日
【發明者】劉斌, 張宮璞, 劉軍, 趙濤, 李宏宇, 林辰濤 申請人:中國農業科學院作物科學研究所