一種辣椒花藥直接獲得植株的培養方法和培養基的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種辣椒花藥直接獲得植株的培養方法和培養基，屬于植物細胞工程【技術領域】。所述培養方法包括：(1)、選取小孢子處于單核靠邊期的花蕾；(2)、花蕾用70％酒精浸泡0.5～1分鐘，12‰的氯化汞8～15分鐘，無菌水沖洗3～5次，無菌濾紙吸干水分，得到單核靠邊期的無菌花藥；(3)、將單核靠邊期的無菌花藥漂浮于液體培養基中，黑暗震蕩培養20～25天后轉為光照震蕩培養；(4)、光照震蕩培養10～20天后，將形成的子葉型胚轉至MSO固體培養基中培養，長成正常植株。本發明的培養方法具有以下優點：(1)、大大提高正常胚狀體的誘導頻率，顯著提高正常植株的再生頻率；(2)、操作過程簡單，能夠直接由自由散落于液體培養基的小孢子獲得植株；(3)、適用于牛角椒、羊角椒、線椒、燈籠椒等多種類型的辣椒。
【專利說明】一種辣椒花藥直接獲得植株的培養方法和培養基
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物細胞工程【技術領域】，具體涉及一種辣椒花藥直接獲得植株的培養方法和培養基。
【背景技術】
[0002]盡管通過常規的花藥培養，不少辣椒品種已獲得了 DH植株，但是總體來說誘導頻率還很低。所以如果能通過游離小孢子培養的方法獲得大量胚狀體，進而誘導發育成正常的再生植株，再通過人工加倍的方法獲得DH植株，這將會大大提高育種效率。但是，要使目前的游離小孢子培養技術成為常規雜交育種手段的一部分，仍然存在很多問題，阻礙了其應用于大規模育種；其中最凸顯的兩個問題是:
[0003](I)、辣椒的小孢子胚誘導頻率仍然處于較低水平。
[0004]如何提高辣椒的小孢子胚誘導頻率，基因型被普遍認為是最重要的影響因素之一。小孢子的胚狀體誘導頻率因基因型不同而差異很大。Kim(2008年)將游離小孢子進行碳源饑餓培養，雖然獲得了較高的胚狀體誘導頻率，但是只限于一個辣椒品種“Milyang-jare”。Koleva-Gudeva (2009年)等對21個不同基因型的辣椒進行花藥培養，只有12個基因型誘導出胚狀體。Nowaczyk等(200 9年)在19個辣椒品種中只有6個基因型得到胚狀體，且誘導頻率都較低。為了提高胚狀體的誘導頻率，Ge’mes Juha’sz等(2009年)嘗試了不同基因型的辣椒和甜椒，并在小孢子誘導時期，加入麥芽糖以及與小麥的子房共培養，對于胚的誘導在數量及質量上都有促進作用。Lantos等(2009年)則是先饑餓培養花藥，再游離小孢子，并與小麥或辣椒子房共培養來提高胚狀體誘導頻率。以上這些方法雖然一定程度上對小孢子胚狀體誘導頻率略有提高，但是畸形胚的比例并未減少，且方法繁瑣，并不實用。因此建立一個誘導方法簡單又具有較高胚狀體誘導頻率的辣椒小孢子培養體系成為當務之急。
[0005](2)、辣椒小孢子胚不能夠正常發育，再生植株中正常植株的比例較低。
[0006]如何提高正常胚和正常再生植株的比例是辣椒花藥和花粉培養中的另一重要問題。辣椒小孢子培養中，畸形胚的發生率較高，并存在球形胚發育停滯現象。在胚的發育過程中，從球形胚過渡到心形胚、子葉胚時，在解剖學及功能上都會出現不同程度的畸形，這是雄核發育過程中一個很突出的問題。目前，國際上運用較廣泛的方法是Supena在2006年報道的固-液體雙層培養法，但是利用該方法所獲得的胚狀體中，只有20%是正常胚，30%沒有子葉及莖尖，50%只發育出幼根，平均一個花蕾只獲得0.1棵植株(一個辣椒花蕾一般有6個花藥)。Kim等(2008)、李春玲等(2008)和Parra-Vega等(2010)在辣椒游離小孢子培養過程中，都發現存在不能進一步發育成苗的球狀胚和心形胚，以及大量無子葉或者無生長點的畸形胚的現象，且各種畸形胚比例高于正常胚。因此，如何降低胚狀體誘導過程中畸形胚的比例成為當今辣椒單倍體育種中的一個重要課題。

【發明內容】
[0007]本發明的目的在于公開了一種辣椒花藥直接獲得植株的培養方法。
[0008]本發明的另一個目的在于公開了上述培養方法中培養無菌花藥的培養基。
[0009]本發明的目的是通過以下技術方案實現的:
[0010]一種辣椒花藥直接獲得植株的培養方法，包括下述步驟:
[0011](I)、將單核靠邊期的無菌花藥漂浮于液體培養基中，黑暗震蕩培養，20~25天后轉為光照震蕩培養；所述液體培養基的組成為:2500mg / L KN03、1025mg / L ΝΗ4Ν03、295mg / L CaCl2.2H20、325mg / L MgSO4.7H20、145mg / L KH2PO4,67mg / L(NH4)2SO4,75mg / L NaH2PO4.H2OUOOmg / L Ca (NO3) 2.4Η20、13mg / L KCl、13.9mg / L FeSO4.7Η20、18.65mg / L Na2.EDTA、0.695mg / L K1、3.15mg / L H3BO3,22.13mg / L MnSO4.H2O、3.625mg / L ZnSO4.7Η20、0.188mg / L Na2MoO4.2Η20、0.016mg / L CuSO4.5Η20、0.016mg /L CoCl2 *6H20> IOOmg / L 肌醇、5mg / L 煙酸、2mg / L 甘氨酸、0.5mg / L 鹽酸硫氨素(維生素Bl)、0.5mg / L鹽酸批卩多醇(維生素B6)、0.5mg/L葉酸、0.05mg / L生物素、800mg /L 谷氨酰胺、IOOmg / L 絲氨酸、30mg / L 谷胱甘肽(GSH)、0.1mg / L BA、0.1mg / L ΙΑΑ、
0.0lmg / L NAA,0.1%活性炭和6%蔗糖(即液體培養基是由Rm培養基的大量元素、Cm培養基的微量元素與鐵鹽、NLN培養基的有機成分、0.1mg / L BA、0.1mg / L ΙΑΑ、0.0lmg /L NAA、0.1 %活性炭和6%蔗糖組成，其中0.1 %活性炭和6%蔗糖是指IOOOml培養基中加入Ig活性炭和60g鹿糖)；
[0012](2)、光照震蕩培養10~20天后，將形成的子葉型胚轉至MSO固體培養基中培養，長成正常植株。
[0013]上述技術方案所述的一種辣椒花藥直接獲得植株的培養方法，其中，在所述方法之前還包括下述步驟:
[0014]⑴、選取小孢子處于單核靠邊期的花蕾；
[0015](ii)、花蕾用70%酒精浸泡0.5~I分鐘，1%。~2%。的氯化汞8~15分鐘，無菌水沖洗3~5次，無菌濾紙吸干水分，得到單核靠邊期的無菌花藥。
[0016]上述技術方案所述的一種辣椒花藥直接獲得植株的培養方法，其中，將單核靠邊期的無菌花藥漂浮于液體培養基中的接種密度為5ml液體培養基中接種15~25個花藥。
[0017]上述技術方案所述的一種辣椒花藥直接獲得植株的培養方法，其中，處于單核靠邊期的花蕾是通過DAPI染色確定。
[0018]上述技術方案所述的一種辣椒花藥直接獲得植株的培養方法，其中，黑暗震蕩培養和光照震蕩培養時的搖床轉速為40轉 /分。
[0019]為了避免液體培養基在培養過程中因水分蒸發而改變滲透壓，因此在上述技術方案的基礎上，黑暗震蕩培養和光照震蕩培養中，每隔7~10天補足液體培養基至初始量。
[0020]上述技術方案所述培養方法中培養無菌花藥的培養基，其中，所述液體培養基的組成為:2500mg / L KN03、1025mg / L NH4N03、295mg / L CaCl2.2H20、325mg / LMgSO4.7H20、145mg / L KH2PO4,67mg / L (NH4) 2S04、75mg / L NaH2PO4.H2O、IOOmg / LCa(NO3)2.4Η20、13mg / L KCl、13.9mg / L FeSO4.7Η20、18.65mg / L Na2.EDTA、0.695mg /L KI,3.15mg / L H3BO3,22.13mg / L MnSO4.H20,3.625mg / L ZnSO4.7H20、0.188mg /LNa2MoO4.2Η20、0.016mg / L CuSO4.5Η20、0.016mg / L CoCl2.6Η20、IOOmg / L 肌醇、5mg /L煙酸、2mg / L甘氨酸、0.5mg / L鹽酸硫氨素(維生素BI)、0.5mg / L鹽酸批卩多醇(維生素B6)、0.5mg / L葉酸、0.05mg / L生物素、800mg / L谷氨酰胺、IOOmg / L絲氨酸、30mg / L 谷胱甘肽(GSH) ,0.1mg / L BA,0.1mg / L IAA,0.0lmg / L NAA,0.1% 活性炭和6%鹿糖(即液體培養基是由Rm培養基的大量兀素、Cm培養基的微量兀素與鐵鹽、NLN培養基的有機成分、0.1mg / L BA、0.1mg / L ΙΑΑ、0.0lmg / L ΝΑΑ、0.I %活性炭和 6%鹿糖組成，其中0.1 %活性炭和6%蔗糖是指IOOOml培養基中加入Ig活性炭和60g蔗糖)。
[0021]本發明具有以下有益效果:
[0022]1、本發明的培養方法在前期采用了黑暗震蕩培養，黑暗的環境有利于正常初胚的形成，同時震蕩培養不僅有利于提高小孢子的釋放率還能提高液體培養基的溶氧率，同時還能讓釋放出來的小孢子均勻地分布在液體培養基中，這些因素使正常胚狀體的誘導頻率大大提高，因而正常植株的再生頻率也有顯著提高；
[0023]2、本發明的培養方法操作簡單，能夠直接由自由散落于液體培養基的小孢子獲得植株；
[0024]3、采用本發明的培養方法獲得的胚狀體及正常植株比例較高。
【具體實施方式】:
[0025]為使本發明的技術方案便于理解，以下結合具體試驗例對本發明一種辣椒花藥直接獲得植株的培養方法作進一步的說明。
[0026]實施例1:羊角型辣椒小孢子培養:
[0027]2012年6月從種植大棚取回花蕾，花粉經DAPI (4，6_聯脒_2_苯基吲哚)染色確認發育時期為單核靠邊期，花蕾的表面消毒是指經75 %酒精60秒，2%。升汞10分鐘，無菌水沖洗5次。
[0028]小心將花藥用小鑷子取出，置于液體培養基中進行25°C黑暗震蕩培養20-25天后轉為光照震蕩培養，黑暗震蕩培養和光照震蕩培養時的搖床轉速為40轉/分；該液體培養基的組成為:2500mg / L KN03、1025mg / L NH4N03、295mg / L CaCl2.2H20、325mg /L MgSO4.7H20、145mg / L KH2PO4,67mg / L (NH4) 2S04、75mg / L NaH2PO4.H2OUOOmg / LCa(NO3)2.4Η20、13mg / L KCl、13.9mg / L FeSO4.7Η20、18.65mg / L Na2.EDTA、0.695mg /L KI,3.15mg / L H3BO3,22.13mg / L MnSO4.H20,3.625mg / L ZnSO4.7H20、0.188mg / LNa2MoO4.2Η20、0.016mg / L CuSO4.5Η20、0.016mg / L CoCl2.6Η20、IOOmg / L 肌醇、5mg /L煙酸、2mg / L甘氨酸、0.5mg / L鹽酸硫氨素(維生素BI)、0.5mg / L鹽酸批卩多醇(維生素B6)、0.5mg / L葉酸、0.05mg / L生物素、800mg / L谷氨酰胺、IOOmg / L絲氨酸、30mg / L 谷胱甘肽(GSH) ,0.1mg / L BA,0.1mg / L IAA,0.0lmg / L NAA,0.1% 活性炭和6%鹿糖(即液體培養基是由Rm培養基的大量兀素、Cm培養基的微量兀素與鐵鹽、NLN培養基的有機成分、0.1mg / L BA、0.1mg / L ΙΑΑ、0.0lmg / L ΝΑΑ、0.I %活性炭和 6%鹿糖組成，其中0.1 %活性炭和6%蔗糖是指IOOOml培養基中加入Ig活性炭和60g蔗糖，液體培養基按照常規方法配制)；
[0029]黑暗震蕩培養20-25天，肉眼可見胚性細胞團；轉為光照震蕩培養10-20天，已有胚狀體產生。由于小孢子的誘導不同步，有些胚狀體已到魚雷期或是子葉期，還有些只是具有胚性結構的細胞團。挑出已分化出兩片小子葉的胚狀體轉至MSO培養基，15-20天生長為正常的小植株，繼而長成根系發達的正常完整植株，平均每20個花藥產生15個胚狀體，其中10個為正常胚狀體，正常胚狀體比例為67%，遠遠大于Supena在2006年報道的固液體雙層培養法中20%的比例。在本實施例的黑暗震蕩培養和光照震蕩培養中，每隔7-10天補足液體培養基至初始量。
[0030]以上所述，僅為本發明的較佳實施例，并非對本發明作任何形式上和實質上的限制，凡熟悉本專業的技術人員，在不脫離本發明技術方案范圍內，當可利用以上所揭示的技術內容，而作出的些許更動、修飾與演變的等同變化，均為本發明的等效實施例；同時，凡依據本發明的實質技術對以上實施例所作的任何等同變化的更動、修飾與演變，均仍屬于本發明的技術方案的范圍內。 ·
【權利要求】
1.一種辣椒花藥直接獲得植株的培養方法，包括下述步驟: (1)、將單核靠邊期的無菌花藥漂浮于液體培養基中，黑暗震蕩培養，20~25天后轉為光照震蕩培養；所述液體培養基的組成為:2500mg / L KN03、1025mg / L NH4NO3-295mg /L CaCl2.2H20、325mg / L MgSO4.7H20、145mg / L KH2PO4,67mg / L (NH4) 2S04、75mg /L NaH2PO4.H2OUOOmg / L Ca (NO3) 2.4H20、13mg / L KCl、13.9mg / L FeSO4.7H20、18.65mg / L Na2.EDTA、0.695mg / L K1、3.15mg / L H3BO3,22.13mg / L MnSO4.H2O、3.625mg / L ZnSO4.7Η20、0.188mg / L Na2MoO4.2Η20、0.016mg / L CuSO4.5Η20、0.016mg /L CoCl2.6H20> IOOmg / L 肌醇、5mg / L 煙酸、2mg / L 甘氨酸、0.5mg/L 鹽酸硫氨素(維生素Bl)、0.5mg / L鹽酸批卩多醇(維生素B6)、0.5mg/L葉酸、0.05mg / L生物素、800mg /L 谷氨酰胺、IOOmg / L 絲氨酸、30mg / L 谷胱甘肽(GSH)、0.1mg / L BA、0.1mg / L ΙΑΑ0.0lmg / L ΝΑΑ、0.I % 活性炭和 6% 鹿糖； (2)、光照震蕩培養10~20天后，將形成的子葉型胚轉至MSO固體培養基中培養，長成正常植株。
2.根據權利要求1所述的一種辣椒花藥直接獲得植株的培養方法，其特征在于，在所述方法之前還包括下述步驟: (i)、選取小孢子處于單核靠邊期的花蕾； (ii)、花蕾用70%酒精浸泡0.5~I分鐘，1%。~2%。的氯化汞8~15分鐘，無菌水沖洗3~5次，無菌濾紙吸干水分，得到單核靠邊期的無菌花藥。
3.根據權利要求1或2所述的一種辣椒花藥直接獲得植株的培養方法，其特征在于:將單核靠邊期的無菌花藥漂浮于液體培養基中的接種密度為5ml液體培養基中接種15~25個花藥。
4.根據權利要求1或2所述的一種辣椒花藥直接獲得植株的培養方法，其特征在于:處于單核靠邊期的花蕾是通過DAPI染色確定。
5.根據權利要求1或2所述的一種辣椒花藥直接獲得植株的培養方法，其特征在于:黑暗震蕩培養和光照震蕩培養時的搖床轉速為40轉/分。
6.根據權利要求1或2所述的一種辣椒花藥直接獲得植株的培養方法，其特征在于:黑暗震蕩培養和光照震蕩培養中，每隔7~10天補足液體培養基至初始量。
7.權利要求1~6中所述培養方法中培養無菌花藥的培養基，其特征在于:所述液體培養基的組成為:2500mg / L KN03、1025mg / L NH4N03、295mg / L CaCl2.2H20、325mg /L MgSO4.7H20、145mg / L KH2PO4,67mg / L (NH4) 2S04、75mg/L NaH2PO4.H2O、IOOmg / LCa(NO3)2.4Η20、13mg / L KCl、13.9mg / L FeSO4.7Η20、18.65mg / L Na2.EDTA、0.695mg /L KI,3.15mg / L H3BO3,22.13mg / L MnSO4.H20,3.625mg / L ZnSO4.7H20、0.188mg / LNa2MoO4.2Η20、0.016mg / L CuSO4.5Η20、0.016mg / L CoCl2.6Η20、IOOmg / L 肌醇、5mg /L煙酸、2mg / L甘氨酸、0.5mg / L鹽酸硫氨素(維生素BI)、0.5mg / L鹽酸批卩多醇(維生素 Β6)、0.5mg / L 葉酸、0.05mg / L 生物素、800mg / L谷氨酰胺、IOOmg / L 絲氨酸、30mg /L 谷胱甘肽(GSH)、0.Img / L BA,0.1mg / L IAA、0.01mg/LNAA、0.1%活性炭和 6%蔗糖。
【文檔編號】A01H4/00GK103444542SQ201310414689
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月13日 優先權日:2013年9月13日
【發明者】鄧曉梅, 李春玲, 張樹根, 張軍民, 張秦 申請人:北京海花生物科技有限公司, 北京市海淀區植物組織培養技術實驗室