一株防治獼猴桃潰瘍病的菌株及其制備方法
【專利摘要】一株防治獼猴桃潰瘍病的菌株及其制備方法，本發明屬于生物農藥【技術領域】，公開了一株楊凌青色鏈霉菌（Streptomyces?glaucus?sp.nov.yangling）TIASA5菌株，該菌株于2007年8月16日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.2132；本發明還公開了該菌株的分離與鑒定方法、菌劑的制備方法；還公開了TIASA5菌株菌劑在防治獼猴桃細菌性潰瘍病中的應用。本發明的TIASA5菌株具有穩定的天然原來來源，篩選方法簡單，制備簡單，操作方便，產品質量穩定，綠色環保，而且對防治獼猴桃細菌性潰瘍病效果顯著。
【專利說明】一株防治獼猴桃潰瘍病的菌株及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物農藥【技術領域】，具體涉及一種新的植物內生青色鏈霉菌及菌劑的制備方法和應用。【背景技術】
[0002]由丁香假單胞菌稱猴桃致病變種Pseudomonas syringae pv.actinidiae(即 PSA)引起的稱猴桃細菌性潰瘍病(Kiwifruit bacterial canker)危害嚴重,防治困難,不但嚴重阻礙了獼猴桃產業的可持續發展，而且明顯制約了我國獼猴桃花粉、水果的外貿出口，已成為目前獼猴桃生產中需要盡快解決的重大問題。目前對于獼猴桃細菌性潰瘍病的防治主要是采用以鏈霉素和銅制劑為主的藥劑防治。然而大量使用銅制劑和已經引起了潰瘍病菌的抗藥性問題，同時抗生素的大量使用所帶來的食品安全問題已經嚴重影響著潰瘍病的田間防治效果。因而尋找開發新型高效的生物農藥將對獼猴桃產業的穩定和發展帶來福音。
[0003]放線菌是一類重要的微生物資源，也是與人類有著密切關系且應用極為廣泛的一類微生物。目前應用在臨床和農業上的抗生素主要是由放線菌產生，其中70%的抗生素來自鏈霉菌。近年來研究海洋放線菌、極端環境放線菌和稀有放線菌是尋找新藥的集中目標，開發植物內生環境的放線菌資源也是人們研究的新領域。植物內生放線菌尤其是藥用植物內生放線菌作為尋找新的藥用活性代謝產物和防治植物病害的生防制劑資源極具開發潛力。利用這些植物內生菌資源，使之為農業生產服務將具有重要的理論意義和實際應用價值。

【發明內容】

[0004]鑒于現有技術的不足，本發明的目的旨在探尋生物農藥的新來源，利用藥用植物內生放線菌資源開發一種可以用于獼猴桃細菌性潰瘍病防治的新型生物殺菌劑。本發明提供了一種楊凌青色鏈霉菌(Streptomyces glaucus sp.nov.yangling)菌株以及該菌株分離、篩選、鑒定方法；進一步地，提供該菌株抗菌活性物質及其制備工藝，并且提供了該菌株菌劑防治獼猴桃細菌性潰瘍病的使用方法。
[0005]為了實現上述目的，本發明采用的技術方案如下:
[0006]楊凌青色鏈霉菌(Streptomycesglaucus sp.nov.yangling) TIASA5 菌株(以下簡稱為TIASA5菌株)，已于2007年8月16日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCCN0.2132。保藏期限為30年，30年內免費提供活菌。
[0007]需要說明的是，本發明TIASA5菌株的分離、篩選、鑒定方法包括如下步驟:
[0008](I)剪取采自陜西楊凌渭河河灘的健康野生黃花蒿的莖組織用清水洗凈后，進行表面消毒；
[0009](2)將表面消毒后的樣品材料用滅菌刀片切成0.2mm長的小段,置于高氏一號培養基平板上，28°C培養箱培養21天后，可分離到TIASA5菌株，于-80°C冰箱保存。[0010]需要進一步說明的是，所述的表面消毒的條件:樣品先用99%乙醇中浸lmin，然后在3.125%的NaClO中浸6min，再次放入99%乙醇中浸30sec，最后用無菌生理鹽水沖洗5次。
[0011]所述的高氏一號培養基每升含可溶性淀粉20g，KNO3 lg, K2HPO4 0.5g，MgSO4 5H200.5g, NaCl 0.5g, FeSO4 7H20 0.01g,瓊脂粉 13g, pH7.2-7.4。
[0012]本發明的TIASA5菌株經菌落培養特征、菌絲形態的顯微觀察、細胞化學分析、生理生化特性以及16s rDNA序列分析，該菌株鑒定為一個新菌株(TIASA5)具有以下特征:
[0013](I)菌落培養特征在高氏一號平板上菌落較小，菌落為圓形，凸起，孢子堆顏色為橄欖灰色，氣生菌絲發達，基內菌絲前期為白色，3-5d后呈絳紅色，在各培養基上都不產生可溶性色素；
[0014](2)菌絲和孢子形態特征:菌株的氣生菌 絲呈松散的螺旋狀，且表面有細長的毛發狀突起，孢子呈橢圓形，表面亦有毛發狀突起；
[0015](3)生理生化特性:能使石蕊牛奶變藍但不胨化，產淀粉酶能力強，能產生卵磷脂酶和纖維素酶，不產生蛋白酶，不產生硫化氫和黑色素，硝酸鹽反應陽性；菌株可以利用的碳源有葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、D-果糖、肌醇、甘露糖、山梨醇、羧甲基纖維素、半乳糖和棉籽糖，但是不利用甘油；該菌可以利用的氮源有甘氨酸、D, L-α-丙氨酸、L-賴氨酸、L-酪氨酸、L-胱氨酸、L-胍氨酸、尿素和L-天門冬氨酸，但不能利用馬尿酸鈉、L-色氨酸和D，L-酪氨酸；最適生長溫度為30°C，對pH不敏感；
[0016](4)細胞壁化學分析:經細胞壁氨基酸和糖分析，菌株細胞壁中含有L，L-DAP和甘氨酸等多種氨基酸，無特征性糖，屬于胞壁I型；
[0017](5) 16S rDNA序列分析:結果在GeneBank中進行最大同源性比較,發現16S rDNA測序結果與青色鏈霉菌16S rDNA同源性達到99.4%。
[0018]制備具有保藏編號為CGMCC N0.2132的TIASA5菌株菌劑的方法如下:
[0019]將在_80°C冰箱保存的TIASA5菌株接種在高氏一號培養基，于28°C培養5天后，用打孔器打成直徑為6mm的菌餅，將菌餅接入種子培養基中，于28°C，150rpm培養36小時后，按12%的接種量將種子液接入發酵培養基中，于30°C，180rpm發酵72小時，收集發酵液即為TIASA5菌株的菌劑。
[0020]進一步地，以本發明保藏編號為CGMCC N0.2132的TIASA5菌株為成分所制備的菌劑在防治獼猴桃細菌性潰瘍病中的應用。
[0021]本發明有益效果在于，具有穩定的天然原來來源，菌種來源于黃花蒿的莖組織，篩選方法簡單；發酵過程中所用原料主要有大豆粉和葡萄糖等，成本較低；菌劑制備簡單，操作方便，產品質量穩定，噴施方便，對農作物無藥害，綠色環保，防治獼猴桃細菌性潰瘍病效果顯著。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為本發明的菌絲形態及孢子形態特征圖；
[0023]圖2為本發明的TIASA5菌株菌劑對獼猴桃細菌性潰瘍病菌的皿內抑菌活性圖。【具體實施方式】[0024]下面將結合附圖對本發明作進一步的描述。需要說明的是，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。
[0025]需要說明的是，本發明TIASA5菌株的分離和鑒定:
[0026]野生黃花蒿植株采自陜西楊陵渭河灘，剪取健康野生黃花蒿的莖組織用清水將表面沖洗干凈后，用吸水紙將水分吸干；將莖組織在99%乙醇中浸lmin，然后在3.125%的NaClO中浸6min,再次放入99%乙醇中浸30sec,最后用無菌生理鹽水沖洗5次后晾干；用滅菌刀片將莖組織切成0.2mm長的小段,置于高氏一號培養基平板上，28°C培養箱培養21d后，挑取單菌落，劃線純化，所得菌株采用甘油法保藏與_80°C冰箱保藏。 [0027]如圖1所示，將純化的菌株在黃豆粉培養基平板上活化，通過管堞法皿內抑制試驗篩選得到一株對獼猴桃潰瘍病菌有顯著抑制活性的拮抗菌株TIASA5菌株，經菌落形態、菌體形態、生理生化特征、細胞化學和16S rDNA序列分析，鑒定TIASA5菌株為青色鏈霉菌，其中圖a為菌絲形態；圖b為孢子形態。
[0028]根據上述獲得的TIASA5菌株菌劑的制備方法:
[0029]將在黃豆粉培養基平板上活化培養5天的TIASA5菌株用打孔器打成直徑為6mm的菌餅，將菌餅接入種子培養基中，28°C，150rpm培養36小時后，按12%的接種量將種子液接入發酵培養基(每升含黃豆粉15g，淀粉7.5g，蔗糖10g，玉米粉15g，酵母粉5g，硫酸銨15g，pH7.0)中，30°C，180rpm發酵72小時。收集發酵液即為TIASA5菌株的菌劑。
[0030]需要說明的是，其中，所述黃豆粉培養基每升含可溶性淀粉20g，KNO3 Ig，K2HPO4
0.5g，MgSO4 5H20 0.5g, NaCl 0.5g, FeSO4 7H20 0.01g，瓊脂粉 13g，pH7.2-7.4 ;所述種子培養基每升含黃豆粉(沸水煮30min,過濾保留濾液)20g,淀粉5g,鹿糖IOg,蛋白胨2g,酵母粉2g, NaCl 2g, K2HPO4 0.5g, CaCO3 lg, ρΗ7.0-7.2。
[0031]實施例1
[0032]本發明TIASA5菌株菌劑離體抑菌活性實驗。
[0033]將滅菌牛津杯放入混好的獼猴桃細菌性潰瘍病菌(IO9AiL)的NA培養基(牛肉膏
3.0g，蛋白胨10g，NaCL5g，蒸餾水1000mL、pH7.2-7.4)平板中央，杯中加入實施例2中所述的抗菌活性物質ΙΟΟμ L，置30°C培養18-24小時后用十字交叉法測量抑菌圈的大小，試驗設2個重復，取其平均值。
[0034]如圖2所示，TIASA5菌株菌劑對獼猴桃細菌性潰瘍病菌生長的抑制作用顯著，平均抑菌圈直徑為37.5mm。
[0035]實施例2
[0036]TIASA5菌株菌劑對獼猴桃細菌性潰瘍病菌的田間防治試驗。
[0037]在陜西眉縣西北農林科技大學獼猴桃試驗站，選取5-6年生“海沃德”品種為防治對象。
[0038]在2011年11月5日，采用涂刷枝干的方式施用TIASA5菌株菌劑5倍稀釋液和對照藥劑稀釋1000倍的72%農用鏈霉素和稀釋1000倍的46.1%氫氧化銅，以清水作為對照。連續涂刷2次，間隔期10天。試驗每處理為12個病斑，設3個重復。于2012年4月20日(當地獼猴桃潰瘍病發病盛期)調查發病情況，計算病株率和防治效果。
[0039]病株率(％)=病株樹/調查總株數X 100%[0040]防治效果(％)=(對照病株率-處理病株率)/對照病株率X 100%
[0041 ] 田間試驗結果表明，稀釋5倍TIASA5菌株菌劑對獼猴桃潰瘍病表現較好的防治效果，防效達到92.1% (表1)，與72%農用鏈霉素的防效相當，明顯高于46.1%氫氧化銅的防治效果。
[0042]表1 TIASA5菌株菌劑對獼猴桃細菌性潰瘍病的田間防治效果
[0043]
【權利要求】
1.一種楊凌青色鏈霉菌(Streptomyces glaucus sp.nov.yangling)的菌株,其特征在于，所述保藏編號為CGMCC N0.2132。
2.一種具有權利要求1所述菌株的微生物菌劑，其特征在于，所述微生物菌劑中含有保藏編號為CGMCC N0.2132的楊凌青色鏈霉菌(Streptomyces glaucus sp.nov.yangling)。
3.一種制備權利要求2所述的微生物菌劑的方法，其特征在于，將在_80°C冰箱保存的楊凌青色鏈霉菌(Streptomyces glaucus sp.nov.yangling)菌株接種在高氏一號培養基，于28°C培養5天后，用打孔器打成直徑為6mm的菌餅，將菌餅接入種子培養基中，于28°C，150rpm培養36小時后，按12%的接種量將種子液接入發酵培養基中，于30°C，180rpm發酵72小時,收集發酵液，即為青色鏈霉菌(Streptomyces glaucus)菌株的微生物菌劑。
4.以保藏編號為CGMCCN0.2132的楊凌青色鏈霉菌(Streptomyces glaucus sp.nov.yangling)的菌株為成分所制備的抗微生物菌劑在防治獼猴桃細菌性潰瘍病中的應用。
【文檔編號】A01N63/00GK103667114SQ201310567706
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月14日 優先權日:2013年11月14日
【發明者】黃麗麗, 高小寧, 康振生, 涂璇 申請人:西北農林科技大學