液氮直入式細(xì)胞程序降溫盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種液氮直入式細(xì)胞程序降溫盒，屬于生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。該裝置包括盒身和盒蓋，盒身內(nèi)設(shè)置有多個(gè)管槽，盒體外層主體材料采用304不銹鋼，盒體內(nèi)密封件采用硅膠，管槽采用白色高密度聚乙烯材料；管槽內(nèi)部填充物采用泡沫塑料。具體制作工藝為，盒體外層為不銹鋼無尾真空主體，在近1000℃條件下對304不銹鋼進(jìn)行抽真空和封焊而制成，盒身與盒蓋通過螺紋密合，并在盒蓋上加了硅膠密封圈，防止液氮的滲入。本發(fā)明具有三大優(yōu)勢：（1）可以直接降溫到-196℃，不用轉(zhuǎn)移細(xì)胞，適合長期凍存細(xì)胞；（2）無需異丙醇，屬于無損耗永久使用品；（3）分層設(shè)計(jì)，即使短暫取(30min)出都可以保證細(xì)胞溫度低于-80℃。
【專利說明】液氮直入式細(xì)胞程序降溫盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種液氮直入式細(xì)胞程序降溫盒，屬于生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】 [0002]在生物【技術(shù)領(lǐng)域】，在低于_70°C的超低溫條件下，有機(jī)體細(xì)胞內(nèi)部的生化反應(yīng)極其緩慢，甚至終止。因此，采取適當(dāng)?shù)姆椒▽⑸锊牧辖抵脸蜏兀纯墒股顒庸潭ㄔ谀骋浑A段而不衰老死亡。當(dāng)以適當(dāng)?shù)姆椒▽龃娴纳锊牧匣謴?fù)至常溫時(shí)，其內(nèi)部的生化反應(yīng)可恢復(fù)正常。所謂冷凍保存，就是將體外培養(yǎng)物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度(一般是低于-70°C的超低溫條件，_196°C可以長期保存)，并在此溫度下對其長期保存的過程。微生物、動物細(xì)胞、植物細(xì)胞還是體外培養(yǎng)的器官都可以進(jìn)行凍存，并在適當(dāng)條件下復(fù)蘇。水在低于零度的條件下會結(jié)冰。如果將細(xì)胞懸浮在純水中，隨著溫度的降低，細(xì)胞內(nèi)外的水分都會結(jié)冰，所形成的冰晶會造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞而引起細(xì)胞死亡。這種因細(xì)胞內(nèi)部結(jié)冰而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷稱為細(xì)胞內(nèi)冰晶的損傷。如果將細(xì)胞懸浮在溶液中，隨著溫度的降低，細(xì)胞外部的水分會首先結(jié)冰，從而使得未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高。如果將細(xì)胞暴露在這樣高溶質(zhì)的溶液中且時(shí)間過長，細(xì)胞膜上脂質(zhì)分子會受到損壞，細(xì)胞便發(fā)生滲漏，在復(fù)溫時(shí)，大量水分會因此進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，造成細(xì)胞死亡。這種因保存溶液中溶質(zhì)濃度升高而導(dǎo)致的細(xì)胞損傷稱為溶質(zhì)損傷或稱溶液損傷。當(dāng)溫度進(jìn)一步下降，細(xì)胞內(nèi)外都結(jié)冰，產(chǎn)生冰晶損傷。但是如果在溶液中加入冷凍保護(hù)劑，則可保護(hù)細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷。因?yàn)槔鋬霰Ｗo(hù)劑容易同溶液中的水分子結(jié)合，從而降低冰點(diǎn)，減少冰晶的形成，并且通過其摩爾濃度降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷，細(xì)胞得以在超低溫條件下保存。
[0003]液氮溫度(_196°C)是目前最佳的冷凍保存溫度。在_196°C時(shí)，細(xì)胞的生命活動幾乎完全停止，但復(fù)蘇后細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能完好。如果冷凍過程得當(dāng)，一般生物樣品在_196°C下均可保存十年以上。
[0004]冷凍速率是指降溫的速度，直接關(guān)系到冷凍效果。細(xì)胞在冷凍過程中會發(fā)生如下變化:當(dāng)細(xì)胞被冷至_5°C時(shí)，因溶液中加有冷凍保護(hù)劑而降低溶液的冰點(diǎn)，細(xì)胞內(nèi)外溶液仍未結(jié)冰；當(dāng)被冷至-5~_15°C之間時(shí)，細(xì)胞外溶液先出現(xiàn)結(jié)冰而細(xì)胞內(nèi)仍保持未結(jié)冰狀態(tài)。細(xì)胞內(nèi)未結(jié)冰的水分子會比細(xì)胞外部分結(jié)冰溶液中的水分子具有更高的化學(xué)能。其結(jié)果是，細(xì)胞內(nèi)水分子為了和細(xì)胞外水分子保持化學(xué)能的平衡，會向細(xì)胞外流動。冷凍速度不同，細(xì)胞內(nèi)水分向外流動的情況也不相同:如果冷凍速度慢，細(xì)胞內(nèi)水分外滲多，細(xì)胞脫水，體積縮小，細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增高，細(xì)胞內(nèi)不會發(fā)生結(jié)冰；如果冷凍速度快，細(xì)胞內(nèi)水分沒有足夠的時(shí)間外滲，結(jié)果隨著溫度的下降而發(fā)生細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰；如果冷凍速度非常快(即超快速冷凍)，則細(xì)胞內(nèi)形成的冰晶非常小或不結(jié)冰而呈玻璃狀態(tài)(玻璃化冷凍)。Luyet (1973)證實(shí)液體的凝固可分為兩種形式:一種是晶體化，溶液中的分子呈有序排列；另一種情況是非晶體即玻璃化，液體中的分子呈無序狀態(tài)，保持未凝固前的狀態(tài)。不同的冷凍速度既然能使細(xì)胞內(nèi)發(fā)生不同的生理變化，也可以對細(xì)胞產(chǎn)生不同的損傷。當(dāng)冷凍速度過慢時(shí)，細(xì)胞脫水嚴(yán)重，細(xì)胞體積嚴(yán)重收縮，超過一定程度時(shí)即失去活性。同時(shí)冷凍速度過慢，還會引起細(xì)胞外溶液部分結(jié)冰，從而使細(xì)胞外未結(jié)冰的溶液中溶質(zhì)濃度增高，產(chǎn)生溶質(zhì)損傷。當(dāng)冷凍速度過快時(shí)，細(xì)胞內(nèi)水分來不及外滲，會形成較到冰晶，造成細(xì)胞膜及細(xì)胞器的破壞，產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)冰晶損傷。超快速玻璃化冷凍對細(xì)胞存活來說是最為理想的冷凍方法。細(xì)胞內(nèi)外呈玻璃化凝固，無冰晶形成或形成很小的冰晶，對細(xì)胞膜和細(xì)胞器不致造成損傷，細(xì)胞也不會在高濃度的溶質(zhì)中長時(shí)間暴露而受損。
[0005]不同細(xì)胞的最適冷凍速率不同。小鼠骨髓干細(xì)胞、酵母、人紅細(xì)胞的最適冷凍速率分別為1.60C min、7°C /min和200°C /min。細(xì)胞與細(xì)胞之間的最適冷凍速率可在1.6°C~3000C /min，故對一種細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存之前，首先需要測定其最適冷凍速率，以保證獲得最高的冷凍存活率。
[0006]目前，市場上已有的主流程序降溫盒，或稱細(xì)胞凍存盒或稱梯度降溫凍存盒，是由美國Nalgene公司生產(chǎn)的5100-0001，屬于進(jìn)口品牌類產(chǎn)品。該程序降溫盒或稱細(xì)胞凍存盒為成功冷凍保存細(xì)胞提供精確和良好重復(fù)性的冷卻率:_1°C /min的冷凍率降溫到_80°C。屬于耗材類，需要加入藥品異丙醇，異丙醇屬于揮發(fā)耗材。可以凍存18管細(xì)胞。且只能冷凍到-80°C，如轉(zhuǎn)移到液氮細(xì)胞會有一定影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種液氮直入式細(xì)胞程序降溫盒，以便采用合理的凍存盒材料和特殊的結(jié)構(gòu)，保證合適的降溫曲線。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下。
[0009]一種液氮直入式細(xì)胞程序降溫盒，包括盒身和盒蓋，盒身內(nèi)設(shè)置有多個(gè)管槽，其中，盒體外層主體材料采用304不銹鋼，盒體內(nèi)密封件采用硅膠，管槽采用白色高密度聚乙烯材料；管槽內(nèi)部填充物采用泡沫塑料。
[0010]上述液氮直入式細(xì)胞程序降溫盒的具體制作工藝為，盒體外層為不銹鋼無尾真空主體，在近1000°C條件下對304不銹鋼進(jìn)行抽真空和封焊而制成，盒身與盒蓋通過螺紋密合，并在盒蓋上加了硅膠密封圈，能有效的防止液氮的滲入。
[0011]該發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明具有三大優(yōu)勢:(I)可以直接降溫到-196°C，不用轉(zhuǎn)移，適合長期凍存細(xì)胞；(2)無需異丙醇，屬于無損耗永久使用品；(3)分層設(shè)計(jì)，即使短暫取(30min)出都可以保證細(xì)胞溫度低于_80°C。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1是本發(fā)明實(shí)施例中降溫盒結(jié)構(gòu)截面圖。
[0013]圖2是本發(fā)明實(shí)施例中降溫盒結(jié)構(gòu)俯視圖。
[0014]圖3是本發(fā)明實(shí)施例中降溫盒降溫曲線圖。
[0015]圖4是本發(fā)明實(shí)施例中使用本發(fā)明裝置細(xì)胞復(fù)蘇后Ins-1細(xì)胞系存活率對比圖。
[0016]圖5是本發(fā)明實(shí)施例中使用本發(fā)明裝置細(xì)胞復(fù)蘇后Cos-7細(xì)胞系存活率對比圖。
[0017]圖中標(biāo)記說明:1、盒蓋；2、盒身；3、盒體外層；4、管槽；5、螺紋。【具體實(shí)施方式】[0018]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行描述，以便更好的理解本發(fā)明。
實(shí)施例[0019]如圖1、圖2所示的液氮直入式細(xì)胞程序降溫盒，包括盒身2和盒蓋1，盒身2內(nèi)設(shè)置有多個(gè)管槽4，盒體外層3主體材料采用304不銹鋼，盒體內(nèi)密封件采用硅膠，管槽4采用白色高密度聚乙烯材料；填充物采用泡沫塑料。上述液氮直入式細(xì)胞程序降溫盒的具體制作工藝為，盒體外層3為不銹鋼無尾真空主體，在近1000°C條件下對304不銹鋼進(jìn)行抽真空和封焊而制成，盒身2與盒蓋I通過螺紋5密合，并在盒蓋I上加了硅膠密封圈，能有效的防止液氮的滲入。管槽4部分材料為白色高密度聚乙烯，內(nèi)部填充的泡沫塑料質(zhì)輕保溫性較好。[0020]圖3是采用本降溫盒測試所得的降溫曲線(重復(fù)了 5次的結(jié)果)。除了少數(shù)細(xì)胞凍存需要超速冷凍，大多數(shù)細(xì)胞凍存的關(guān)鍵在于細(xì)胞在20°C到-80°C下降呈線性關(guān)系，并且降溫速度在1-10°C /min。本實(shí)施例中，細(xì)胞在20°C到_80°C下降呈線性關(guān)系大約是2.6-2.7°C/min的降溫速度。符合多數(shù)細(xì)胞的凍存要求。采用用液氮低溫探頭在降溫盒子內(nèi)部測得的在液氮中，從室溫能降到液氮溫度(_196°C左右)，如圖3所示。[0021]下面可以繼續(xù)舉例采用本裝置所取得的試驗(yàn)效果，具體試驗(yàn)過程及結(jié)果如下:
(一)細(xì)胞培養(yǎng):
1、培養(yǎng)基(4°C保存，使用前在37°C水浴中溫育):
INS-1 細(xì)胞系:1) RPMI 1640 (含有 IlmM 的 D-glucose) ;2) Fetal Bovine Serum(滅活)+10ml ；3) Sodium Pyruvate (lOOmM,使細(xì)胞增加內(nèi)源性CO2的產(chǎn)生)加入1% ；4)β -Mercaptoethanol (自由基的清除劑)加入0.1% ；
C0S7細(xì)胞系:標(biāo)準(zhǔn)的DMEM完全培養(yǎng)基，加入10%血清及1%的青霉素-鏈霉素雙抗；
2、Poly-L-Lydine:0.01mg/ml ；
3、0.25% Trypsin-EDTA (胰酶)(一 20°C保存，使用前在室溫自然溶解)；
4、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(4°C保存，使用前在37°C水浴中溫育)；
137mmol/L NaCl (8g) ；2.7mmol/L KCl (0.2g) ; IOmmo 1/L Na2HPO4 (1.44g)；2mmol/L KH2PO4 (0.24g);在IL三蒸水中加入四種成分，調(diào)pH 7.4，滲透壓300m0sm,過濾保存。[0022](二)細(xì)胞凍存:
1、凍存液:7%DMS0；13% FBS血清；80%培養(yǎng)基；液氮直入式細(xì)胞程序降溫盒；Nalgene5100-0001程序降溫盒:加入250ml異丙醇；
2、材料:
(1)生長良好的培養(yǎng)細(xì)胞；
(2)新鮮培養(yǎng)基；
(3)DMSO (Sigma D-2650)；
(4)無菌塑料冷凍保存管(Nalgene5000-0020)；
(5)0.4% w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)；(6)血球計(jì)數(shù)盤與蓋玻片；
(7)等速降溫機(jī)(KRYO10 Series II)；
3、步驟:
(1)冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長情形。
[0023](2)凍存開始將培養(yǎng)瓶中的原液倒掉，用5mlPBS洗2次。
[0024](3)加入Iml胰酶，放在37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱里消化細(xì)胞，加入5ml細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，并將其完全吸入15ml離心管中；
(4) 15ml離心管離心1000rpm.5min.棄上清，加入IOml冷凍保存溶液，使細(xì)胞濃度控制為1-5 X 106 cells/ml,混合均勻,分裝于已標(biāo)示完全之冷凍保存管中，I ml/vial,并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測。
[0025](5)傳統(tǒng)冷凍保存方法:用Nalgene公司生產(chǎn)的5100-0001程序降溫盒降溫到_80°C，在手動轉(zhuǎn)移到液氮中保存。
[0026](6)本實(shí)施例中的冷凍方法(新方法):用液氮直入式細(xì)胞程序降溫盒直接凍存。
[0027]如圖4、圖5所示的細(xì)胞復(fù)蘇后Ins-1和Cos-7細(xì)胞系存活率對比圖(重復(fù)了 5次的結(jié)果)，本發(fā)明所采用的方法比傳統(tǒng)的方法更有效率，存活率更高。
[0028]以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種液氮直入式細(xì)胞程序降溫盒，包括盒身和盒蓋，盒身內(nèi)設(shè)置有多個(gè)管槽，其特征在于:所述盒體外層主體材料采用304不銹鋼，所述盒體內(nèi)密封件采用硅膠，所述管槽采用白色高密度聚乙烯材料；所述管槽內(nèi)部填充物采用泡沫塑料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液氮直入式細(xì)胞程序降溫盒，其特征在于:所述降溫盒的具體制作工藝為，盒體外層為不銹鋼無尾真空主體，在近1000°C條件下對304不銹鋼進(jìn)行抽真空和封焊而制成，盒身與盒蓋通過螺紋密合，并在盒蓋上加了硅膠密封圈，防止液氮的滲入。
【文檔編號】A01N1/02GK103548815SQ201310576212
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月18日
【發(fā)明者】王意, 胡麗丹 申請人:王意