一種基于分子輔助選擇的青脛顯性白羽肉雞品系的培育方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于分子輔助選擇的青脛顯性白羽肉雞品系的培育方法，屬于分子育種【技術領域】。本發明采用分子輔助選擇的方法鑒定雞顯性白羽位點的基因型，可以快速判定出該位點的基因型，生產基因型為II的青脛顯性白羽優質肉雞品系，能避免測交選育的繁瑣，縮短世代間隔，加快育種進程，從而降低培育成本。采用本發明方法培育的青脛顯性白羽肉雞品系其肉質細嫩，肉味鮮美，生產性能高，屠體上不存在有色羽殘跡，使屠體更加美觀。此外，該品系作為父本與高產蛋雞品種或快大肉雞品種雜交配套，可分別生產出高產型或快大型青脛顯性白羽肉雞。
【專利說明】—種基于分子輔助選擇的青脛顯性白羽肉雞品系的培育方法
【技術領域】
[0001]本發明具體涉及一種基于分子輔助選擇的青脛顯性白羽肉雞品系的培育方法，屬于分子育種【技術領域】。
【背景技術】
[0002]我國地方雞品種資源豐富，其肉質細嫩、肉味鮮美，但是在外觀上多表現為黃羽、麻羽等有色羽。對于冷鮮雞市場來說，有色羽肉雞常因屠宰后羽毛不容易脫干凈而影響屠體的美觀。對于國外的快大型白羽肉雞生長速度快，屠體性狀好，但是肉質遠不如我國的地方雞。因此，顯性白羽優質肉雞的培育中具有重要意義。
[0003]傳統育種中常常采用測交的方法，依據雜交后代雞的表型性狀留種。即通過測交、繁殖擴群來淘汰隱性白羽雞群體里的顯性白純合子個體和顯性白雜合子個體。而測交繁瑣、周期長，且會受到擴群的大小的影響。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種基于分子輔助選擇的青脛顯性白羽肉雞品系的培育方法。
[0005]為了實現以上目的，本發明所采用的技術方案是:
[0006]一種基于分子輔助選 擇的青脛顯性白羽肉雞品系的培育方法，包括以下步驟:
[0007](I)利用青脛肉雞品種作為父本與快大型白羽肉雞品種作為母本進行雜交，生產出Fl代，選留Fl代青脛白羽公母雞；
[0008](2) Fl代自交得到F2代，選留F2代青脛白羽公母雞；
[0009](3)利用人工引入PvuII的RFLP-PCR方法測定F2代青脛白羽公母雞的基因型，選留顯性白羽位點為II基因型的個體，淘汰顯性白羽位點為Ii和ii基因型的個體，得到顯性白羽位點為II基因型的公母雞；
[0010](4)對得到的II基因型個體進行橫交和擴繁，按照家系選擇和個體選擇方法，提高生產速度和雞肉品質，同時提純和固定青脛白羽的外觀性狀，經過3個世代以上的選育后，得到顯性白羽位點為II基因型的青脛顯性白羽肉雞品系。
[0011]所述步驟(1)中青脛肉雞品種為固始雞、狼山雞、淮北麻雞、淮南麻黃雞、黃山黑雞、五華雞、德化黑雞、崇仁麻雞、壽光雞、盧氏雞、景陽雞、鄖陽大雞、東安雞、桃源雞、瑤雞、茶花雞、和田黑雞等。
[0012]所述步驟(1)中快大型白羽肉雞品種為羅斯308、科寶、艾維茵、哈巴德、艾拔益加(AA )、海波羅、迪聞等。
[0013]所述步驟(3)中利用人工引入PvuII的RFLP-PCR方法，包括以下步驟:以包含PMEL17基因的待測雞全基因組DNA為模板，以引物對P為引物PCR擴增PMEL17基因第十外顯子，得到擴增片段；對擴增片段進行Pvu II酶切，對酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑒定雞顯性白羽位點的基因型；
[0014]所述的引物對P為:
[0015]上游引物P-F:5，-AGTGGCACCACGCTCACCGTGGGGCAGCT-3，(如 SEQ ID N0.1 所示)，
[0016]下游引物P-R:5’ -GAGGGGGTGAGTGCTGTGTTCTC-3’(如 SEQ ID N0.2 所示)。
[0017]所述的雞全基因組DNA采用苯酚-氯仿粗提法或蛋白酶K法提取。[0018]所述的PCR 擴增反應體系為:2XTaq PCR MasterMix 6.25 μ L, ddH20 4.25 μ L,P-F 0.5 μ L，P-R 0.5 μ L，DNA 模板 1.0 μ L。
[0019]所述的2XTaq PCR MasterMix含有Taq DNA聚合酶、dNTPs、氯化鎂和PCR反應緩沖液，為市售商品，可購自上海生工、大連寶生物、北京百泰克、北京康為等公司。
[0020]所述的PCR擴增反應程序為:95°C預變性5min ;95°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸20s，30個循環；72°C延伸IOmin ;4°C保存。
[0021]所述的Pvu II酶切反應體系為:擴增片段10 μ L，Buffer 1.5 μ L，Pvu II
0.3 μ L, ddH20 3.2 μ L0
[0022]所述的Pvu II酶切反應條件為:37°C，酶切過夜。
[0023]所述的瓊脂糖凝膠的質量濃度為2%。
[0024]所述的瓊脂糖凝膠電泳的電壓為120V，電泳時間為60min。
[0025]所述的鑒定雞顯性白羽位點基因型的方法為:11基因型表現為160bp條帶；Ii基因型表現為124bp和160bp條帶；ii基因型表現為124bp。
[0026]優選的，將步驟(4)得到的顯性白羽位點為II基因型的青脛顯性白羽肉雞品系作為父本與高產蛋雞品種或快大肉雞品種雜交配套，生產出高產型或快大型青脛顯性白羽肉雞。
[0027]本發明的有益效果:
[0028]本發明采用分子輔助選擇的方法鑒定雞顯性白羽位點的基因型，可以快速判定出該位點的基因型，生產基因型為II的青脛顯性白羽優質肉雞品系，能避免測交選育的繁瑣，縮短世代間隔，加快育種進程，從而降低培育成本。
[0029]本發明針對顯性白羽野生純合子個體在PMEL17基因第10外顯子存在的一個9bp插入這一特征，設計上游引物引入Pvu II酶切位點，是否存在插入序列與是否存在酶切位點之間是相互對應的關系。其中，引物對P是針對不含9bp插入的PMEL17基因的核苷酸序列進行設計的，引入Pvu II酶切位點后，PCR擴增產物能夠被Pvu II切為124bp和27bp(27bp太短電泳時不顯示)的片段(如SEQ ID N0.3所示);含9bp插入的基因序列在擴增后不存在Pvu II這一酶切位點，因此其PCR產物酶切后片段為160bp(如SEQ ID N0.4所示)。
[0030]采用本發明方法培育的青脛顯性白羽肉雞品系其肉質細嫩，肉味鮮美，生產性能高，屠體上不存在有色羽殘跡，使屠體更加美觀。此外，蛋雞品種或肉雞品種雜交配套，可分別生產出高產型或快大型青脛顯性白羽肉雞。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1為本發明實施例1中各樣本在雞顯性白羽位點的酶切電泳圖；
[0032]注:編號說明如下:5、8、9為II基因型，3、6、7為Ii基因型；1、2、4為ii基因型，M 為 DNA marker。【具體實施方式】
[0033]下述實施例僅對本發明作進一步詳細說明，但不構成對本發明的任何限制。
[0034]實施例1
[0035]本實施例中基于分子輔助選擇的青脛顯性白羽肉雞品系的培育方法，包括以下步驟:
[0036](I)利用固始雞純系公雞作為父本與艾維茵母雞作為母本進行雜交，生產出Fl代雞，淘汰雜交出現的少量的有色羽個體，在Fl白羽群體中選留Fl代青脛白羽公母雞；
[0037](2) Fl代自交得到F2代，選留F2代青脛白羽公母雞；
[0038](3)利用人工引入PvuII的RFLP-PCR方法測定F2代青脛白羽公母雞的基因型，具體包括以下步驟: [0039]①樣品的采集
[0040]對F2代選留的青脛白羽雞翅靜脈采血，加1/3抗凝劑，用蛋白酶K法提取血液DNA,將DNA樣品保存于4°C冰箱保存備用；
[0041]②引物設計
[0042]以PMELl7 基因序列(GenBank Accession N0.AY636129)為模板設計引物對 P，如下所示:
[0043]上游引物P-F: 5 ’ -AGTGGCACCACGCTCACCGTGGGGCAGCT-3，，
[0044]下游引物P-R:5 ’ -GAGGGGGTGAGTGCTGTGTTCTC-3，；
[0045]③PCR擴增
[0046]以引物對P為引物，建立12.5μ L擴增體系:2XTaq PCR MasterMix (購自北京百泰克公司)6.25 μ L, ddH20 4.25 μ L, P-F 0.5 μ L, P-R 0.5 μ L, DNA 模板 1.0 μ L ;
[0047]反應程序為:95°C預變性5min ;95°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸20s，30個循環；72°C延伸IOmin ;4°C保存；
[0048]④PCR擴增產物的酶切
[0049]15yL 的 Pvu II 酶切體系:擴增片段 10 μ L，Buffer 1.5 μ L，Pvu II 0.3 μ L,ddH20 3.2 μ L ;酶切反應條件:37°C，酶切過夜；
[0050]⑤PCR擴增產物酶切后的檢測與結果判定
[0051]取8μ L PCR擴增后的酶切產物，2%的瓊脂糖凝膠電泳(電泳電壓:120V ;電泳時間:60min)點樣，電泳結束后采用凝膠成像系統檢測，電泳圖譜參見圖1 ;
[0052]根據電泳圖譜中出現的條帶的大小判定:當出現160bp的片段，則為顯性白羽純合子(II基因型，表型為白羽)；當出現124bp的片段，則為野生型純合子(ii基因型，表型為有色羽或隱性白羽);當出現160bp、124bp的片段，則為顯性白羽雜合子(Ii基因型，表型為白羽)；
[0053](4)根據基因型判定結果，選留顯性白羽位點為II基因型的個體，淘汰顯性白羽位點為Ii和ii基因型的個體，得到顯性白羽位點為II基因型的公母雞；
[0054](5)對得到的II基因型個體進行橫交和擴繁，按照家系選擇和個體選擇方法，提高生產速度和雞肉品質，同時提純和固定青脛白羽的外觀性狀，經過3個世代以上的選育后，得到顯性白羽位點為II基因型的青脛顯性白羽肉雞品系；[0055](6)對步驟(5)得到的顯性白羽位點為II基因型的青脛顯性白羽肉雞品系作為父本與白來航、固始雞雜交配套，得到高產型或快大型青脛顯性白羽肉雞商品代。
【權利要求】
1.一種基于分子輔助選擇的青脛顯性白羽肉雞品系的培育方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)利用青脛肉雞品種作為父本與快大型白羽肉雞品種作為母本進行雜交，生產出Fl代，選留Fl代青脛白羽公母雞； (2)Fl代自交得到F2代，選留F2代青脛白羽公母雞； (3)利用人工引入PvuII的RFLP-PCR方法測定F2代青脛白羽公母雞的基因型，選留顯性白羽位點為II基因型的個體，淘汰顯性白羽位點為Ii和ii基因型的個體，得到顯性白羽位點為II基因型的公母雞； (4)對得到的II基因型個體進行橫交和擴繁，按照家系選擇和個體選擇方法，提高生產速度和雞肉品質，同時提純和固定青脛白羽的外觀性狀，經過3個世代以上的選育后，得到顯性白羽位點為II基因型的青脛顯性白羽肉雞品系。
2.根據權利要求1所述的基于分子輔助選擇的青脛顯性白羽肉雞品系的培育方法，其特征在于:所述步驟(1)中青脛肉雞品種為固始雞、狼山雞、淮北麻雞、淮南麻黃雞、黃山黑雞、五華雞、德化黑雞、崇仁麻雞、壽光雞、盧氏雞、景陽雞、鄖陽大雞、東安雞、桃源雞、瑤雞、茶花雞、和田黑雞中任一種。
3.根據權利要求1所述的基于分子輔助選擇的青脛顯性白羽肉雞品系的培育方法，其特征在于:所述步驟(1)中快大型白羽肉雞品種為羅斯308、科寶、艾維茵、哈巴德、艾拔益加、海波羅、迪高中任一種。
4.根據權利要求1所述的基于分子輔助選擇的青脛顯性白羽肉雞品系的培育方法，其特征在于:所述步驟(3)中利用人工引入PvuII的RFLP-PCR方法，包括以下步驟:以包含PMEL17基因的待測雞全基因組DNA為模板，以引物對P為引物PCR擴增PMEL17基因第十外顯子，得到擴增片段；對擴增片段進行Pvu II酶切，對酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑒定雞顯性白羽位點的基因型； 所述的引物對P為:
上游引物 P-F:5’ -AGTGGCACCACGCTCACCGTGGGGCAGCT-3，,
下游引物 P-R:5’ -GAGGGGGTGAGTGCTGTGTTCTC-3’。
5.根據權利要求4所述的基于分子輔助選擇的青脛顯性白羽肉雞品系的培育方法，其特征在于:所述的PCR擴增反應體系為:2XTaq PCR MasterMix6.25 μ L, ddH20 4.25 μ L,P-F 0.5 μ L，P-R 0.5 μ L，DNA 模板 1.0 μ L。
6.根據權利要求4所述的基于分子輔助選擇的青脛顯性白羽肉雞品系的培育方法，其特征在于:所述的PCR擴增反應程序為:95°C預變性5min ;95°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸20s，30個循環；72°C延伸IOmin ;4°C保存。
7.根據權利要求4所述的基于分子輔助選擇的青脛顯性白羽肉雞品系的培育方法，其特征在于:所述的Pvu II酶切反應體系為:擴增片段10 μ L，Buffer 1.5yL, Pvu II0.3 μ L，ddH20 3.2 μ L ；Pvu II酶切反應條件為:37°C，酶切過夜。
8.根據權利要求4所述的基于分子輔助選擇的青脛顯性白羽肉雞品系的培育方法，其特征在于:所述的瓊脂糖凝膠的質量濃度為2% ;瓊脂糖凝膠電泳的電壓為120V，電泳時間為 60mino
9.根據權利要求4所述的基于分子輔助選擇的青脛顯性白羽肉雞品系的培育方法，其特征在于:所述的鑒定雞顯性白羽位點基因型的方法為:11基因型表現為160bp條帶；Ii基因型表現為124bp和160bp條帶；ii基因型表現為124bp。
10.根據權利要求1所述的基于分子輔助選擇的青脛顯性白羽肉雞品系的培育方法，其特征在于:將步驟(4)得到的顯性白羽位點為II基因型的青脛顯性白羽肉雞品系作為父本與高產蛋雞品種或快大肉雞品種雜交`配套，生產出高產型或快大型青`脛顯性白羽肉雞。
【文檔編號】A01K67/027GK103563851SQ201310589816
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年11月20日 優先權日:2013年11月20日
【發明者】康相濤, 李轉見, 田亞東, 韓瑞麗, 楊朋坤, 蔣瑞瑞, 呂世杰, 孫桂榮, 李國喜, 王丹丹, 王彥彬, 劉小軍, 閆峰賓 申請人:河南農業大學