一種基于分子輔助選擇的青脛隱性白羽雞品系的培育方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于分子輔助選擇的青脛隱性白羽雞品系的培育方法，屬于分子育種【技術領域】。本發明采用分子輔助選擇的方法鑒定雞顯性白羽位點的基因型，可以快速判定出該位點的基因型，生產基因型為ii的青脛隱性白羽雞品系，能避免測交選育的繁瑣，縮短世代間隔，加快育種進程，從而降低培育成本。采用本發明方法培育的青脛隱性白羽雞品系其肉質細嫩，肉味鮮美，生產性能高，既可以作為商品雞直接投入生產，還可以與青脛黃麻羽雞進行配套應用。
【專利說明】—種基于分子輔助選擇的青脛隱性白羽雞品系的培育方法
【技術領域】
[0001]本發明具體涉及一種基于分子輔助選擇的青脛隱性白羽雞品系的培育方法，屬于分子育種【技術領域】。
【背景技術】
[0002]隨著生活水平的提高，人們的消費觀念從過去的數量型轉變為質量型。人們對雞肉肉質的要求也越來越高。我國的地方雞具有肉質好的特點，但是其生長速度較慢，飼料轉化率低。而國外的快大型肉雞雖生長速度快、飼料轉化率高，其肉質較差。為解決這一問題，將國外快大型肉雞與國內地方優質肉雞進行雜交，既能夠改善國外快大型肉雞的肉質也能加快地方優質肉雞的生長速度和生產性能。但是，由于我國人民長期的飲食習慣的影響，中國消費者偏愛黃麻羽、黑羽等有色羽的雞，尤其是南方城市不接受快速生長的白羽雞。為了使雜交后雞的表型符合中國消費者的需求，就需要純合的隱性白羽雞，隱性白羽雞生產性能高，且與我國有色羽雜交后能保持有色羽的羽色，對于我國優質雞的育種上具有重大的意義。

【發明內容】

[0003]本發明的目的是提供一種基于分子輔助選擇的青脛隱性白羽雞品系的培育方法。
[0004]為了實現以上目的，本發明所采用的技術方案是:
[0005]一種基于分子輔助選擇的青脛隱性白羽雞品系的培育方法，包括以下步驟:`[0006](I)利用青脛隱性白羽雞作為父本，白來航雞作為母本進行雜交，生產出Fl代；
[0007](2) Fl代自交得到F2代，選留F2代青脛白羽公母雞；
[0008](3)利用人工引入PvuII的RFLP-PCR方法測定F2代青脛白羽公母雞的基因型，選留顯性白羽位點為ii基因型的個體，淘汰顯性白羽位點為II和Ii基因型的個體，得到顯性白羽位點為ii基因型的青脛白羽公母雞；
[0009](4)取顯性白羽位點為ii基因型的青脛白羽公母雞自交，利用步驟(3)的方法測定自交后代的基因型，重復上述步驟至穩定遺傳，得到顯性白羽位點為ii基因型的青脛隱性白羽雞品系。
[0010]所述步驟(1)中青脛隱性白羽雞為青脛黃麻羽地方雞突變后的青脛白羽雞，經人工引入PvuII的RFLP-PCR方法測定顯性白羽位點為ii基因型。
[0011]所述步驟(3)中利用人工引入PvuII的RFLP-PCR方法，包括以下步驟:以包含PMEL17基因的待測雞全基因組DNA為模板，以引物對P為引物PCR擴增PMEL17基因第十外顯子，得到擴增片段；對擴增片段進行Pvu II酶切，對酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑒定雞顯性白羽位點的基因型；
[0012]所述的引物對P為:
[0013]上游引物P-F:5，-AGTGGCACCACGCTCACCGTGGGGCAGCT-3，(如 SEQ ID N0.1 所示)，
[0014]下游引物P-R:5’ -GAGGGGGTGAGTGCTGTGTTCTC-3’(如 SEQ ID N0.2 所示)。[0015]所述的雞全基因組DNA采用苯酚-氯仿粗提法或蛋白酶K法提取。
[0016]所述的PCR 擴增反應體系為:2XTaq PCR MasterMix 6.25 μ L, ddH20 4.25 μ L,P-F 0.5 μ L，P-R 0.5 μ L，DNA 模板 1.0 μ L。
[0017]所述的2XTaq PCR MasterMix含有Taq DNA聚合酶、dNTPs、氯化鎂和PCR反應緩沖液，為市售商品，可購自上海生工、大連寶生物、北京百泰克、北京康為等公司。
[0018]所述的PCR擴增反應程序為:95°C預變性5min ;95°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸20s，30個循環；72°C延伸IOmin ;4°C保存。
[0019]所述的Pvu II酶切反應體系為:擴增片段10 μ L，Buffer 1.5 μ L，Pvu II 0.3 μ L，ddH20 3.2 μ L0
[0020]所述的Pvu II酶切反應條件為:37°C，酶切過夜。
[0021]所述的瓊脂糖凝膠的質量濃度為2%。
[0022]所述的瓊脂糖凝膠電泳的電壓為120V，電泳時間為60min。
[0023]所述的鑒定雞顯性白羽位點基因型的方法為:11基因型表現為160bp條帶；Ii基因型表現為124bp和160bp條帶；ii基因型表現為124bp。
[0024]優選的，將步驟(4)得到的顯性白羽位點為ii基因型的青脛隱性白羽雞品系與青脛黃麻羽雞品種雜交配套，生產出有色羽肉雞。
[0025]所述的青胚黃麻羽雞品種為固始雞、邊雞、淮北麻雞、淮南麻黃雞、五華雞、崇仁麻雞、瑯琊雞、盧氏雞、桃源 雞、瑤雞、茶花雞等。
[0026]本發明的有益效果:
[0027]本發明采用分子輔助選擇的方法鑒定雞顯性白羽位點的基因型，可以快速判定出該位點的基因型，生產基因型為ii的青脛隱性白羽雞品系，能避免測交選育的繁瑣，縮短世代間隔，加快育種進程，從而降低培育成本。
[0028]本發明針對顯性白羽野生純合子個體在PMEL17基因第10外顯子存在的一個9bp插入這一特征，設計上游引物引入Pvu II酶切位點，是否存在插入序列與是否存在酶切位點之間是相互對應的關系。其中，引物對P是針對不含9bp插入的PMEL17基因的核苷酸序列進行設計的，引入Pvu II酶切位點后，PCR擴增產物能夠被Pvu II切為124bp和27bp(27bp太短電泳時不顯示)的片段(如SEQ ID N0.3所示);含9bp插入的基因序列在擴增后不存在Pvu II這一酶切位點，因此其PCR產物酶切后片段為160bp (如SEQ ID N0.4所示)。
[0029]采用本發明方法培育的青脛隱性白羽雞品系其肉質細嫩，肉味鮮美，生產性能高，既可以作為商品雞直接投入生產，還可以與青脛黃麻羽雞進行配套應用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1為本發明實施例1中各樣本在雞顯性白羽位點的酶切電泳圖，
[0031]注:編號說明如下:5，8，9為II基因型，3，6，7為Ii基因型；1，2，4為ii基因型，M 為 marker。
【具體實施方式】
[0032]下述實施例僅對本發明作進一步詳細說明，但不構成對本發明的任何限制。
[0033]實施例1[0034]本實施例中基于分子輔助選擇的青脛隱性白羽雞品系的培育方法，包括以下步驟:
[0035](I)利用固始雞群體中青脛隱性白羽雞作父本，白來航雞作母本進行雜交，生產出Fl代；
[0036](2) Fl代自交得到F2代，選留F2代青脛白羽公母雞；
[0037](3)利用人工引入PvuII的RFLP-PCR方法測定F2代青脛白羽公母雞的基因型，具體包括以下步驟:[0038]①樣品的采集
[0039]對F2代選留的青脛白羽雞翅靜脈采血，加1/3抗凝劑，用蛋白酶K法提取血液DNA,將DNA樣品保存于4°C冰箱保存備用；
[0040]②引物設計
[0041]以PMELl7 基因序列(GenBank Accession N0.AY636129)為模板設計引物對 P,如下所示:
[0042]上游引物P-F: 5 ’ -AGTGGCACCACGCTCACCGTGGGGCAGCT-3，，
[0043]下游引物P-R: 5 ’ -GAGGGGGTGAGTGCTGTGTTCTC-3 ’ ；
[0044]③PCR擴增
[0045]以引物對P為引物，建立12.5μ L擴增體系:2XTaq PCR MasterMix (購自北京百泰克公司)6.25 μ L, ddH20 4.25 μ L, P-F 0.5 μ L, P-R 0.5 μ L, DNA 模板 1.0 μ L ;
[0046]反應程序為:95°C預變性5min ;95°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸20s，30個循環；72°C延伸IOmin ;4°C保存；
[0047]④PCR擴增產物的酶切
[0048]15 μ L 的 Pvu II 酶切體系:擴增片段 10 μ L, Buffer 1.5 μ L，Pvu II 0.3 μ L, ddH20
3.2 μ L ;酶切反應條件:37°C，酶切過夜；
[0049]⑤PCR擴增產物酶切后的檢測與結果判定
[0050]取8 μ L PCR擴增后的酶切產物，2%的瓊脂糖凝膠電泳(電泳電壓:120V ；電泳時間:60min)點樣，電泳結束后采用凝膠成像系統檢測，電泳圖譜參見圖1 ;
[0051]根據電泳圖譜中出現的條帶大小進行判定:當出現160bp的片段，則為顯性白羽純合子(II基因型，表型為白羽)；當出現124bp的片段，則為野生型純合子(ii基因型，表型為有色羽或隱性白羽);當出現160bp、124bp的片段，則為顯性白羽雜合子(Ii基因型，表型為白羽)；
[0052](4)根據基因型判定結果，選留顯性白羽位點為ii基因型的個體，淘汰顯性白羽位點為II和Ii基因型的個體，得到顯性白羽位點為ii基因型的公母雞；
[0053](5)取顯性白羽位點為ii基因型的青脛白羽公母雞自交，利用步驟(3)的方法測定自交后代的基因型，重復上述步驟至穩定遺傳，得到顯性白羽位點為ii基因型的青脛隱性白羽雞品系；
[0054](6)將步驟(5)得到的顯性白羽位點為ii基因型的青脛隱性白羽雞品系作為父本與青脛黃麻羽雞品種雜交配套，生產出有色羽肉雞。
【權利要求】
1.一種基于分子輔助選擇的青脛隱性白羽雞品系的培育方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)利用青脛隱性白羽雞作為父本，白來航雞作為母本進行雜交，生產出Fl代； (2)Fl代自交得到F2代，選留F2代青脛白羽公母雞； (3)利用人工引入PvuII的RFLP-PCR方法測定F2代青脛白羽公母雞的基因型，選留顯性白羽位點為ii基因型的個體，淘汰顯性白羽位點為II和Ii基因型的個體，得到顯性白羽位點為ii基因型的青脛白羽公母雞； (4)取顯性白羽位點為ii基因型的青脛白羽公母雞自交，利用步驟(3)的方法測定自交后代的基因型，重復上述步驟至穩定遺傳，得到顯性白羽位點為ii基因型的青脛隱性白羽雞品系。
2.根據權利要求1所述的基于分子輔助選擇的青脛隱性白羽雞品系的培育方法，其特征在于:所述步驟(1)中青脛隱性白羽雞為青脛黃麻羽地方雞突變后的青脛白羽雞。
3.根據權利要求1所述的基于分子輔助選擇的青脛隱性白羽雞品系的培育方法，其特征在于:所述步驟(3)中利用人工引入PvuII的RFLP-PCR方法，包括以下步驟:以包含PMEL17基因的待測雞全基因組DNA為模板，以引物對P為引物PCR擴增PMEL17基因第十外顯子，得到擴增片段；對擴增片段進行Pvu II酶切，對酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑒定雞顯性白羽位點的基因型； 所述的引物對P為:
上游引物 P-F:5’ -AGTGGCACCACGCTCACCGTGGGGCAGCT-3，,
下游引物 P-R:5’ -GAGGGGGTGAGTGCTGTGTTCTC-3’。
4.根據權利要求3所述的基于分子輔助選擇的青脛隱性白羽雞品系的培育方法，其特征在于:所述的PCR擴增反應體系為:2XTaq PCR MasterMix 6.25 μ L, ddH20 4.25 μ L,P-F0.5 μ L，P-R 0.5 μ L，DNA 模板 1.0 μ L。
5.根據權利要求3所述的基于分子輔助選擇的青脛隱性白羽雞品系的培育方法，其特征在于:所述的PCR擴增反應程序為:95°C預變性5min ;95°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸20s，30個循環；72°C延伸IOmin ;4°C保存。
6.根據權利要求3所述的基于分子輔助選擇的青脛隱性白羽雞品系的培育方法，其特征在于:所述的Pvu II酶切反應體系為:擴增片段10 μ L，Buffer 1.5 μ L，Pvu II 0.3 μ L，ddH20 3.2 μ L ；Pvu II酶切反應條件為:37°C，酶切過夜。
7.根據權利要求3所述的基于分子輔助選擇的青脛隱性白羽雞品系的培育方法，其特征在于:所述的瓊脂糖凝膠的質量濃度為2% ;瓊脂糖凝膠電泳的電壓為120V，電泳時間為60mino
8.根據權利要求3所述的基于分子輔助選擇的青脛隱性白羽雞品系的培育方法，其特征在于:所述的鑒定雞顯性白羽位點基因型的方法為:11基因型表現為160bp條帶；Ii基因型表現為124bp和160bp條帶；ii基因型表現為124bp。
9.根據權利要求1所述的基于分子輔助選擇的青脛隱性白羽雞品系的培育方法，其特征在于:將步驟(4)得到的顯性白羽位點為ii基因型的青脛隱性白羽雞品系與青脛黃麻羽雞品種雜交配套，生產出有色羽肉雞。
10.根據權利要求9所述的 基于分子輔助選擇的青脛隱性白羽雞品系的培育方法，其特征在于:所述的青脛黃麻羽雞品種為固始雞、邊雞、淮北麻雞、淮南麻黃雞、五華雞、崇仁麻雞、瑯琊雞、 盧氏雞、桃源雞、瑤雞或茶花雞。
【文檔編號】A01K67/027GK103583470SQ201310590937
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月20日 優先權日:2013年11月20日
【發明者】康相濤, 楊朋坤, 孫桂榮, 王彥彬, 韓瑞麗, 田亞東, 李轉見, 蔣瑞瑞, 呂世杰, 李國喜, 閆峰賓, 劉小軍 申請人:河南農業大學