一種產(chǎn)acc酶活性促生菌sc-12及其在促進(jìn)植物生長中應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種產(chǎn)ACC酶活性促生菌SC-12及其在促進(jìn)植物生長中應(yīng)用；菌株SC-12分離自江蘇省如東縣沿海灘涂植物根際土壤中，經(jīng)鑒定為同溫層芽孢桿菌（Bacillus?stratosphericus），保藏號(hào)為CGMCC?No.7622；該菌在以ACC為唯一氮源條件下，其ACC脫氨酶活性為23.57μmolα-丁酮酸.mg-1pro.h-1。另外，SC-12菌株還具有產(chǎn)生吲哚乙酸(IAA)、耐鹽以及溶磷的特性，同時(shí)該菌對(duì)酸堿具有良好的適應(yīng)性。耐鹽條件下，菌劑SC-12能顯著促進(jìn)辣椒、番茄發(fā)芽率和芽長。田間試驗(yàn)結(jié)果表明，利用SC-12菌株研制的促生菌肥能夠顯著提高番茄生物量和產(chǎn)量。
【專利說明】—種產(chǎn)ACC酶活性促生菌SC-12及其在促進(jìn)植物生長中應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)集約化生產(chǎn)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種SC-12菌株在促進(jìn)大棚逆境環(huán)境中辣椒、番茄等茄果類蔬菜的生長。
【背景技術(shù)】
[0002]由于設(shè)施栽培(主要是塑料大棚、日光溫室和地膜覆蓋技術(shù))在我國蔬菜和其他重要經(jīng)濟(jì)作物的反季節(jié)供給和跨地區(qū)種植中所起的重要作用，設(shè)施農(nóng)業(yè)在全國各地得到了大面積的推廣應(yīng)用。
[0003]溫室、大棚等栽培條件下的土壤缺少雨水淋洗，且溫度、濕度、通氣狀況和水肥管理等均與露地栽培有較大差別(殷永嫻，劉鴻雁.設(shè)施栽培下土壤中硝化、反硝化作用的研究.生態(tài)學(xué)報(bào)，1996，16(3):246-250.)，設(shè)施栽培又長期處于高集約化、高復(fù)種指數(shù)、高肥料施用量的生產(chǎn)狀態(tài)下，其特殊的生態(tài)環(huán)境與不合理的水肥管理措施導(dǎo)致了土壤次生鹽潰化、養(yǎng)分不平衡、土壤酸化等諸多生產(chǎn)問題，其中最為突出的是土壤次生鹽潰化，已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要限制因子(余海英，李廷軒，周健民.設(shè)施土壤次生鹽潰化及其對(duì)土壤性質(zhì)的影響.土壤，2005，37(6):581-586.)。土壤的鹽潰化不僅影響植物代謝和光合作用，還會(huì)降低植物對(duì)土壤養(yǎng)分及微量元素的攝入，由于土壤中的鐵主要以難溶性的高價(jià)氧化物等形式存在，而鹽堿土又會(huì)進(jìn)一步降低土壤可溶性鐵的含量，從而導(dǎo)致植物的缺綠癥。因此，生長在鹽潰化土壤中的植物往往同時(shí)受到鹽脅迫的危害以及鐵缺乏的威脅。
[0004]鹽堿地改良是一項(xiàng)復(fù)雜而艱巨的工作，而在當(dāng)今提倡生態(tài)效益為重的前提下，生物改良措施已成為研究的熱點(diǎn)。植物促生菌(plant growth-promotingrhizobacteria,PGPR)可以通過間接產(chǎn)生抗生素和分泌鐵載體等方式抑制或減輕植物病害對(duì)植物產(chǎn)生的不良影響，并通過解磷、固氮、產(chǎn)生植物激素、酶解降低乙烯水平等方式直接刺激和調(diào)節(jié)植物生長(Kloepper J ff, Schroth M N.Plant growth-promoting rhizobacteria onradishes//Proceedings of the Fourth International Conference on Plant PathogenBacteria[C], vol.2.1NRA, 1978:879 - 882)。其中，一種含 1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(1-aminocyclo-propane-l-carboxylic acid, ACC)脫氨酶的PGPR受到了各國科研工作者的關(guān)注。ACC脫氨酶是一種有效降低逆境乙烯含量的外源促生物質(zhì)，該酶在干旱、鹽脅迫及重金屬污染等逆境條件下能顯著提高農(nóng)作物的抗逆性和增加產(chǎn)量(Glick BR, Cheng Z, CzarnyJ, Duan J.Promotion of plant growth by ACC deaminase-producing soil bacteria.European Journal of Plant Pathology, 2007，119:329 - 339)。有些微生物可以分泌 1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(簡稱ACC)脫氨酶從而顯著促進(jìn)植物生長，如番茄、黃瓜、辣椒等蔬菜瓜果類和小麥、豆科等糧食作物。它能水解植物體內(nèi)生物合成乙烯的直接前體ACC，產(chǎn)生羥基丁酸和氨，阻止乙烯的釋放。當(dāng)這種菌附著在種子表皮時(shí)，它能水解ACC，降低種子在逆境條件下大量產(chǎn)生的植物生 長抑制劑和植物衰老促進(jìn)劑——乙烯的濃度，促進(jìn)根伸長和植物生長(許煜泉，石榮，林志新.具有ACC脫氨酶活性及抗枯萎病菌的假單胞菌株B*8.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，33 (2): 206-209.)。
[0005]在實(shí)際生產(chǎn)中，若能篩選到既能促生、又能增強(qiáng)作物抗逆能力的促生菌，并在理論上揭示其作用機(jī)制，不僅能夠有效降低過量施用化肥、農(nóng)藥給環(huán)境和人類健康帶來的危害，還能廣泛促進(jìn)處于各種逆境環(huán)境中植物的生長，對(duì)于當(dāng)前綠色可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展具有重要的理論及實(shí)際意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供一株新的促生菌，可在促進(jìn)大棚逆境環(huán)境中辣椒、番茄等蔬菜瓜果類等生長。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)解決方案為:本發(fā)明采用的菌株是同溫層芽孢桿菌SC-12，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏日期為2013年5月15號(hào)，保藏號(hào)為=CGMCC N0..7622。
[0008]本發(fā)明菌株SC-12系從江蘇省如東縣沿海灘涂植物根際土壤中分離得到，觀察分析了該菌形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特性以及16SrDNA序列:
[0009]( I)菌落和菌體形態(tài)特征以及生理生化特征
[0010]菌株SC-12呈短桿狀，菌落黏稠半透明，表面濕潤光滑，邊緣整齊，革蘭氏染色陰性，其電鏡圖片為圖1。生理生化鑒定結(jié)果表明:菌株SC-12能充分地利用淀粉、乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖，但不能液化明膠；甲基紅試驗(yàn)、伏-普試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)均為陰性；D引哚試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)結(jié)果均為陽性。
[0011](2)16SrDNA 序列`
[0012]菌株SC-12的16Sr DNA核苷酸序列含有1422bp，序列如SEQ ID N0.1所示，將其與GeneBank等數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行最大同源性比較，發(fā)現(xiàn)SC-12的16S rDNA序列與同溫層芽孢桿菌 Bacillus stratosphericus KC172060 序列同源性達(dá)到 100%。
[0013]本發(fā)明還提供了一種促生菌肥，是將所述菌株SC-12接種到腐熟的豬糞秸桿堆肥中發(fā)酵得到，所得促生菌肥中含有SC-12菌株IX 108/g以上。
[0014]具體的方法是:將活化的權(quán)利要求1所述菌株SC-12接種到LB液體培養(yǎng)基中，30°C，搖床培養(yǎng)20h后，將發(fā)酵液按20% (千克/升)的量接種到腐熟的豬糞秸桿堆肥中，并充分混合均勻，調(diào)節(jié)堆體濕度，進(jìn)行固體發(fā)酵，發(fā)酵過程中每天攪拌肥料，控制堆體溫度，發(fā)酵20天，肥料中含有SC-12菌株I X 108/g以上，即為促生菌肥。
[0015]本發(fā)明以ACC為唯一氮源采用富集定向篩選方法，從江蘇省如東縣沿海灘涂植物根際土壤中分離到4株產(chǎn)ACC脫氨酶的植物促生菌。對(duì)其ACC脫氨酶活性大小、產(chǎn)IAA、產(chǎn)鐵載體和溶磷能力進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示，菌株SC-12產(chǎn)脫氨酶的能力最強(qiáng)，同時(shí)也具有較強(qiáng)的產(chǎn)IAA和溶磷能力。耐鹽及耐酸堿性試驗(yàn)也表明菌株SC-12對(duì)鹽具有一定的耐性，對(duì)酸堿的耐性尤為明顯，在PH4~10范圍內(nèi)正常生長。通過對(duì)其進(jìn)行生理生化特性和16SrDNA序列分析，該株菌株初步鑒定為同溫層芽孢桿菌。在此基礎(chǔ)上，在鹽脅迫條件下，菌株SC-12對(duì)辣椒、番茄種子發(fā)芽率和芽長具有明顯的促生作用。由于菌株SC-12株具有較強(qiáng)的產(chǎn)ACC酶活力和很強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，對(duì)也具有明顯的促生作用。從植物根際鹽堿土中篩選出的PGPR相對(duì)于肥沃土壤中篩出的PGPR更能適應(yīng)鹽堿環(huán)境，所以用于鹽堿地改良、鹽堿地綠化，更具有實(shí)用性。因此，該菌有望應(yīng)用于大棚辣椒、番茄等茄果類蔬菜，提高植物對(duì)逆境的適應(yīng)能力，增加產(chǎn)量。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1SC-12菌株的透射電鏡圖；
[0017]圖2SC-12菌株的16S rDNA全序列的系統(tǒng)發(fā)育樹；
[0018]圖3不同硝酸鹽濃度下菌株SC-12對(duì)辣椒和番茄種子發(fā)芽率和芽長的影響。【具體實(shí)施方式】
[0019]以下結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述:
[0020]實(shí)施例1:
[0021]I材料與方法
[0022]1.1 菌種
[0023]從江蘇省如東縣沿海灘涂植物根際土壤中分離。
[0024]1.2培養(yǎng)基
[0025]LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCllOg, pH7.0，去離子水IL ；
[0026]SM培養(yǎng)基:葡萄糖1.0g,鹿糖1.0g，檸檬酸鈉1.0g，蘋果酸1.0g，甘露醇1.0g，醋酸鈉 1.0g, KH2PO40.4g, K2HP042.0g, MgSO40.2g, CaCl20.lg, CuSO4Img, NiSO4Img, ZnS045mg,FeS045mg, MnS043mg, CoSO4Img, Na2MoO4Img, H3B032mg,生物素 2 (VB6) IOmg,硫胺(VB1) 2mg,氰鈷維生素(VB12) 0.lmg,泛酸(VB3) 5mg,葉酸2mg,核黃素5mg,煙酸5mg,蒸懼水1000mL,pH6.4。維生素過濾除菌后加入。
[0027]SMA培養(yǎng)基:SM培養(yǎng)基中加入過濾除菌的ACC，使其濃度為0.5g.L'
[0028]SMN培養(yǎng)基:SM培養(yǎng)基中加入(NH4) 2S04,使其濃度為0.5g.L'
[0029]SRSM 培養(yǎng)基:葡萄 H 10g/l ；Ca3 (PO4) 25g/l ； (NH4)SO40.5g/l ；KC10.2g/l ；MgSO4.7H200.3g/l ；MnSO40.004g/l ；FeS04, 0.00 2g/l ；NaC120g/l ;酵母提取物，0.5g/l ;溴甲酹紅紫0.lg/lo
[0030]1.3產(chǎn)1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)脫氨酶細(xì)菌的篩選
[0031]將菌株接入LB液體培養(yǎng)基中28°C搖床培養(yǎng)18h，離心收集菌體，將菌體用無菌水洗兩次后等量(100 U L)分別接入SM液體培養(yǎng)基、SMA液體培養(yǎng)基、SMN液體培養(yǎng)基(3mL)。28°C振蕩培養(yǎng)48h，用722分光光度計(jì)比色法測(cè)定不同處理菌懸液的0D_值，并進(jìn)行比較。在SM培養(yǎng)基中不長，在SMA和SMN培養(yǎng)基中良好生長的細(xì)菌具有ACC脫氨酶活性。
[0032]1.4ACC脫氨酶活性測(cè)定
[0033]分離菌株接種于SMN培養(yǎng)液中搖床振蕩培養(yǎng)20h，4°C離心收集菌體，用SM培養(yǎng)液洗滌離心兩次，菌體懸浮于SM培養(yǎng)液，并按5%接種量接種于SMA培養(yǎng)液，280C 150rpm的條件下培養(yǎng)48h，以誘導(dǎo)產(chǎn)生ACC脫氨酶。4°C離心收集菌體，用0.lmol.L^Tris-HCl緩沖液(pH值為7.6)洗滌離心兩次，重懸浮于600 ii L0.lmol.L1Tris-HCl緩沖液(pH值為8.5)中，加入30 ii L甲苯并迅速振蕩30s以破碎細(xì)胞。
[0034]取IOOii L含甲苯的細(xì)胞提取物于1.5mL離心管中，加入10 U L0.5mol.L-1ACC M勻，30°C反應(yīng)30min。加1.0mL0.56N HCl終止反應(yīng)，14000rpm離心5min去除細(xì)胞碎片，吸取ImL上清液于7mL離心管中，加入0.15mL0.1%的2，4-二硝基苯肼(溶于2M HC1)，30°C反應(yīng)15-30min。取出加lmL2N NaOH0以加ImL Tris-HCl緩沖液(pH值為8.5)進(jìn)行同樣反應(yīng)為空白管調(diào)零，以ImL濃度為0、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0mM的a - 丁酮酸為標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定540nm波長下吸光值。
[0035]菌體總蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。以ImL濃度為0、20、40、60、80和IOOmg.L—1的牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)溶液，加5mL考馬斯亮藍(lán)G250染色液，反應(yīng)5min后測(cè)定595nm波長下吸光值。ACC脫氨酶的活性以在測(cè)酶體系中每毫克蛋白每分鐘形成的a-丁酮酸的量表示，單位為 y mo I a - 丁酮酸? mg—iprotein.mirf1。
[0036]1.5菌株產(chǎn)鐵載體、3-吲哚乙酸(IAA)、溶磷能力的測(cè)定
[0037]鐵載體的測(cè)定方法:將分離菌株接種于MSA液體培養(yǎng)基中，搖床30°C 150r/min振蕩培養(yǎng)48h后，發(fā)酵液6000r/min離心lOmin，取1.5ml上清液加1.5mlCAS檢測(cè)液，充分混勻，靜置Ih后測(cè)定630nm波長處的吸光值(A)，以去離子水作為對(duì)照調(diào)零。另取1.5ml CAS檢測(cè)液與1.5ml未接菌的MSA液體培養(yǎng)基上清液充分混勻，同法測(cè)定吸光值即為參比值(Ar)。以A/Ar作定量指標(biāo)。比值越小,反映鐵載體的產(chǎn)量越大。一般參考標(biāo)準(zhǔn)為:A/ArO~
0.2, +++++ ；0.2 ~0.4, ++++ ；0.4 ~0.6, +++ ；0.6 ~0.8, ++ ；0.8 ~1.0, +。
[0038]IAA測(cè)定方法:將色氨酸配置成2.5mg/ml的溶液，LB液體培養(yǎng)基分裝于試管中，每管4ml，121°C高壓滅菌后加入過濾除菌的色氨酸溶液1ml，使培養(yǎng)基中色氨酸的濃度為0.5mg/ml，將供試菌株接種于上述培養(yǎng)基中，搖床振蕩培養(yǎng)3天，離心取Iml上清，加50 u 110mmol/L的正磷酸，再加2ml Salkowski ’ s顯色劑，黑暗下25°C顯色30min,測(cè)定530nm波長下的吸光值。以蒸餾水代替培養(yǎng)液同樣反應(yīng)作為對(duì)照調(diào)零，用不同濃度的IAA標(biāo)準(zhǔn)液同法作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算發(fā)酵液中IAA的濃度。
[0039]溶磷能力的測(cè)定方法:將待測(cè)的菌株先在LB固體培養(yǎng)基上活化，然后用滅菌牙簽點(diǎn)接種菌株至固體改良SRSM培養(yǎng)基上。每菌株在一個(gè)皿上接4個(gè)重復(fù)。在28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d后觀察菌株透明圈的大小。
[0040]1.6菌種鑒定
[0041]1.6.1菌落和菌體形態(tài)觀察
[0042]在LB培養(yǎng)基上劃線得到單菌落，觀察單菌落邊緣形狀、大小、隆起情況、表面形態(tài)、菌落顏色、透明度、色素產(chǎn)生情況等。將菌株培養(yǎng)16_18h后，進(jìn)行革蘭氏染色，并觀察革蘭氏染色的陰陽性和菌體的形態(tài)。
[0043]1.6.2生理生化鑒定:
[0044]生理生化特征測(cè)定參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》(東秀珠等，2001)。
[0045]1.6.3分子生物學(xué)鑒定
[0046]用16S rDNA 通用引物 27F (正向引物):5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' (SEQ IDN0.2);1492R (反向引物):5' -TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3' (SEQ ID N0.3)，以分離菌株的總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體積50 u 1，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min ；94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸1.5min，循環(huán)30次；最后72°C延伸IOmin0取PCR產(chǎn)物2.5 ii L于0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物送至生物公司進(jìn)行純化和測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交GenBank數(shù)據(jù)庫，用BLAST軟件進(jìn)行比對(duì)分析。將測(cè)序結(jié)果用BLAST軟件與GenBank中得到的16S rDNA相關(guān)菌株的序列一起輸入MEGA4.0進(jìn)行DNA同源性比較和排列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育譜系圖。[0047]1.7溫度、初始pH值和鹽濃度對(duì)菌株生長的影響
[0048]將供試菌株點(diǎn)接于固體平板，分別在15°C、25°C、35°C、45°C的溫度下培養(yǎng)72h，在600nm波長下測(cè)量各處理菌液的OD值，用OD值來表示其在梯度鹽濃度培養(yǎng)基中培養(yǎng)的生物量，OD值越大，則表明生物量就越大。
[0049]用lmol.L-1的NaOH和lmol.L-1的HCl將LB培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)節(jié)至4.0,5.0、
6.0,7.0,8.0,9.0,10.0。將活化的供試菌株分別點(diǎn)接于上述不同pH的平板上，28°C培養(yǎng)72h，觀察其能否生長及生長情況，方法同上。
[0050]將過夜培養(yǎng)的供試菌株的菌懸液接入到Ca(NO3)2濃度分別為0，50，100，150，200，250gkg^的液體LB培養(yǎng)基中(色氨酸濃度為0.5mg mF1)，28°C震蕩培養(yǎng)24h，觀察其能否生長及生長情況，方法同上。
[0051]1.8不同鹽分條件下菌株SC-12對(duì)辣椒、番茄耐鹽性的影響
[0052]將去離子水(CK)，8、16、24g/kg Ca(NO3)2溶液滅菌后加入滅菌的培養(yǎng)皿中(內(nèi)置3~5層濾紙)，每平皿10ml。將消毒過的辣椒、番茄(70%酒精lmin，1%次氯酸鈉IOmin)，浸于 0.03mol/L MgSO4 菌懸液(OD600=0.5)或 0.03mol/L MgSO4 滅活菌懸液(CK)中 Ih 后，置于上述滅過菌的培養(yǎng)皿中。每天向平皿中加3mL無菌水保濕催芽(25°C-28°C )，4天后調(diào)查發(fā)芽率及芽長。每培養(yǎng)皿20粒種子，設(shè)置5個(gè)重復(fù)。
[0053]1.9SC-12菌肥田間促生試驗(yàn)
[0054]1.9.1促生菌肥的制備將活化的菌株SC-12接種到IOOmL (500mL搖瓶)LB液體培養(yǎng)基中，30°C，ZOOrmirT1搖床培養(yǎng)20h后，將發(fā)酵液按20% (v/m)(千克/升)的量接種到腐熟的豬糞秸桿堆肥中，并充分混合均勻，調(diào)節(jié)堆體濕度，進(jìn)行固體發(fā)酵，發(fā)酵過程中每天攪拌肥料，控制堆體溫度，發(fā)酵20天，肥料中含有SC-12菌株IX 108/g以上，即為促生菌肥。
[0055]1.9.2番爺育苗番爺品種為金鵬9號(hào),選取健康飽滿的番爺種子,在75%酒精中浸泡lmin，用0.1%升汞消毒2min，用滅菌水沖洗3次后浸泡吸脹,然后鋪在裝有無菌濕潤濾紙的培養(yǎng)皿上，30°C催芽，直到種子露白。將種子播入育苗穴盆，栽培土為揚(yáng)州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院蚯蚓生產(chǎn)基地生產(chǎn)的蚯蚓糞育苗基質(zhì)，育苗20天后選擇生長一致的移栽到大棚。
[0056]1.9.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)于2013年在揚(yáng)州市揚(yáng)子蔬菜公司大棚內(nèi)進(jìn)行。大棚土壤理化性狀:有機(jī)質(zhì)29.2g/kg,堿解氮240mg/kg,速效磷140mg/kg,速效鉀240mg/kg, pH7.95,全鹽1.65g/kg和EC值為0.67mS/cm。大棚面積50 X 6m2,分3畦。每畦雙行植株距40cm，行距70cm。每行15株，共30株。田間試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理:1.促生菌肥(10000kg ha—1) ;2.天輔有機(jī)肥(12000kg ha-1) ；3.保利復(fù)合肥(1125kg ha—1) ;4.對(duì)照。肥料施入土壤后立即淺翻15cm混勻，起壟，覆膜，移苗定植。隨機(jī)區(qū)組排列，4次重復(fù)。小區(qū)日常管理一致。于番茄采收期，在每個(gè)小區(qū)中隨機(jī)選取株掛牌于采收期進(jìn)行取樣，測(cè)定植株地上部、地下部和果實(shí)鮮重、干重和株高。
[0057]2結(jié)果與分析
[0058]2.1產(chǎn)1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)脫氨酶細(xì)菌的篩選
[0059]植物在逆境(旱、澇、鹽、重金屬等)條件下，其體內(nèi)的乙烯含量會(huì)迅速增加，過量乙烯的積累會(huì)使植物生長受阻甚至死亡。Glick et al (2005) (Glick BR.Modulation ofplant ethylene levels by the bacterial enzyme ACC deaminase.FEMS MicrobiologyLetter, 2005, 251:1 - 7)研究表明微生物能夠產(chǎn)生ACC脫氨酶，通過分解乙烯的前體物質(zhì)ACC，來減少脅迫環(huán)境下乙烯在植物體內(nèi)的積累，從而促進(jìn)植物生長發(fā)育。本研究通過將供試菌株的細(xì)菌懸液分別等量接種于SM、SMA, SMN培養(yǎng)液中，以檢測(cè)菌株是否能以ACC為唯一氮源進(jìn)行生長。將供試細(xì)菌接種于SM培養(yǎng)基可以排除菌株固氮作用引起的判斷誤差，接種于SMN培養(yǎng)基可以排除細(xì)菌培養(yǎng)和培養(yǎng)基配方等對(duì)菌株產(chǎn)ACC脫氨酶能力的判斷誤差。試驗(yàn)結(jié)果表明，有多株菌在SMA培養(yǎng)液的生長勢(shì)明顯好于SM培養(yǎng)液的生長勢(shì)，表明菌株能以ACC為唯一氮源進(jìn)行生長，將這些菌株命名為SC-3、SC-12、D18、D25。
[0060]2.2分離菌株ACC脫氨酶活性、產(chǎn)鐵載體，IAA和溶磷能力的測(cè)定[0061 ] 本研究對(duì)上文中的以ACC為唯一氮源生長的分離菌株進(jìn)一步定量測(cè)定其ACC脫氨酶活性，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，4株菌均表現(xiàn)出ACC脫氨酶活性，LSD多重比較結(jié)果表明，4株菌在0.05顯著水平上存在顯著差異，其ACC脫氨酶活性表現(xiàn)為SC-12>D18>D25>SC-3。
[0062]PGPR既可以通過解磷、產(chǎn)生植物激素等直接作用促進(jìn)植物的生長，也可以通過分泌鐵載體和產(chǎn)生抗生素等間接作用提高植物的抗逆性(丁延芹，杜秉海.玉米根際細(xì)菌中PGPR的篩選及初步鑒定.土壤肥料，2001, (3):41-43.)，本實(shí)驗(yàn)室通過對(duì)4株菌株產(chǎn)鐵載體、IAA和溶磷能力的測(cè)定，LSD多重比較結(jié)果表明，菌株SC-3和D25產(chǎn)IAA能力顯著大于菌株SC-12和D18 (P < 0.05)，菌株D18產(chǎn)IAA能力最低；溶磷能力SC-12 > D25 > SC-3> D18，4株菌株均能產(chǎn)生鐵載體，菌株SC-12和D18產(chǎn)鐵載體能力較強(qiáng)，而菌株SC-3和D25產(chǎn)鐵載體能力較弱。綜合以上分析菌株SC-12對(duì)大棚逆境環(huán)境中植物的潛在促生效果可能優(yōu)于其余3株菌。以下SC-12菌株被選用于進(jìn)一步的研究。
[0063]表1供試菌株ACC脫氨酶活性及產(chǎn)吲哚乙酸、鐵載體和精氨酸脫羧酶情況
[0064]
【權(quán)利要求】
1.一株產(chǎn)ACC酶活性促生菌SC-12,是同溫層芽孢桿菌(Bacillus stratosphericus),它的保藏號(hào)為CGMCC N0.7622。
2.權(quán)利要求1所述的SC-12菌株在促進(jìn)大棚逆境環(huán)境中茄果類蔬菜生長中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述茄果類蔬菜是番茄、辣椒。
4.一種促生菌肥，是將所述菌株SC-12接種到腐熟的豬糞秸桿堆肥中發(fā)酵得到，所得促生菌肥中含有SC-12菌株I X 108/g以上。
【文檔編號(hào)】A01N63/00GK103642730SQ201310646842
【公開日】2014年3月19日 申請(qǐng)日期:2013年12月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月3日
【發(fā)明者】王小兵, 封克, 汪曉麗 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)