一種大苞鞘石斛蘭的無菌播種和組織培養的方法
【專利摘要】一種大苞鞘石斛蘭的無菌播種和組織培養的方法，本方法選取生長健壯的大苞鞘石斛母株，于開花時進行人工授粉，將授粉后發育至基本成熟而未開裂時的果實作為外植體，并經過無菌播種、分化培養、增殖培養、生根培養、壯苗培養基試管苗移栽等繁殖步驟。本發明具有種子萌發率高、成苗快、種苗品質好等特點，能在短期內獲得大量的試管苗，成苗的移栽成活率90%以上。能為大苞鞘石斛的種苗生產及資源保護提供一條有效的途徑。
【專利說明】—種大苞鞘石斛蘭的無菌播種和組織培養的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及植物生物【技術領域】，具體屬于一大苞鞘石斛蘭的無菌播種和組織培養的方法。
【背景技術】
[0002]大荀鞘石斛又名騰沖石斛，學名生于海拔1350~1900 m的山地疏林中樹干上，主要分布于中國云南東南部至西部以及緬甸、泰國和印度東北部等地的熱帶雨林中，屬附生蘭。花期:1-5月，總狀花序具1- 3朵花，花被片白色，邊緣帶紫色，唇瓣頂端紫色基部金黃色，花梗和子房白色帶淡紫紅色，花大(花徑9.5 cm左右)、開展，花色艷麗，是石斛蘭中花大、色艷，觀賞價值很高的種類；其莖可作藥用，藥品名稱為扁黃草，性甘，微寒，具有益胃生津，滋陰清熱等功效。
[0003]我國石斛蘭原種資源豐富，但由于生境破壞、過渡采集及較長時期缺乏保護，野生資源數量明顯下降，針對這一狀況我們應當加快對我國石斛蘭原種種質資源的研究與開發，提高繁殖速度和促進種質保存，從而減緩人為破壞和資源瀕危的局面；鑒于石斛蘭的鑒定分類比較困難，甚至某些種類只有開花時才可鑒定，為此我們需要建立種質資源庫，收集和整理我國石斛蘭原種資源，為 資源的有效保存、研究打下基礎；加強對野生石斛蘭資源的保護、開發與利用；加強和深化觀賞石斛蘭的育種研究，提高育種水平，培育出觀賞價值高、具有自主知識產權的新優品種，同時要以工廠化、規模化生產為目標，著力解決有開發前景的石斛蘭原種的快繁體系研究，且可結合試管苗和人工種子野生放養達到可持續發展的目的。

【發明內容】

[0004]本發明提供了一種大苞鞘石斛蘭的無菌播種和組織培養的方法。
[0005]本發明采用的技術解決方案是:
一種大苞鞘石斛蘭的無菌播種和組織培養的方法，其特征在于:所述的方法包括以下步驟:
(1)選材:大苞鞘石斛蘭開花時選取生長健壯的母株進行人工授粉，授粉后果實成熟且外植體未開裂時作為外植體用播種；
(2)萌發培養:將外植體用75%酒精擦拭表面，洗潔精清洗30min后自來水沖洗1 h，移置于超凈工作臺上，用75%的酒精消毒60 S，無菌水清洗2次，0.1%升汞溶液消毒15 min并搖動，無菌水清洗5次，取出大苞鞘石斛種胚，將種胚播于B5、綿白糖20 g/L—1、椰乳20%、瓊脂7.6 g/L-1混合配制的用鹽酸或者氫氧化鈉調節pH為5.4的萌發培養基上，培養50天，種胚萌發成原球莖；
(3)分化培養:將原球莖轉接于花寶I號3g/L、蛋白胨2 g/L、NAA 0.2 mg/L、椰乳10%、馬鈴薯提取液10%、葡萄糖20 g/L、瓊脂7.6 g/L混合配制的用鹽酸或者氫氧化鈉調節PH為5.6的分化培養基上進行分化培養，培養時間70天，萌發后的綠色原球莖，接種10天后，最后形成完整植株小苗；
(4)增殖培養:選取分化后的小苗接入CHB、NAA0.5、6_BA 0.2、椰乳10%、蔗糖30 g/L、瓊脂7.6 g/L混合配制的用鹽酸或者氫氧化鈉調節pH為5.8的增殖培養基上進行叢生芽增殖培養，培養150天長成無菌大苗；
(5)生根誘導培養:將增殖后的無菌大苗轉入花寶2號3g/L、蛋白胨2 g/L、IBA I mg/L、椰乳10%、蔗糖30 g/L、瓊脂7.6 g/L混合配制的用鹽酸或者氫氧化鈉調節pH為5.6的生根誘導培養基進行生根誘導，培養45天；
(6)壯苗培養:將生根誘導的無菌苗在花寶I號3g/L、蛋白胨2 g/L、蔗糖30 g/L、活性炭I g/L、瓊脂7.6 g/L混合配制的用鹽酸或者氫氧化鈉調節pH為5.6的壯苗培養基做壯苗生根培養，培養90天；
(7)試管苗移栽:無菌苗壯苗生根培養后栽植于1:1:0.5的松樹皮+珍珠巖+蘭花基石中，栽培基質采用121 °C高壓蒸汽滅菌消毒120 min，栽培條件為遮陰40%的自然光照條件，80%相對濕度，25~29 °C。
[0006]所述的大苞鞘石斛蘭的無菌播種和組織培養的方法，其特征在于:所述的大苞鞘石斛蘭的無菌播種和組織培養的方法的所有步驟均在培養溫度為(23±1) °C，光照強度15001ux,光照時間16 h/d的條件下進行。
[0007]本發明的有益效果是:本發明提供一種大苞鞘石斛的種苗試管繁殖無菌播種和組織培養方法，本方法選取生長健壯的大苞鞘石斛母株，于開花時進行人工授粉，將授粉后發育至基本成熟而未開裂時的果實作為外植體，并經過無菌播種、分化培養、增殖培養、生根培養、壯苗培養基試管苗移栽等繁殖步驟。本發明具有種子萌發率高、成苗快、種苗品質好等特點，能在短期內獲得大量的試管苗，成苗的移栽成活率90%以上。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1為大苞鞘石斛種胚萌發過程圖。
[0009]圖2為大苞鞘石斛萌發培養圖。
[0010]圖3為大苞鞘石斛分化培養圖。
[0011]圖4為大苞鞘石斛增殖培養圖。
[0012]圖5為大苞鞘石斛生根培養圖。
[0013]圖6為大苞鞘石斛壯苗培養圖。
[0014]圖7為大苞鞘石斛移栽馴化培養圖。
[0015]實施例1:
無菌播種和組織培養的條件:培養溫度為(23±1) °C，光照強度15001UX，光照時間16
h/d
1、材料:大苞鞘石斛開花時選取生長健壯的母株進行人工授粉，授粉后果實210天成熟時作為外植體用播種。
[0016]2、萌發培養:將外植體用75%酒精擦拭表面，洗潔精清洗30 min后自來水沖洗Ih，移置于超凈工作臺上，用75%的酒精消毒60 S，無菌水清洗2次，0.1%升汞溶液消毒15min并搖動，無菌水清洗5次，取出大苞鞘石斛種胚，將種胚播于B5、綿白糖20 g/L—1、椰乳20%、瓊脂7.6 g/L-1混合配制的用鹽酸或者氫氧化鈉調節pH為5.4的萌發培養基上，培養50天，種胚萌發成原球莖，原球莖長勢一致，色澤鮮綠，形狀飽滿，直徑在0.65 mm左右(圖1、2)。
[0017]3、分化培養:將原球莖轉接于花寶I號3 g/L、蛋白胨2 g/L、NAA 0.2 mg/L、椰乳10%、馬鈴薯提取液10%、葡萄糖20 g/L、瓊脂7.6 g/L混合配制的用鹽酸或者氫氧化鈉調節pH為5.6的分化培養基上進行分化培養，培養時間70天，萌發后的綠色原球莖，接種10天后，從原球莖頂端產生葉原基凸起，逐漸發育成幼葉，最后形成完整植株(圖3)，小苗高16.5mm左右。
[0018]4、增殖培養:選取分化后的小苗接入CHB、NAA 0.5、6_BA 0.2、椰乳10%、蔗糖30g/L、瓊脂7.6 g/L混合配制的用鹽酸或者氫氧化鈉調節pH為5.8的增殖培養基上進行叢生芽增殖培養，培養150天(圖4)。小苗接入培養基后10天根系開始生長，20天莖部增粗，30天莖基部分化不定芽，此階段基本沒有苗進行高生長，之后莖基部的不定芽不斷增加生長，最初接入的小苗老化死亡。新生的不定芽葉片長度和寬度指標明顯高于接入時的小苗，并且開始進行高生長，節間明顯，具2節。當不定芽長到一定程度時又開始以自身作為母株進行不定芽的增殖，并在增殖到一定數量后老化死亡。
[0019]5、將增殖后的無菌大苗轉入花寶2號3 g/L、蛋白胨2 g/L、IBA I mg/L、椰乳10%、蔗糖30 g/L、瓊脂7.6 g/L混合配制的用鹽酸或者氫氧化鈉調節pH為5.6的生根誘導培養基進行生根誘導，培養45天，苗體健壯，生根率100%，生根粗壯，根毛豐富，平均根數2.3條(圖5)。
[0020]6、壯苗培養:將生根誘導的無菌苗在花寶I號3 g/L、蛋白胨2 g/L、蔗糖30 g/L、活性炭I g/L、瓊脂7.6 g/L混合配制的用鹽酸或者氫氧化鈉調節pH為5.6的壯苗培養基做壯苗生根培養，培養90天，植株健壯(莖高3cm以上，莖粗3mm左右)、葉片開展有光澤、葉色濃綠、根粗壯、根毛豐富 ，平均根數4條(圖6)。
[0021]7、試管苗移栽:無菌苗壯苗生根培養后栽植于1:1:0.5的松樹皮+珍珠巖+蘭花基石中，栽培基質采用121 °C高壓蒸汽滅菌消毒120 min，栽培條件為遮陰40%的自然光照條件，80%相對濕度，25~29°C，，移栽成活率92 % (圖7)。
[0022]實施例中使用的花寶I號(HYPONeX I)和花寶2號(HYPONeX 2)均為美國生產臺灣臺和園藝企業股份有限股份有限公司分裝產品。
[0023]實施例中使用的綿白糖為玉棠牌優級綿白糖。
[0024]實施例中使用的基本培養基成分見下表。
【權利要求】
1.一種大苞鞘石斛蘭的無菌播種和組織培養的方法，其特征在于:所述的方法包括以下步驟: (1)選材:大苞鞘石斛蘭開花時選取生長健壯的母株進行人工授粉，授粉后果實成熟且外植體未開裂時作為外植體用播種； (2)萌發培養:將外植體用75%酒精擦拭表面，洗潔精清洗30min后自來水沖洗I h，移置于超凈工作臺上，用75%的酒精消毒60 S，無菌水清洗2次，0.1%升汞溶液消毒15 min并搖動，無菌水清洗5次，取出大苞鞘石斛種胚，將種胚播于B5、綿白糖20 g/L—1、椰乳20%、瓊脂7.6 g/L—1混合配制的pH調節為5.4的萌發培養基上，培養50天，種胚萌發成原球莖； (3)分化培養:將原球莖轉接于花寶I號3g/L、蛋白胨2 g/L、NAA 0.2 mg/L、椰乳10%、馬鈴薯提取液10%、葡萄糖20 g/L、瓊脂7.6 g/L混合配制的pH調節為5.6的分化培養基上進行分化培養，培養時間70天，萌發后的綠色原球莖，接種10天后，最后形成完整植株小苗； (4)增殖培養:選取分化后的小苗接入CHB、NAA0.5、6-BA 0.2、椰乳10%、蔗糖30 g/L、瓊脂7.6 g/L混合配制的pH調節為5.8的增殖培養基上進行叢生芽增殖培養，培養150天長成無菌大苗； (5)生根誘導培養:將增殖后的無菌大苗轉入花寶2號3g/L、蛋白胨2 g/L、IBA I mg/L、椰乳10%、蔗糖30 g/L、瓊脂7.6 g/L混合配制的pH調節為5.6的生根誘導培養基進行生根誘導，培養45天； (6)壯苗培養:將生根誘導的無菌苗在花寶I號3g/L、蛋白胨2 g/L、蔗糖30 g/L、活性炭I g/L、瓊脂7.6 g/L混合配制的pH調節為5.6的壯苗培養基做壯苗生根培養，培養90天； (7)試管苗移栽:無菌苗壯苗生根培養后栽植于1:1:0.5的松樹皮+珍珠巖+蘭花基石中，栽培基質采用121 °C高壓蒸汽滅菌消毒120 min，栽培條件為遮陰40%的自然光照條件，80%相對濕度，25~29 °C。
2.根據權利要求1所述的大苞鞘石斛蘭的無菌播種和組織培養的方法，其特征在于:所述的大苞鞘石斛蘭的無菌播種和組織培養的方法的所有步驟均在培養溫度為(23±1)°C，光照強度15001UX，光照時間16 h/d的條件下進行。
【文檔編號】A01H4/00GK103636500SQ201310653314
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月9日 優先權日:2013年12月9日
【發明者】王偉, 盧珊, 金荷仙, 陳香波, 夏守慧, 康華靖, 徐雙雙 申請人:溫州科技職業學院