一種分子標(biāo)記輔助選擇高抗稻瘟病材料的選育方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子標(biāo)記輔助選擇高抗稻瘟病材料的選育方法，采用特異性的分子標(biāo)記輔助選擇抗病基因的材料，結(jié)合田間抗病性鑒定，選育目標(biāo)更加明確高效，屬于水稻育種領(lǐng)域。其包括以下實(shí)施方式：1)含抗稻瘟病基因Pi40的抗性親本與感病親本吉粳88雜交構(gòu)建抗感群體以及后代群體的鑒定篩選；2)抗感單株DNA提取、PCR擴(kuò)增和電泳分析；3)將含稻瘟病抗性基因Pi40的水稻品種NG13及感病品種吉粳88，抗感群體后代單株種植于稻瘟病高發(fā)區(qū)吉林省松原市，經(jīng)自然條件誘發(fā)稻瘟病，在苗期和成熟期分別進(jìn)行葉瘟和穗莖瘟的抗性調(diào)查。本發(fā)明通過(guò)田間抗感群體的構(gòu)建，利用篩選稻瘟病抗性基因Pi40的分子標(biāo)記，結(jié)合稻瘟病高發(fā)區(qū)抗病鑒定，可以高效定向改良及培育抗稻瘟病新品種，對(duì)于田間育種具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
【專利說(shuō)明】一種分子標(biāo)記輔助選擇高抗稻瘟病材料的選育方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種分子標(biāo)記輔助選擇高抗稻瘟病材料的選育方法，尤其是采用特異性的分子標(biāo)記輔助選擇含稻瘟病抗性基因的水稻材料，結(jié)合田間表型性狀和抗病性鑒定，選育目標(biāo)更加明確高效，屬于水稻育種領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002]稻瘟病是由稻瘟病菌引起的水稻病害，其分布范圍十分廣泛。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界有80余個(gè)國(guó)家均有發(fā)生，一般流行年份可造成10 % -20%的減產(chǎn)，嚴(yán)重發(fā)生時(shí)則達(dá)到40% -50%。20世紀(jì)90年代以來(lái)，我國(guó)稻瘟病的年發(fā)生面積均在380萬(wàn)hm2以上，每年損失稻谷數(shù)億千克。隨著品種應(yīng)用的單一化、集中化以及氣候的影響，稻瘟病的危害也越來(lái)越嚴(yán)重。盡管人們?cè)诜篮Ψ乐紊虾馁M(fèi)了巨大的精力和物質(zhì)投入，但限于諸多方面因素的影響，防治效果一直不盡人意，尤其在病害嚴(yán)重發(fā)生的年份，常常給生產(chǎn)育種造成了巨大的損失。以吉林省為例，吉林省主栽水稻品種吉粳88，近年來(lái)由于品種抗病性退化導(dǎo)致穗莖瘟大面積發(fā)生，嚴(yán)重影響了北方粳稻的生產(chǎn)。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的根本原因就是主栽品種對(duì)稻瘟病病苗的抗譜狹窄，且單一化，集中化種植普遍，這樣一旦稻瘟病病菌流行小種發(fā)生變化，品種對(duì)稻瘟病的抗性便迅速下降。因此選育廣譜抗性的水稻品種很重要。
[0003]目前，在抗稻瘟病品種選育過(guò)程中，育種家主要采用系譜法。傳統(tǒng)的系譜法通過(guò)兩親本組配，從分離后代中擇優(yōu)選育品種，抗病表型依賴于田間自然鑒定或人工接種鑒定，鑒別難度大，準(zhǔn)確率很低。由于不了解親本的抗病基因型，育種者在親本選擇上非常盲目，通常是海量配組，海量選擇后代，工作量大，育種效率低。利用分子標(biāo)記結(jié)合田間抗病表現(xiàn)進(jìn)行選擇，可以大大提高抗性品種選育的準(zhǔn)確性和效率。
[0004]水稻稻痕病抗性基因Pi40源自澳洲野生稻(0.australiensits)主效抗病基因，對(duì)來(lái)自我國(guó)東北吉林省的稻瘟病菌表現(xiàn)較強(qiáng)的抗性。Pi40(t)初步定位于水稻第6號(hào)染色體短臂上的DNA標(biāo)記S2539和RM3330之間，遺傳距離分別為3.8cm和2.4cm ;通過(guò)電子著陸(e-landing)技術(shù),在水稻Pseudomolecule3上1.8Mb的重疊群(conting)中鑒定出14個(gè)BAC/PAC克隆，為6個(gè)NBS-LRR結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的引物位于PAC克隆P0649C11中。DNA標(biāo)記P1、P2與Pi40緊密連鎖。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了高效選擇高抗稻瘟病新品種，有針對(duì)性、特異性的選擇含有Pi40基因后代的材料，本發(fā)明提供了一種有效的選育方法。利用DNA標(biāo)記Pl和P2對(duì)抗稻瘟病性基因Pi40進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，結(jié)合田間不同分離世代的性狀選擇及抗性鑒定，以提高選育抗病新材料的效率。
[0006]本發(fā)明提供以下解決方案:
[0007]利用含有稻瘟病抗性基因Pi40的水稻材料NG13與感病材料吉粳88構(gòu)建抗感F2群體。利用特異分子標(biāo)記P1、P2篩選含田間表型性狀優(yōu)良且含有Pi40的單株，利用篩選出的單株再與感病親本吉粳88進(jìn)行回交，得到回交群體BC1F1在海南進(jìn)行加代；在天津正季播種BC1F2的種子，再次利用分子標(biāo)記P1、P2對(duì)稻瘟病抗性基因Pi40進(jìn)行篩選，同時(shí)結(jié)合田間表型篩選及抗病性鑒定篩選抗病單株，利用抗病單株再與感病親本吉粳88進(jìn)行回交，得到BC2F1群體在海南加代；在天津正季播種BC2F2種子，利用分子標(biāo)記P1、P2對(duì)稻瘟病基因Ρ?40進(jìn)行篩選，篩選出的抗病單株一部分自交加代，另一部分繼續(xù)與感病親本吉粳88進(jìn)行回交；天津正季得到的回交群體BC3F1在海南加代，天津正季對(duì)BC3F2的單株繼續(xù)進(jìn)行抗病基因檢測(cè)，篩選含有抗病基因的單株，BC2F3的種子繼續(xù)加代檢測(cè)。在BC2F4代與BC3F4代時(shí)單株收種并進(jìn)行抗病基因的篩選，入選的單株進(jìn)行擴(kuò)繁試種，挑選出田間表型與吉粳88相似，含有稻瘟病抗性基因Pi40并抗病性較好的新品系。
[0008]一種檢測(cè)稻瘟病抗性基因Pi40是否存在的引物對(duì)，如Pl和P2。Pl引物序列為5’ -CAACAAACGGGTCGACAAAGG-3’，P2 引物序列為 5’ -CCCCCAGGTCGTGATACCTTC-3 ’。
[0009]一種檢測(cè)水稻DNA中是否存在水稻稻瘟病抗性基因Pi40的方法，以Pl和P2所示序列為引物，擴(kuò)增待檢測(cè)DNA。擴(kuò)增產(chǎn)物含有NG13的條帶即為含有水稻稻瘟病抗性基因Pi40，如圖1第I個(gè)孔所示。
[0010]一種抗稻瘟病材料的選育方法，以含有水稻稻瘟病抗性基因Pi40的水稻材料為親本，與感病水稻品種進(jìn)行雜交，對(duì)雜交后代F2分離群體單株提取基因組DNA，以Pl和P2所示序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)合田間抗病性及表型鑒定，篩選含有稻瘟病抗性基因Pi40并抗病性較好的單株。
[0011]上述引物對(duì)優(yōu)選對(duì)水稻苗期所提取的DNA進(jìn)行標(biāo)記鑒定，檢測(cè)是否攜帶稻瘟病抗性基因Pi40，此引物鑒定結(jié)果結(jié)合田間抗病檢測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證，準(zhǔn)確率較高。該引物對(duì)可以作為水稻抗稻痕病育種中Pi40基因的分子標(biāo)記。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1是分子標(biāo)記P1、P2在稻瘟病抗性基因Pi40的抗性親本NG13和感病品種吉粳88及后代分離群體的擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖:
[0013]M:2000bp 分子量標(biāo)記(片段長(zhǎng)度分別為 2000bp，100bp，750bp，500bp，250，10bp)
[0014]I ；NG132 ;吉粳883，5，7，9，10，11為感病單株帶型；4，6，8，12為抗病單株帶型

【具體實(shí)施方式】
[0015]實(shí)施例1:含稻瘟病抗性基因Pi40的抗性親本與感病親本吉粳88雜交構(gòu)建抗感群體以及后代群體的鑒定篩選
[0016]含稻瘟病抗性基因Pi40的抗性親本NG13與感病親本吉粳88雜交，再自交，然后自交F2代進(jìn)行性狀篩選及抗稻瘟病病基因Pi40篩選，選擇株高、生育期、豐產(chǎn)性等與吉粳88相似且含有抗病基因Pi40的F2單株50株；然后與感病親本吉粳88第一次回交，自交得到BC1F2，再進(jìn)行性狀篩選及抗病基因Pi40的篩選，選中性狀優(yōu)良且含有抗病基因Pi40的BC1F2單株50株；然后與感病親本吉粳88進(jìn)行第二次回交，自交得到BC2F2，再進(jìn)行性狀篩選及抗病基因Pi40的篩選，選中性狀優(yōu)良且含有抗病基因的BC2F2單株一部分自交加代，另一部分再與感病親本吉粳88進(jìn)行第三次回交，自交得到BC3F2,再進(jìn)行田間表型篩選及抗病基因Pi40的篩選，選擇性狀優(yōu)良且含有抗病基因的BC3F2單株進(jìn)行自交；BC2F2自交后代及BC3F2自交后代中，都進(jìn)行田間表型性狀篩選及抗病基因Pi40鑒定。到BC2F4及BC3F4，選擇含有抗病基因且表型優(yōu)良的株系，當(dāng)?shù)財(cái)U(kuò)繁、測(cè)產(chǎn)、考種及稻瘟病抗性總體鑒定，按照整個(gè)育種流程可以選育出抗稻瘟病的新品系。
[0017]實(shí)施例2:抗感單株DNA提取、PCR擴(kuò)增和電泳分析
[0018]一、DNA 提取(CTAB 法)
[0019]稱取0.1?0.2g水稻葉片并剪成Icm長(zhǎng)，放65 °C預(yù)熱過(guò)的提取液(1M TrisPH8.0, 10mM:5M Nacl, 1.0M EDTA，20mM:10% CTAB，2.0% ) 800 μ I 的離心管中。放入組織研磨儀中，頻率57.0ΗΖ，轉(zhuǎn)速1710Ν，震動(dòng)200S。65°C水浴30min，每1min輕巧搖動(dòng)均勻。加入等體積的酚氯仿/異戊醇(25: 24: I)，溫和搖動(dòng)，使成乳狀液。室溫下(溫度不低于15°C ), 12000r/min離心lOmin,取上清液。小心抽取上清液450 μ I,加入預(yù)冷的2倍體積的無(wú)水乙醇(或等體積的異戍醇)，-2(TC條件下放置20min以上，5000r/min離心5min,收集沉淀。70%乙醇洗滌沉淀I?2次。打開管蓋，放潔凈場(chǎng)所晾干，乳白色的DNA沉淀透明即可。最后加 100 μ I TE (Tris-HclI1mM, ΡΗ8.0 ；EDTAlmM, PH8.0)溶解沉淀，稀釋至100 μ g/ml, -20 °C 保存?zhèn)溆谩?br> [0020]二、PCR 擴(kuò)增:
[0021]1.PCR 反應(yīng)體系:2 X Taq PCR Master MixlO μ 1，10 μ M 的引物各 0.5 μ 1，10ug/ml 的模板 DNAl μ 1，ddH208 μ I。
[0022]2.PCR 反應(yīng)程序:95 °C 預(yù)變性 3min ；95°C 30s，65°C 30s, 72 °C lmin，循環(huán) 35 次；72°C 延伸 10min，4°C 保存。
[0023]三、PCR檢測(cè)
[0024]3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，加樣6μ I PCR產(chǎn)物，經(jīng)goldview染色，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。
[0025]實(shí)施例3:將含稻瘟病抗性基因Pi40的抗病品種NG13、感病品種吉粳88及抗感群體單株種植于稻瘟病高發(fā)區(qū)吉林省松原市，經(jīng)自然條件誘發(fā)稻瘟病，在苗期和成熟期分別進(jìn)行葉瘟和穗莖瘟的的抗性調(diào)查，統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)定。
[0026]1.葉瘟田間鑒定
[0027]葉瘟調(diào)查記載標(biāo)準(zhǔn):
[0028]O級(jí)無(wú)病.................................................................................高抗(HR)
[0029]I級(jí)病斑為針頭狀大小褐點(diǎn)............................................................抗(R)
[0030]2級(jí)稍大褐點(diǎn).................................................................................抗(R)
[0031]3級(jí)圓性至橢圓形的灰色病斑，邊緣褐色，病斑直徑約I?2毫米.........中抗(MR)
[0032]4級(jí)典型紡錘形病斑，長(zhǎng)I?2厘米，通常局限在二條葉脈之間，為害面積不超過(guò)葉面積的2%……中感(MS)
[0033]5級(jí)典型紡錘形病斑，為害面積不超過(guò)葉面積的10%........................中感(MS)
[0034]6級(jí)典型紡錘形病斑,為害面積10.1?25%.......................................感(S)
[0035]7級(jí)典型紡錘形病斑，為害面積25.1?50%.......................................感(S)
[0036]8級(jí)典型紡錘形病斑，為害面積50.1?75%....................................高感(HS)
[0037]9級(jí)全部葉片枯死.....................................................................高感(HS)
[0038]田間自然誘發(fā)后，對(duì)吉林省松原地區(qū)流行的稻瘟病葉瘟進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，稻瘟病抗性基因Pi40供體親本NG13及4號(hào)、6號(hào)、8號(hào)、12號(hào)抗病單株表現(xiàn)抗病(R)，而當(dāng)?shù)刂髟愿胁∑贩N吉粳88高感,3號(hào)、5號(hào)、7號(hào)、9號(hào)、10號(hào)、11號(hào)單株表現(xiàn)為感病(S)。
[0039]2.穗頸瘟田間鑒定
[0040]穗莖瘟病穗率評(píng)價(jià)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)
[0041]O級(jí)無(wú)病.................................................................................高抗(HR)
[0042]I級(jí)病穗率低于I?5%............................................................抗(R)
[0043]3級(jí)病穗率在5.1?10%............................................................中抗(MR)
[0044]5級(jí)病穗率在10.1?25%.........................................................中感(MS)
[0045]7級(jí)病穗率在25?50.....................................................................感(S)
[0046]9級(jí)病穗率在50.1?100%.........................................................高感(HS)
[0047]田間自然誘發(fā)后，對(duì)吉林省松原地區(qū)流行的稻瘟病穗頸瘟進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，稻瘟病抗性基因Pi40供體親本NG13及4號(hào)、6號(hào)、8號(hào)、12號(hào)抗病單株表現(xiàn)抗病(R)，而當(dāng)?shù)刂髟愿胁∑贩N吉粳88高感,3號(hào)、5號(hào)、7號(hào)、9號(hào)、10號(hào)、11號(hào)單株表現(xiàn)為感病(S)。
[0048]在苗期按實(shí)施例2所述方法提取基因組DNA，以Pl和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示:稻瘟病抗性基因Pi40供體親本NG13及抗病單株的帶型含200bp及120bp兩條帶，感病親本吉粳88及感病單株的帶型含250bp及200bp兩條帶。
[0049]由此得出，利用分子標(biāo)記P1、P2可以較好的鑒定稻瘟病抗性基因Pi40，含有Pi40基因的材料田間表現(xiàn)抗性較好，不含有Pi40基因的材料田間表現(xiàn)感病。
【權(quán)利要求】
1.分子標(biāo)記輔助選擇高抗稻瘟病材料的選育方法，其特征在于，包括以下步驟: 以含有稻瘟病抗性基因Pi40的水稻材料NG13為母本，常規(guī)感稻瘟病粳稻品種吉粳88為父本進(jìn)行雜交，后代進(jìn)行定向選擇，選擇農(nóng)藝性狀偏向粳稻品種吉粳88的后代單株，再利用分子標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)結(jié)合在稻瘟病高發(fā)區(qū)進(jìn)行田間抗病鑒定，選育出具有高抗稻瘟病的吉粳88的新品種。
2.如權(quán)利要求1所述的選育方法，其特征在于，步驟(I)所述的定向選擇利用含有稻瘟病抗性基因Pi40的水稻材料NG13與感病材料吉粳88雜交后先自交，自交F2代進(jìn)行性狀選擇及含稻瘟病抗性基因Pi40的單株檢測(cè)。選擇性狀優(yōu)良且含有抗病基因的F2單株再與感病粳稻品種吉粳88進(jìn)行一次回交，自交得到BC1F2，再進(jìn)行性狀選擇及含稻瘟病抗性基因Pi40的單株檢測(cè)。選擇性狀優(yōu)良且含有抗病基因Pi40的BC1F2單株再與感病粳稻品種吉粳88進(jìn)行二次回交，自交得到BC2F2，再進(jìn)行性狀選擇及含稻瘟病抗性基因Pi40的單株檢測(cè)。選擇性狀優(yōu)良且含有抗病基因的BC2F2單株一部分自交加代，另一部分再與感病粳稻品種吉粳88進(jìn)行三次回交，自交得到BC3F2，再進(jìn)行性狀選擇及含稻瘟病抗性基因Pi40的單株檢測(cè)。選擇性狀優(yōu)良且含有抗病基因的BC3F2單株進(jìn)行自交。BC2F2自交后代及BC3F2自交后代中，都進(jìn)行田間表型性狀選擇及抗病基因Pi40鑒定，選擇到BC2F4及BC3F4含有抗病基因表型優(yōu)良的株系，當(dāng)?shù)財(cái)U(kuò)繁、測(cè)產(chǎn)、考種及稻瘟病抗性鑒定。
【文檔編號(hào)】A01H1/02GK104170720SQ201310724928
【公開日】2014年12月3日 申請(qǐng)日期:2013年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月19日
【發(fā)明者】劉欣, 亓娜, 何廣生, 朱崴, 華澤田 申請(qǐng)人:國(guó)家粳稻工程技術(shù)研究中心, 天津天隆農(nóng)業(yè)科技有限公司