一種以雌蕊為外植體建立百合胚性愈傷再生體系的方法
【專利摘要】本發明涉及植物快速繁殖【技術領域】，旨在提供一種以雌蕊為外植體建立百合胚性愈傷再生體系的方法。該種方法包括步驟：材料采取、愈傷誘導培養基配置、外植體接種及愈傷組織誘導、小植株再生、小植株的繼代培養、小植株的出瓶種植。本發明突出具有污染率低、愈傷誘導率高、愈傷團塊大、愈傷胚性好、再生能力強、增殖率高的特點，特別對于本發明以幼嫩花苞中的雌蕊為外植體，污染率可降低為0，可獲得高達100%的愈傷誘導率，培養130天愈傷組織團塊直徑可達近1cm，愈傷團塊再生率100%，胚性高，總體上每個雌蕊可獲得10-40株小植株。
【專利說明】一種以雌蕊為外植體建立百合胚性愈傷再生體系的方法
【技術領域】
[0001]本發明是關于植物快速繁殖【技術領域】，特別涉及一種以雌蕊為外植體建立百合胚性愈傷再生體系的方法。
【背景技術】[0002]百合胚性愈傷組織再生體系相比其他再生體系如芽再生體系，具有最高的增殖率和擴繁率，對優良種質的保存有重要意義。此外，百合胚性愈傷組織再生體系也是百合遺傳轉化體系的決定性基礎，進而影響百合的基因工程改良。
[0003]目前建立百合愈傷再生體系多以田間鱗莖的鱗片為外植體，其缺陷是鱗莖由于長期處于土壤環境中，攜帶病菌多，使組織培養消毒要求嚴格，污染率較高。此外，當需要建立野生百合種質的實驗室離體體系時，以鱗莖為外植體，只能采用花期后挖取種球，其突出的不足有二:首先，野生百合位置的確定和種類的辨認很大程度是依靠醒目的花器官及其特征，花期后野生百合地上部分已全部或部分枯萎，尤其是花器官的衰敗和花被片脫落使其種類難以辨認，易造成種質資源的混淆；其次，挖取種球等同于對野生資源完全的采集，對于珍稀瀕危種類更是難以回復的破壞。

【發明內容】

[0004]本發明的主要目的在于克服現有技術中的不足，提供一種污染率低、愈傷誘導率高、愈傷團塊大、愈傷胚性好、再生能力強、增殖率高，且對種質資源的破壞小的建立百合胚性愈傷再生體系的方法。為解決上述技術問題，本發明的解決方案是:
[0005]提供一種以雌蕊為外植體建立百合胚性愈傷再生體系的方法，包括以下步驟:
[0006]步驟一:材料采取:
[0007]在百合花期，取百合長0.5~2.0cm的(幼嫩)花蕾，置于封口袋中在4攝氏度的冰箱中冷藏I周后，再進行后續操作；
[0008]步驟二:愈傷誘導培養基配置:
[0009]愈傷誘導培養基以MS培養基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養基，即采用每升純水中溶解4.43gMS粉作為愈傷誘導培養基溶液，愈傷誘導培養基溶液中還含有 30g/L 的鹿糖、5g/L 瓊脂、0.25mg/L6_ 節氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_ΒΑ)、0.25 ~1.5mg/L 的 2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic, 2，4-D),愈傷誘導培養基溶液的pH值為5.8 ；
[0010]將配置好的愈傷誘導培養基溶液滅菌后，在超凈工作臺上進行分裝，即將愈傷誘導培養基溶液倒入(玻璃或塑料)培養皿中，待愈傷誘導培養基溶液凝固成愈傷誘導培養基后，用保鮮膜或錫紙將至少一個盛有愈傷誘導培養基的培養皿包裹好，放在無菌潔凈環境(如組培室)下存放；
[0011]步驟三:外植體接種及愈傷組織誘導:
[0012]將步驟一中處理后的花蕾，在添加了洗滌精的自來水中浸泡5~30min，再在流水下沖洗0.5~2h清洗干凈，然后在超凈工作臺上進行消毒接種；
[0013]消毒方法如下:用添加了 0.1%ν/ν吐溫的l%w/v的次氯酸鈉(NaClO)溶液，將清洗干凈的花蕾進行表面消毒8~15min，然后用無菌水沖洗3遍；
[0014]消毒后進行接種:用鑷子和解剖刀將花蕾分開，將雌蕊從花蕾中剝離，切除柱頭，將切除了柱頭的雌蕊接種于步驟二中制作的盛有愈傷誘導培養基的培養皿上，其中，雌蕊的接種以接觸培養基表面為準；將接種了外植體的培養基在25攝氏度、黑暗條件下培養8~16天，出現愈傷組織團塊；
[0015]步驟四:小植株再生:
[0016]外植體在愈傷誘導培養基上培養120天，部分愈傷誘導培養基上培養的愈傷組織開始分化再生出完整的小植株，部分愈傷誘導培養基上培養的愈傷組織仍保持脫分化狀態；將外植體連同愈傷組織團塊、小植株轉接到新鮮的愈傷誘導培養基上，在完全黑暗條件下培養90~120天后，小植株大量分化，分化率95~100%，平均每個外植體上分化出10~40個小植株；在超凈工作臺上將小植株從愈傷組織團塊上分離下來，轉入繼代培養基培養;
[0017]小植株在繼代培養基上生長4周后(平均直徑達到Icm以上)，可不出瓶，繼續進行步驟五中的繼代培養以維持百合離體鱗莖再生體系，再進行步驟六中的出瓶種植，每4周繼代一次；也可直接進行步驟六中的出瓶種植；
[0018]所述繼代培養基以MS培養基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養基，即每升繼代培養基中添加有4.43gMS粉，繼代培養基中還含有60g/L的蔗糖、4~8g/L瓊月旨、O ~0.2mg/L6-節氛基腺嘿呤(6-benzyladenine, 6_BA)、0 ~0.2mg/L α -蔡乙酸(1-Naphthaleneacetic acid, NAA)，繼代培養基的pH值為5.8 ; ( α-萘乙酸不是必需的，但一定濃度的萘乙酸將有利于小植株根系生長，6-芐氨基腺嘌呤不是必需的，但一定濃度的6-芐氨基腺嘌呤將有利于小植株增殖)
[0019]步驟五:小植株的繼代培養:
[0020]步驟四中的小植株在繼代培養基上生長4周后(平均直徑達到Icm以上)，不出瓶，進行繼代的方法是:小植株在繼代培養基上生長，基生根生長健壯，根部上端轉綠后，進行小植株的轉接；轉接 方法是:在超凈工作臺上，將小植株取出，將其根全部切除，葉片也從基部切除，僅保留小鱗莖和少量鱗莖盤，將小鱗莖轉接到新鮮的繼代培養基上，繼續步驟四的培養；
[0021]步驟六:小植株的出瓶種植:
[0022]出瓶前進行低溫鍛煉，將組培容器中的繼代培養基上培養的小植株，在I~5攝氏度、黑暗條件下進行30~50天的低溫處理；低溫處理后，將組培容器中的小植株整個取出，在流水下沖洗，洗凈根部的培養基，再將小植株放入網兜中，在多菌靈1000倍溶液中浸泡消毒15~30min,然后種入育苗專用介質(如Custom growing mix, Fafard)中，小植株種入育苗專用介質中的深度在I~2cm范圍內，即小鱗莖頂端距土表一球高左右，進行栽培管理，即完成百合胚性愈傷再生體系的建立。
[0023]提供一種以雌蕊為外植體建立百合胚性愈傷遺傳轉化體系的方法，將步驟三中誘導獲得的愈傷組織團塊切下或用鑷子夾下來，作為遺傳轉化體系的受體，經農桿菌轉染或基因槍介導轉化，經過篩選和鑒定，并在再生培養基上分化生根、煉苗、移栽獲得百合的轉基因植株；
[0024]再生培養基以MS培養基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養基，即每升再生培養基添加4.43gMS粉，再生培養基中還含有30~60g/L的蔗糖、4~8g/L瓊脂、O~
2.0mg/L α -蔡乙酸(1-Naphthaleneacetic acid, NAA),再生培養基的 pH 值為 5.8 ~6.0。
[0025]本發明提供的上述方法可以用于百合愈傷組織再生體系和遺傳轉化體系中，具體為:對上述方法獲得的愈傷組織進行繼代培養后分切成小塊，接種到相應繼代培養基上培養；用該愈傷組織在再生培養基上分化生根，煉苗、移栽即可獲得百合的組織培養植株；或將該愈傷組織作為遺傳轉化體系的受體，在再生培養基上分化生根，煉苗、移栽即可獲得百合的轉基因植株。
[0026]與現有技術相比，本發明的有益效果是:
[0027]本發明以百合雌蕊為外植體，具有污染率低、材料易得的特點，其突出的優勢在于體系高效率、外植體幼嫩、少病毒。對于野生百合的種質資源保存來說，在百合花期取得適量雌蕊用于建立實驗室愈傷再生體系，而不是花期后挖取種球，以雌蕊特點更容易確認野生百合的種類，并極大地減少了對野生種質資源的破壞。本發明還突出具有污染率低、愈傷誘導率高、愈傷團塊大、愈傷胚性好、再生能力強、增殖率高的特點，特別對于本發明以幼嫩花苞中的雌蕊為外植體，污染率可降低為O，可獲得高達100%的愈傷誘導率，培養130天愈傷組織團塊直徑可達近1cm，愈傷團塊再生率100%，胚性高，總體上每個雌蕊可獲得10-40株小植株。
【具體實施方式】
[0028]下面結合【具體實施方式】對本發明作進一步詳細描述:
[0029]一種以雌蕊為外植體建立百合胚性愈傷再生體系的方法，包括以下步驟:
[0030]步驟一:材料采取:
[0031]在百合花期，取百合長0.5~2.0cm的幼嫩花蕾，置于封口袋中在4攝氏度的冰箱中冷藏I周后，再進行后續操作。
[0032]步驟二:愈傷誘導培養基配置:
[0033]愈傷誘導培養基以MS培養基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養基，即采用每升純水中溶解4.43gMS粉作為愈傷誘導培養基溶液，愈傷誘導培養基溶液中還含有 30g/L 的鹿糖、5g/L 瓊脂、0.25mg/L6_ 節氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_ΒΑ)、0.25 ~
1.5mg/L 的 2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic, 2, 4-D);愈傷誘導培養基溶液的pH值為5.8。
[0034]將配置好的愈傷誘導培養基溶液滅菌后，在超凈工作臺上進行分裝，即將愈傷誘導培養基溶液倒入玻璃或塑料的培養皿中，待愈傷誘導培養基溶液凝固成愈傷誘導培養基后，用保鮮膜或錫紙將至少一個盛有愈傷誘導培養基的培養皿包裹好，放在組培室或其他無菌潔凈環境下存放。
[0035]步驟三:外植體接種及愈傷組織誘導:
[0036]將步驟一中處理后的花蕾，在添加了洗滌精的自來水中浸泡5~30min，再在流水下沖洗0.5~2h清洗干凈，然后在超凈工作臺上進行消毒接種；
[0037]消毒方法如下:用添加了 0.1%ν/ν吐溫的l%w/v的次氯酸鈉(NaClO)溶液，將清洗干凈的花蕾進行表面消毒8~15min，然后用無菌水沖洗3遍；
[0038]消毒后進行接種:用鑷子和解剖刀將花蕾分開，將雌蕊從花蕾中剝離，切除柱頭，將切除了柱頭的雌蕊接種于步驟二中制作的盛有愈傷誘導培養基的培養皿上，其中，雌蕊的接種以接觸培養基表面為準。將接種了外植體的培養基在25攝氏度、黑暗條件下培養8~16天，出現愈傷組織團塊。
[0039]步驟四:小植株再生:
[0040]外植體在愈傷誘導培養基上生長120天后，部分愈傷誘導培養基上培養的愈傷組織開始分化再生出完整的小植株，部分愈傷誘導培養基上培養的愈傷組織仍保持脫分化狀態。將外植體連同愈傷組織團塊、小植株轉接到新鮮的愈傷誘導培養基上，在完全黑暗條件下培養90~120天后，小植株大量分化，分化率95-100%，平均每個外植體上分化出10-40個小植株。在超凈工作臺上將小植株從愈傷組織團塊上分離下來，轉入繼代培養基；
[0041]小植株在繼代培養基上生長4周后，平均直徑達到Icm以上，可不出瓶，繼續進行步驟五中的繼代培養以維持百合離體鱗莖再生體系，再進行步驟六中的出瓶種植，每4周繼代一次；也可直接進行步驟六中的出瓶種植。
[0042]所述繼代培養基以MS培養基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養基，即每升繼代培養基中添加有4.43gMS粉，繼代培養基中還含有60g/L的蔗糖、4~8g/L瓊月旨、O ~0.2mg/L6-節氛基腺嘿呤(6-benzyladenine, 6_BA)、0 ~0.2mg/L α -蔡乙酸(1-Naphthaleneacetic acid, NAA)，繼代培養基的pH值為5.8。其中，α-萘乙酸不是必需的，但一定濃度的萘乙酸將有利于小植株根系生長，6-芐氨基腺嘌呤不是必需的，但一定濃度的6-芐氨基腺嘌呤將有利于小植株增殖。
[0043]步驟五:小植 株的繼代培養:
[0044]步驟四中的小植株在繼代培養基上生長4周后，平均直徑達到Icm以上，不出瓶，進行繼代的方法是:小植株在繼代培養基上生長，基生根生長健壯，根部上端轉綠后，進行小植株的轉接；轉接方法是:在超凈工作臺上，將小植株取出，將其根全部切除，葉片也從基部切除，僅保留小鱗莖和少量鱗莖盤，將小鱗莖轉接到新鮮的繼代培養基上，繼續步驟四的培養。
[0045]步驟六:小植株的出瓶種植:
[0046]出瓶前進行低溫鍛煉，將組培容器中的繼代培養基上培養的小植株，在I~5攝氏度、黑暗條件下進行30~50天的低溫處理；低溫處理后，將組培容器中的小植株整個取出，在流水下沖洗，洗凈根部的培養基，再將小植株放入網兜中，在多菌靈1000倍溶液中浸泡消毒15~30min,然后種入育苗專用介質(如Custom growing mix, Fafard)中，小植株種入育苗專用介質中的深度在I~2cm范圍內，即小鱗莖頂端距土表一球高左右，進行栽培管理，即完成百合胚性愈傷再生體系的建立。
[0047]下面的實施例可以使本專業的專業技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。
[0048]實施例1以東方百合‘索邦’雌蕊為外植體建立百合胚性愈傷再生體系
[0049](I)花蕾期取1.7cm長的百合幼嫩花荀,帶長Icm的花梗,在封口袋中冷藏于4攝氏度冰箱中，冷藏一周后取出進行處理。
[0050](2)將花苞在添加了洗滌精的自來水中浸泡30min，在流水下沖洗75min，清洗干凈后，在超凈工作臺上用添加了 0.1%ν/ν吐溫的l%w/v次氯酸鈉溶液，進行表面消毒8min，然后用無菌水沖洗3遍。將雌蕊從花蕾中剝離，切除柱頭，接種于步驟二中制作的盛有愈傷誘導培養基的培養皿上，其中，雌蕊的接種以接觸培養基表面為準；將接種了外植體的培養基在25攝氏度、黑暗條件下培養8天，出現愈傷組織團塊，污染率為O。愈傷組織誘導率達96%。
[0051]愈傷誘導培養基以MS培養基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養基，即米用每升純水中溶解4.43gMS粉作為愈傷誘導培養基溶液，愈傷誘導培養基溶液中還含有30g/L 的鹿糖、5g/L 瓊脂、0.25mg/L6-節氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_BA)、1.5mg/L 的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic, 2，4-D);愈傷誘導培養基溶液的pH值為5.8。
[0052]愈傷團塊若在愈傷誘導培養基上培養130天后直徑最大可達9.81mm。其中，愈傷團塊大小以游標卡尺測量，由于愈傷團塊近球形或長寬相等，故以其直徑作為愈傷團塊大小衡量標準，并伴隨著小植株的分化。
[0053](3)外植體在愈傷誘導培養基上生長120天后，開始分化出小植株。將外植體連同愈傷組織團塊、小植株一起在超凈工作臺上轉接到柱形瓶中的新鮮愈傷誘導培養基上，在黑暗條件下培養90天，繼續分化出大量小植株，平均每塊外植體可分化出25棵小植株，分化率為100%。在超凈工作臺上將小植株從外植體上分離下來，轉接到新鮮的繼代培養基上，在照度為18001uX、12h光照/12h黑暗的光照條件下，進行繼代培養。
[0054]繼代培養基以MS培養基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養基，即每升繼代培養基添加4.43gMS粉，繼代培養基中還含有60g/L的蔗糖、8g/L瓊脂，繼代培養基的pH值為5.8。
[0055](4)步驟(3)中的小植株在繼代培養基上生長4周，鱗莖平均直徑達到Icm以上，小植株直接進行出瓶種植。將繼代培養基上的小植株置于5攝氏度黑暗條件下進行低溫處理40天；將組培容器中的小植株整個取出，在流水下沖洗，洗凈根部的培養基，再將小植株放入網兜中，在多菌靈1000倍溶液中浸泡消毒25min，然后種入育苗專用介質(Customgrowing mix, Fafard)中，小植株種入育苗基質中的深度在Icm,進行栽培管理。小植株生長健壯，存活率100%。該體系增殖效率達到1:25，即平均每塊外植體最終產生25棵小植株。
[0056]實施例2以東方百合‘索邦’雌蕊為外植體建立百合胚性愈傷再生體系
[0057](I)花蕾期取2cm長的百合幼嫩花荀,帶1.5 cm長度的花梗,封在口袋中冷藏于4攝氏度冰箱冷藏一周后，再進行后續操作。
[0058](2)將花苞在添加了洗滌精的自來水中浸泡18min，在流水下沖洗30min，清洗干凈后，在超凈工作臺上用添加了 0.1% (v/v)吐溫的l%(w/v)次氯酸鈉溶液進行表面消毒12min，然后用無菌水沖洗3遍。將雌蕊從花蕾中剝離，切除柱頭，接種于步驟二中制作的盛有愈傷誘導培養基的培養皿上，其中，雌蕊的接種以接觸培養基表面為準；將接種了外植體的培養基在25攝氏度、黑暗條件下培養13天，出現愈傷組織團塊，污染率為O。愈傷組織誘導率達88.7%。
[0059]愈傷誘導培養基以MS培養基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養基，即米用每升純水中溶解4.43gMS粉作為愈傷誘導培養基溶液，愈傷誘導培養基溶液中還含有30g/L 的鹿糖、5g/L 瓊脂、0.25mg/L6-節氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_BA)、0.5mg/L 的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic, 2，4_D);愈傷誘導培養基溶液的pH值為5.8。
[0060]愈傷團塊若在愈傷誘導培養基上培養130天后直徑最大可達6.85mm。其中，愈傷團塊大小以游標卡尺測量，由于愈傷團塊近球形或長寬相等，故以其直徑作為愈傷團塊大小衡量標準，并伴隨著小植株的分化。
[0061](3)外植體在愈傷誘導培養基上生長120天后，開始分化出小植株。將外植體連同愈傷組織團塊、小植株一起在超凈工作臺上轉接到柱形瓶中的新鮮愈傷誘導培養基上，在黑暗條件下培養120天后，小植株大量分化，分化率97%，平均每個外植體上分化出40個小植株；將小植株從外植體上分離下來，在照度為18001uX、12h光照/12h黑暗的光照條件下進行繼代培養。
[0062]繼代培養基以MS培養基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養基，即每升繼代培養基添加4.43gMS粉，繼代培養基中還含有60g/L的蔗糖、6g/L瓊脂、0.1mg/L6-節氛基腺嘿呤(6-benzyladenine, 6_BA)、0.lmg/L α _ 蔡乙酸(1-Naphthaleneaceticacid, NAA),繼代培養基的pH值為5.8。
[0063](5)步驟(3)中的小植株在繼代培養基上生長4周，鱗莖平均直徑在1.4cm，達到Icm以上，對小植株直接進行出瓶種植。將繼代培養基上的小植株置于4攝氏度黑暗條件下進行低溫處理50天；將組培容器中的小植株整個取出，在流水下沖洗，洗凈根部的培養基，再將小植株放入網兜中，在多菌靈1000倍溶液中浸泡消毒30min，然后種入育苗專用介質(Custom growing mix, Fafard)中，小植株種入育苗基質中的深度在2cm,進行栽培管理。小植株生長健壯。總體上，該體系增殖效率達到1:18，即平均每塊外植體最終產生18棵小植株。
[0064]實施例3以東方百合‘索邦’雌蕊為外植體建立百合胚性愈傷再生體系
[0065](I)花蕾期取Icm長的百合幼嫩花荀,帶1.3 cm長度的花梗,封在口袋中冷藏于4攝氏度冰箱，冷藏一周后取出外植體進行處理。
[0066](2)將花苞在添加了洗滌精的自來水中浸泡5min，在流水下沖洗120min，清洗干凈后，在超凈工作臺上用添加了 0.1% (v/v)吐溫的1% (w/v)次氯酸鈉溶液進行表面消毒15min，然后用無菌水沖洗3遍。將雌蕊從花蕾中剝離，切除柱頭，接種于步驟二中制作的盛有愈傷誘導培養基的培養皿上，其中，雌蕊的接種以接觸培養基表面為準；將接種了外植體的培養基在25攝氏度、黑暗條件下培養16天，出現愈傷組織團塊，污染率為O。愈傷組織誘導率達81.7%。
[0067]愈傷誘導培養基以MS培養基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養基，即米用每升純水中溶解4.43gMS粉作為愈傷誘導培養基溶液，愈傷誘導培養基溶液中還含有30g/L 的鹿糖、5g/L瓊脂、0 .25mg/L6_節氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_BA)、0.25mg/L 的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic, 2，4-D);愈傷誘導培養基溶液的pH值為5.8。
[0068]愈傷團塊若在愈傷誘導培養基上培養130天后，直徑最大可達7.0Omm0其中，愈傷團塊大小以游標卡尺測量，由于愈傷團塊近球形或長寬相等，故以其直徑作為愈傷團塊大小衡量標準，并伴隨著小植株的分化。
[0069](3)外植體在愈傷誘導培養基上生長120天后，開始分化出小植株。將外植體連同愈傷組織團塊、小植株一起在超凈工作臺上轉接到柱形瓶中的新鮮愈傷誘導培養基上，在黑暗條件下培養100天后，小植株大量分化，分化率95%，平均每個外植體上分化出10個小植株；在超凈工作臺上將小植株從外植體上分離下來，在照度為18001ux、12h光照/12h黑暗的光照條件下進行繼代培養。
[0070]繼代培養基以MS培養基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養基，即每升繼代培養基添加4.43gMS粉，繼代培養基以MS培養基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養基，即每升繼代培養基添加4.43gMS粉，繼代培養基中還含有60g/L的蔗糖、4g/L 瓊月旨、0.2mg/L6-節氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_BA)、0.2mg/L α -萘乙酸(1-Naphthaleneacetic acid, NAA),繼代培養基的 pH 值為 5.8。
[0071](4)步驟(3)中的小植株在繼代培養基上生長4周，鱗莖平均直徑在1.3cm，達到Icm以上，對小植株直接進行出瓶種植。將繼代培養基上的小植株置于I攝氏度黑暗條件下進行低溫處理30天；將組培容器中的小植株整個取出，在流水下沖洗，洗凈根部的培養基，再將小植株放入網兜中，在多菌靈1000倍溶液中浸泡消毒15min，然后種入育苗專用介質(Custom growing mix, Fafard)中，小植株種入育苗基質中的深度在1.5cm,進行栽培管理。小植株生長健壯，存活率100%。該體系增殖效率達到1:10，即平均每塊外植體最終產生10棵小植株。
[0072]實施例4以東方百合‘索邦’雌蕊為外植體建立百合胚性愈傷再生體系
[0073](1)花蕾期取0.5cm長的百合幼嫩花苞，帶1.3cm長度的花梗，封在口袋中冷藏于4攝氏度冰箱，冷藏一周后取出外植體進行處理。
[0074](2)將花苞在添加了洗滌精的自來水中浸泡5min，在流水下沖洗120min，清洗干凈后，在超凈工作臺上用添加了 0.1% (v/v)吐溫的1% (w/v)次氯酸鈉溶液進行表面消毒15min，然后用無菌水沖洗3遍。將雌蕊從花蕾中剝離，切除柱頭，接種于步驟二中制作的盛有愈傷誘導培養基的培養皿上，其中，雌蕊的接種以接觸培養基表面為準；將接種了外植體的培養基在25攝氏度、黑暗條件下培養16天，出現愈傷組織團塊，污染率為O。愈傷組織誘導率達81.7%。
[0075]愈傷誘導培養基以MS培養基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養基，即米用每升純水中溶解4.43gMS粉作為愈傷誘導培養基溶液，愈傷誘導培養基溶液中還含有30g/L 的鹿糖、5g/L瓊脂、0.25mg/L6_節氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_BA)、0.25mg/L 的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic, 2，4-D);愈傷誘導培養基溶液的pH值為5.8。
[0076]愈傷團塊若在愈傷誘導培養基上培養130天后，直徑最大可達7.0Omm0其中，愈傷團塊大小以游標卡尺測量，由于愈傷團塊近球形或長寬相等，故以其直徑作為愈傷團塊大小衡量標準，并伴隨著小植株的分化。
[0077](3)外植體在愈傷誘導培養基上生長120天后，開始分化出小植株。將外植體連同愈傷組織團塊、小植株一起在超凈工作臺上轉接到柱形瓶中的新鮮愈傷誘導培養基上，在黑暗條件下培養100天后，小植株大量分化，分化率95%，平均每個外植體上分化出10個小植株；在超凈工作臺上將小植株從外植體上分離下來，在照度為18001ux、12h光照/12h黑暗的光照條件下進行繼代培養。
[0078]繼代培養基以MS培養基(Murashige and Skoogj 1962)為基本培養基，即每升繼代培養基添加4.43gMS粉，繼代培養基以MS培養基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養基，即每升繼代培養基添加4.43gMS粉，繼代培養基中還含有60g/L的蔗糖、4g/L 瓊月旨、0.2mg/L6-節氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_BA)、0.2mg/L α -萘乙酸(1-Naphthaleneacetic acid, NAA),繼代培養基的 pH 值為 5.8。
[0079](4)步驟(3)中的小植株在繼代培養基上生長4周，鱗莖平均直徑在1.3cm，達到Icm以上，部分小植株不出瓶，繼續維持百合離體鱗莖再生體系，進行繼代的方法是:小植株在繼代培養基上生長，基生根生長健壯，根部上端轉綠后，進行小植株的轉接；轉接方法是:在超凈工作臺上，將小植株取出，將其根全部切除，葉片也從基部切除，僅保留小鱗莖和少量鱗莖盤，將小鱗莖轉接到按步驟(3)配置的新鮮的繼代培養基上；
[0080](5)步驟(4)中的小鱗莖在繼代培養基上再生出小植株，對再生出的小植株進行出瓶種植。將繼代培養基上的小植株置于I攝氏度黑暗條件下進行低溫處理30天；將組培容器中的小植株整個取出，在流水下沖洗，洗凈根部的培養基，再將小植株放入網3?中，在多菌靈1000倍溶液中浸泡消毒15min,然后種入育苗專用介質(Custom growingmix, Fafard)中，小植株種入育苗基質中的深度在1.5cm，進行栽培管理。小植株生長健壯，存活率100%。該體系增殖效率達到1:10，即平均每塊外植體最終產生10棵小植株。
[0081]最后，需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有很多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容中直接導出或聯想到的所有變形，均應認`為是本發明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種以雌蕊為外植體建立百合胚性愈傷再生體系的方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟一:材料采取: 在百合花期，取百合長0.5~2.0cm的花蕾，置于封口袋中在4攝氏度的冰箱中冷藏I周后，再進行后續操作； 步驟二:愈傷誘導培養基配置: 愈傷誘導培養基以MS培養基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養基，即米用每升純水中溶解4.43gMS粉作為愈傷誘導培養基溶液，愈傷誘導培養基溶液中還含有30g/L的鹿糖、5g/L 瓊脂、0.25mg/L6_ 節氨基腺嘌呤(6-benzyladenine, 6_ΒΑ)、0.25 ~1.5mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic, 2，4_D),愈傷誘導培養基溶液的pH值為 5.8 ; 將配置好的愈傷誘導培養基溶液滅菌后，在超凈工作臺上進行分裝，即將愈傷誘導培養基溶液倒入培養皿中，待愈傷誘導培養基溶液凝固成愈傷誘導培養基后，用保鮮膜或錫紙將至少一個盛有愈傷誘導培養基的培養皿包裹好，放在無菌潔凈環境下存放； 步驟三:外植體接種及愈傷組織誘導: 將步驟一中處理后的花蕾，在添加了洗滌精的自來水中浸泡5~30min，再在流水下沖洗0.5~2h清洗干凈，然后在超凈工作臺上進行消毒接種； 消毒方法如下:用添加了 0.1%ν/ν吐溫的l%w/v的次氯酸鈉(NaClO)溶液，將清洗干凈的花蕾進行表面消毒8~15min，然后用無菌水沖洗3遍； 消毒后進行接種:用鑷子和解剖刀將花蕾分開，將雌蕊從花蕾中剝離，切除柱頭，將切除了柱頭的雌蕊接種于步驟二中制作的盛有愈傷誘導培養基的培養皿上，其中，雌蕊的接種以接觸培養基表面為準；將接種了外植體的培養基在25攝氏度、黑暗條件下培養8~16天，出現愈傷組織團塊； 步驟四:小植株再生: 外植體在愈傷誘導培養基上培養120天，部分愈傷誘導培養基上培養的愈傷組織開始分化再生出完整的小植株，部分愈傷誘導培養基上培養的愈傷組織仍保持脫分化狀態；將外植體連同愈傷組織團塊、小植株轉接到新鮮的愈傷誘導培養基上，在完全黑暗條件下培養90~120天后，小植株大量分化，分化率95~100%，平均每個外植體上分化出10~40個小植株；在超凈工作臺上將小植株從愈傷組織團塊上分離下來，轉入繼代培養基培養；小植株在繼代培養基上生長4周后，可不出瓶，繼續進行步驟五中的繼代培養以維持百合離體鱗莖再生體系，再進行步驟六中的出瓶種植，每4周繼代一次；也可直接進行步驟六中的出瓶種植； 所述繼代培養基以MS培養基(Murashige and Skoog, 1962)為基本培養基，即每升繼代培養基中添加有4.43gMS粉，繼代培養基中還含有60g/L的蔗糖、4~8g/L瓊月旨、O ~0.2mg/L6-節氛基腺嘿呤(6-benzyladenine, 6_BA)、0 ~0.2mg/L α -蔡乙酸(1-Naphthaleneacetic acid, NAA),繼代培養基的 pH 值為 5.8 ； 步驟五:小植株的繼代培養: 步驟四中的小植株在繼代培養基上生長4周后，不出瓶，進行繼代的方法是:小植株在繼代培養基上生長，基生根生長健壯，根部上端轉綠后，進行小植株的轉接；轉接方法是:在超凈工作臺上，將小植株取出，將其根全部切除，葉片也從基部切除，僅保留小鱗莖和少量鱗莖盤，將小鱗莖轉接到新鮮的繼代培養基上，繼續步驟四的培養； 步驟六:小植株的出瓶種植: 出瓶前進行低溫鍛煉，將組培容器中的繼代培養基上培養的小植株，在I~5攝氏度、黑暗條件下進行30~50天的低溫處理；低溫處理后，將組培容器中的小植株整個取出，在流水下沖洗，洗凈根部的培養基，再將小植株放入網兜中，在多菌靈1000倍溶液中浸泡消毒15~30min，然后種入育苗專用介質(如Custom growing mix, Fafard)中，小植株種入育苗專用介質中的深度在I~2cm范圍內，即小鱗莖頂端距土表一球高左右，進行栽培管理，即完成百合胚性愈傷再生體 系的建立。
【文檔編號】A01H4/00GK103798138SQ201410037331
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年1月26日 優先權日:2014年1月26日
【發明者】張琳, 夏宜平, 張夏菲, 馬怡迪, 杜方, 吳昀 申請人:浙江大學