百合未受精子房離體培養的方法
【專利摘要】本發明百合未受精子房離體培養的方法，屬于植物單倍體培養【技術領域】。本發明方法采用以開花前1天的花蕾為試材，滅菌后取其子房，將其橫切成片，之后將子房切片接種在BDS誘導培養基上，誘導胚胎發生，獲得了較高頻率的成胚率，平均每個子房含有108～223個胚性胚珠。之后再將誘導的子房切片轉接在BDS再生培養基上通過胚胎發生途徑得到單倍體、二倍體、非整倍體等其它倍性的再生植株。本發明方法對加快百合育種、種質創新和遺傳學基礎研究具有重要意義。
【專利說明】百合未受精子房離體培養的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物單倍體培養【技術領域】，具體涉及通過百合未受精子房培養獲得單倍體等新材料的一種組織培養方法。
【背景技術】
[0002]百合(Lilium)是重要的觀賞和食用植物。現代觀賞百合大部分為遠緣雜交的后代，等位基因雜合，遺傳背景復雜，使得許多重要性狀如花色、抗病蟲性等遺傳異常復雜。因而，在常規雜交育種中，對重要育種目標性狀的遺傳缺乏可預測性，加之生育周期長達3年以上，難以高效定向的優化聚合優良遺傳基因。而利用單倍體培養技術可以在短時間內獲得等位基因純和的個體，這樣就大大簡化了遺傳背景，利于進行重要性狀的遺傳分析，以便于在雜交育種中提高目標性狀遺傳的可預測性，有目的性地進行雜交育種工作，縮短育種年限，對提高新品種選育效率具有重要作用。同時，隱性性狀得以表達，豐富了育種資源。獲得的單倍體還可應用于基因轉化、誘變、突變體篩選等研究中，為種質資源創新提供了一種快捷有效的新途徑。此外，獲得的單倍體經過加倍所建立的雙單倍體群體也是進行分子標記、遺傳圖譜構建、基因定位等研究的理想材料。因此，對百合單倍體培養技術進行研究，對加快百合的遺傳學基礎研究、提高百合的育種效率和育種水平具有重要意義。
[0003]未受精子房或胚珠離體培養是人工誘導雌核發育形成單倍體和雙單倍體的技術之一。此技術尤其適用于雄性不育的植物，以及通過雄核發育難以獲得單倍體的植物。來源于雌配子的單倍體最早在曼陀羅(Datura stramonium)中被發現(Blakeslee AF, BellingJ, Farnham ME and Bergner AD.A haploid mutant in the Jimson weed, ‘Daturastramonium，.Science, 1922, 55:646-647.)。這種自發的單倍體隨后在其它植物(煙草、水稻、玉米、大麥和蕓薹屬作物)中也被發現，但是自發頻率很低(Palmer CE and KellerWA.0verview of haploid.1n!Biotechnology in agriculture and forestry, Vol.56.Nagata Tj Lorz H and Widtholm JM(eds).Springer, Berlin Heidelberg, 2005, pp3-10.)。因此，各國的研究學者對體外誘導雌核單倍體植株產生的方法進行了研究，于1976年首次利用大麥未授粉子房培養出單倍體植株(San Noeum LH.Haploides d’ hordeum vuIgareLpar culture in vitro non fecondes.Ann Amelior Plant，1976，26:751-754.)。之后未授粉子房或胚珠離體培養相繼在約30個物種(如:大麥、小麥、水稻、玉米、洋蔥、黃瓜、南瓜、甜菜、向日葵等)上獲得了成功(Bohanec B.Doubled haploids in gynogenesis.1n!Advances in Haploid Production in Higher Plants.Touraev A，Forster BPand Moha S (eds).Springer, United Kingdom，2009，pp35_46.)。目前，這項技術已在洋蔥和甜菜的育種中得以應用。而在百合中，未授粉子房或胚珠離體培養的研究相對甚少。谷祝平和鄭國鎦(1983)在‘大衛百合’中以1.2~1.8cm長的花蕾為試材進行未授粉子房離體培養主要通過愈傷途徑獲得了單倍體植株，MS培養基的愈傷誘導率高于N6培養基，當2，4-D和6-BA均為4mg.L—1時，MS愈傷誘導率最高為47.76%。Prakash和 Giles (Prakash J and Giles KL.Production of doubled haploids in orientallilies.1n:Genetic Manipulation in Plant Breeding.De Gruyter W and Co (eds).Berlin-New York, 1986，pp335_337.)以1/2MS培養基為基礎培養基并以2.0cm長的花蕾為試材利用子房切片培養在東方百合‘Leraza’中通過胚胎途徑獲得了少量雌核再生植株。Ramsay 等(Ramsay JL, Galitz DS and Lee CW.Basal medium and sucroseconcentration influence regeneration of Easter Lily in ovary culture.HortScience, 2003, 38:404-409.)以3~5cm花蕾長的鐵炮百合‘Ace’為試材，采用切片培養通過愈傷途徑獲得了再生植株,此研究還表明MS培養基愈傷誘導率高于B5培養基，培養基中適合的蔗糖濃度是5%。趙捃(趙捃.百合未授粉子房離體培養及胚胎學研究.沈陽農業大學碩士論文，2007.)以OT品種‘黃巨人’的單核小孢子發育時期對應的子房為試材，采用MS誘導培養基通過愈傷途徑獲得了較低頻率的單倍體(5.26%)和非整倍體(7.89%)。上述研究結果表明，到目前為止百合未授粉子房離體培養僅在少數幾個基因型中獲得成功，尤其是缺乏性狀優良基因型培養成功的報道；大多數是采用MS培養基作為誘導培養基；在試驗中三種基因型所選用的花蕾長度不一致；大多數是通過愈傷途徑獲得再生植株，其中單倍體頻率低。此外，通過愈傷途徑獲得的二倍體再生植株，其有可能起源于體細胞，上述研究工作都缺乏對二倍體起源進行鑒定。

【發明內容】

[0004]針對上述技術現狀，本發明提供較為完善的百合未受精子房培養技術體系，以提高胚胎誘導率，通過胚胎誘導途徑獲得再生植株，對加快百合育種、種質創新和遺傳學基礎研究具有重要意義。
[0005]本發明具體技術方案:百合未受精子房離體培養的方法包括如下步驟:
[0006]( I)選取合適的花蕾，滅菌；
[0007](2)取出子房，將其橫切成片；
[0008](3)將子房切片接種在含有誘導培養基的三角瓶或培養皿中培養20~25d，誘導胚珠內胚胎形成；
[0009](4)將含有誘導膨大胚珠的子房片轉接在植株再生培養基中，誘導胚胎萌發進行植株再生；
[0010](5)將再生植株轉接到生根培養中進行生根15~20d，獲得根系健壯的無菌組培苗；
[0011]所述的合適花蕾為開花前I天的花蕾，
[0012]所述誘導培養基:BDS+2,4-D2mg/L+6-BA2mg/L+ 蔗糖 100g.L-1+ 瓊脂 6g.?ΛρΗ6.0;植株再生培養基為BDS+蔗糖50g.L—1+瓊脂6g.L—1，pH6.0 ;生根培養基為1/2MS++IBA0.lmg.L ^NAA0.lmg.L:+ 鹿糖 60g.L:+ 瓊脂 6g.L \ pH6.0。
[0013]所述培養條件:光照16001x、14h白天/IOh黑夜，(25±1) °C條件下進行培養。
[0014]所述再生培養時間為80~100d。
[0015]所述滅菌采取如下順序步驟:將百合花蕾，置于無菌瓶中，先用75%的酒精表面滅菌30s，之后用10%NaC10消毒lOmin，然后無菌水沖洗3次，每次3分鐘。
[0016]所述切片厚度為I~2mm。
[0017]所述方法還包括再生植株的倍性鑒定步驟。[0018]所述倍性鑒定方法采用根尖染色體計數法:切取3~8mm根尖置于0.TmmoF1放線菌酮中250C預處理8~9h，然后放入卡諾氏固定液中固定24h，用蒸餾水洗凈后，用Imol.T1HCl在60°C水浴條件下解離lOmin，蒸餾水漂洗2_3次，然后用卡寶品紅染色制作壓片，于顯微鏡下進行染色體觀察，選取分散良好的中期分裂細胞進行顯微拍照，每份材料觀察30個處于有絲分裂中期的細胞，統計染色體數目，確定染色體倍性水平。
[0019]所述顯微鏡的型號為Olympus CX31。
[0020]本發明方法是以開花前I天的花蕾為最佳外植體進行取樣，采用BDS培養基進行誘導培養(圖1)，相對以小花蕾為外植體、以MS培養基為誘導培養基的方法，獲得了較高頻率的胚胎誘導率，平均每個子房含有108~223個胚性胚珠。將切片子房誘導20~25d后轉入植株再生培養基中進行誘導胚胎萌發再生成植株，避免了愈傷途徑發生，從而也避免了體細胞植株的再生。通過胚胎發生途徑在其中5個供試材料上獲得了再生植株(圖2)。經染色體計數法進行倍性鑒定，在二倍體母體材料上獲得的再生植株群體是由單倍體、二倍體和非整倍體組成，在三倍體母體材料上獲得的再生植株群體均是由非整倍體組成。(圖3)。
[0021]本發明的有益效果:
[0022](I)BDS培養基優于CBM和MS，在7個供試基因型上，BDS培養基誘導的胚性胚珠數均顯著高于MS (表1);而且，在CBM和MS培養基上的胚珠較易出現褐化和玻璃化現象。MS培養基中含有較高濃度的銨態氮、硝態氮和鈣離子，尤其是銨態氮，高氮和高鈣濃度可能不利于百合未受精胚珠培養和雌核單倍體胚胎誘導；而BDS培養基中除特有的脯氨酸外，還含有較高濃度的肌醇，這兩種成分也許在一定程度上促進了百合雌核單倍體胚胎誘導。
[0023](2)開花前Id為最佳取樣時間。子房的取樣時期與未授粉子房培養胚珠的發育狀況和胚胎發生密切相關。花蕾長度最小的子房其胚珠長勢較差，但隨著花蕾長度的增加，其胚珠的長勢變好。不同花蕾長度其子房培養的胚胎誘導率差異顯著。綜合所有供試基因型的胚胎誘導率，開花前Id是進行百合未授粉子房離體培養的最佳取樣時期(見表2)。
[0024](3)誘導培養20~25后，在顯微鏡下采用胚珠透明技術可以觀察到膨大的胚珠內的胚胎(圖1中C)。轉接在植株再生培養基中通過誘導胚胎萌發再生成植株，而不是通過誘導愈傷組織再生成植株。這樣獲得的再生植株是真正的雌核植株。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1百合未受精子房離體培養中胚胎誘導發生，
[0026]其中A.切片子房誘導培養0d，B.切片子房誘導培養20d，C.含有胚胎的胚珠，
[0027]圖2 ‘Sorbonne’未受精子房離體培養植株再生過程，
[0028]其中A.胚胎萌發穿破胚珠，B.胚胎萌發成小幼苗，C.幼苗長出幼根，D.長成小植株，
[0029]圖3 ‘Sorbonne’和‘Conca’ dor’未授精子房離體培養再生植株的倍性情況，
[0030]其中，Sorbonne’ 二倍體母體植株的再生植株的倍性，A、2n=10 (非整倍體)，B、2n=12(單倍體)，C、2n=14(非整倍體)，D、2n=24( 二倍體)，
[0031]‘Conca’dor’三倍體母體植株的再生植株倍性，E、2n=17(非整倍體)，F、2n=19(非整倍體)，G、 2n=21 (非整倍體)，H、2n=24(非整倍體)。【具體實施方式】
[0032]下面結合實施例，對本發明的技術方案做進一步詳細描述。
[0033]BDS 培養基組:誘導培養基:BDS+2，4-D2mg/L+6_BA2mg/L+ 蔗糖 100g.l-1+ 瓊脂6g.L-1，ΡΗ6.0 ;植株再生培養基為BDS+蔗糖50g.L—1+瓊脂6g.L-1，pH6.0 ;生根培養基為1/2MS++IBA0.lmg.L ^NAA0.lmg.L:+ 鹿糖 60g.L:+ 瓊脂 6g.L \ pH6.0。
[0034]CBM 培養基組:誘導培養基:CBM+2，4-D2mg/L+6_BA2mg/L+ 蔗糖 100g.l-1+ 瓊脂6g.L \ pH6.0。
[0035]MS 培養基組:誘導培養基:MS+2，4-D2mg/L+6_BA2mg/L+ 蔗糖 100g.L—1+ 瓊脂6g.L \ pH6.0。
[0036]實施例1不同時期的花蕾，不同基因型，不同培養基的離體培養對比:
[0037]百合未受精子房離體培養方法，包括如下步驟:
[0038](I)選取花蕾，在無菌條件下置于無菌瓶中，先用75%的酒精表面滅菌30s，之后用10%NaC10消毒lOmin，然后無菌水沖洗3次，每次3分鐘；
[0039](2)在超凈工作臺里，將無菌花蕾剝開取出子房，將其子房橫切成I~2mm厚度的切片；
[0040](3)將子房切片接種在含有不同誘導培養基的三角瓶或培養皿中，置于光照16001x、14h/10 h (白天/黑夜)，(25±1) °〇條件下進行培養20~25d，誘導胚珠內胚胎形成；
[0041](4)在顯微鏡下利用胚珠透明技術對含有胚胎的胚珠(胚性胚珠)數量進行統計；見表1、表2。
[0042]部分采用的胚珠透明技術為:將膨大的胚珠取下，用卡諾氏固定液固定24h后再用4%戊二醛固定2h，經15%、30%、50%、70%、85%、95%酒精梯度脫水，每級20min，100%酒精兩次，每次30min。脫水后，用無水酒精和冬青油體積比(I: I)浸泡Ih后轉入冬青油中分別浸泡6h、12h、24h。待胚珠變成透明后置于體式顯微鏡(Olympus SZ)下觀察胚珠內胚胎的有無。
[0043]表1不同誘導培養基中百合未授粉子房離體培養的胚胎發生頻率
[0044]
【權利要求】
1.百合未受精子房離體培養的方法，包括如下步驟: (1)選取合適的花蕾，滅菌； (2)取出子房，將其橫切成片； (3)將子房切片接種在含有誘導培養基的三角瓶或培養皿中培養20~25d，誘導胚珠內胚胎形成； (4)將含有誘導膨大胚珠的子房片轉接在植株再生培養基中，誘導胚胎萌發進行植株再生； (5)將再生植株轉接到生根培養中進行生根15~20d，獲得根系健壯的無菌組培苗； 所述的合適花蕾為開花前I天的花蕾， 所述誘導培養基:BDS+2，4-D2mg/L+6-BA2mg/L+ 蔗糖 100g.L—1+ 瓊脂 6g.L—1，pH6.0 ;植株再生培養基為BDS+蔗糖50g.L—1+瓊脂6g.L—1，ρΗ6.0 ;生根培養基為1/2MS++IBA0.1mg.L i+NAA0.lmg.L:+ 鹿糖 60g.L:+ 瓊脂 6g.L \ pH6.0。
2.根據權利要求1所述的方法，所述誘導、生根的培養條件為:光照16001x、14h白天/IOh黑夜，(25±1) °C條件下進行培養。
3.根據權利要求1所述的方法，所述步驟(4)的再生培養時間為80~100d。
4.根據權利要求1所述的方法，所述切片厚度為I~2mm。
5.根據權利要求1所述的方法，所述滅菌采取如下順序步驟:將百合花蕾，置于無菌瓶中，先用75%的酒精表面滅菌30s，之后用10%NaC10消毒lOmin，然后無菌水沖洗3次，每次3分鐘。
6.根據權利要求1所述的方法，所述方法還包括再生植株的倍性鑒定步驟。
7.根據權利要求6所述的方法，所述倍性鑒定方法采用根尖染色體計數法:切取3~8mm根尖置于0.Tmmor1放線菌酮中25°C預處理8~9h，然后放入卡諾氏固定液中固定24h，用蒸餾水洗凈后，用Imol.L-1HCl在60°C水浴條件下解離lOmin，蒸餾水漂洗2_3次，然后用卡寶品紅染色制作壓片，于顯微鏡下進行染色體觀察，選取分散良好的中期分裂細胞進行顯微拍照，每份材料觀察30個處于有絲分裂中期的細胞，統計染色體數目，確定染色體倍性水平。
8.根據權利要求7所述的方法，所述顯微鏡的型號為OlympusCX31。
【文檔編號】A01H4/00GK103782910SQ201410050529
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年2月13日 優先權日:2014年2月13日
【發明者】袁素霞, 明軍, 劉春 , 李佳, 徐雷鋒 申請人:中國農業科學院蔬菜花卉研究所