一種利用雌性不育的雜交稻機械化制種方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用雌性不育的雜交稻機械化制種方法。本方法中，3個緊密連鎖的基因表達盒轉入雌性不育水稻。這3個表達盒是：1）水稻雌性可育基因表達盒；2）花粉致死基因表達盒；3）熒光篩選標記基因表達盒。雜合轉基因水稻在自交結實過程中，攜帶轉基因的花粉粒敗育而不能參與受精；而沒有攜帶轉基因的花粉粒能與雌配子正常受精而結實。通過光電分選，獲得純合的雌性不育水稻用于雜交稻機械化制種；而攜帶轉基因的雜合種子，繼續用于雌性不育水稻的繁殖。這一技術解決了雌性不育水稻繁殖難題，實現了雜交稻機械化制種，特別是混播混收方式的機械化制種。
【專利說明】一種利用雌性不育的雜交稻機械化制種方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于農業生物【技術領域】，公開了一種利用雌性不育的雜交稻機械化制種方法。
【背景技術】
[0002]我國雜交水稻的年種植面積約1600萬hm2，種子生產面積約需15萬hm2，每年需商品雜交種2.4億kg左右。我國現行雜交水稻制種技術，自播種至收獲主要依靠人工操作。父母本分期播種，多為先播父本，后播母本；父母本箱式分開栽插，母本多行，父本雙行；收獲時父母本分開收割，或者授粉后成熟前割掉父本。整個制種過程工序繁雜，難以實現機械化，需要足夠的勞動力做保證，只適宜在勞動密集型的農村推廣應用，大型農場因缺少足夠的勞動力而不能制種。而且，由于父本的因素，減少了制種產量。隨著城鎮化、工業化、農業產業化和農村土地流轉政策的逐步實施，農村人口將進一步減少，現行勞動密集型、精耕細作型的制種技術已阻礙了雜交水稻種子生產的發展。因此，雜交水稻機械化制種技術研究迫在眉睫。
[0003]已有不少研究者作了各種嘗試開展雜交稻機械化制種。有研究者提出用谷殼顏色區別水稻不育系和恢復系種子，具體做法是將正常谷殼色的水稻不育系種子與非正常谷殼色的水稻恢復系種子機械混播，成熟后經機械混收，再用色選機分選，獲得雜交種；有研究者提出用飛機將花粉噴施在母本田塊里進行制種；也有研究者提出利用父、母本粒型的較大懸殊，用粒選機分選；還有研究者提出用半機械化操作的方法，即直播母本，人工栽插和收割父本，最后機械收割母本等方法；還有研究者利用水稻對除草劑苯達松的敏感特性進行雜交水稻機械化制種。然而上述多種方法均存在諸多缺陷而不能從根本上實現雜交水稻機械化制種，目前在生產上也未見大規模商業化應用。

【發明內容】

[0004]本發明旨在克服現有技術的不足，提供一種利用雌性不育的雜交稻機械化制種方法。
[0005]為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為:
[0006]所述利用雌性不育的雜交稻機械化制種方法，包括如下步驟:
[0007](I)將水稻雌性可育基因、水稻花粉致死基因和熒光篩選標記基因插入水稻表達載體；
[0008](2)將步驟(1)所制備的水稻表達載體導入雌性不育水稻，得到雜合的轉基因水稻;
[0009](3)將步驟(2)所獲得的雜合的轉基因水稻或者利用步驟(2)所獲得的轉基因水稻進行轉育而成的雜合轉基因，進行自交，通過光電分選法對自交后得到的種子進行分選，篩選出不具有紅色熒光的種子，即為純合的雌性不育水稻種子，將該純合的雌性不育水稻種子用于雜交稻機械化制種；篩選出的具紅色熒光的種子即為轉基因種子，將該轉基因種子繼續用于雌性不育水稻的繁殖，即，繼續進行雜合不育系自交，然后按前述步驟進行光電分選，選出純合的雌性不育水稻種子，如此循環。
[0010]其中，步驟(1)所述水稻雌性可育基因為野生型PTBl基因或雌性不育水稻SfSl的野生型雌性可育基因；所述雌性不育水稻sfsl的野生型雌性可育基因序列如SEQ IDN0.1 ;所示野生型PTBl基因序列如SEQ ID N0.2所示。
[0011]步驟(2)所述雌性不育水稻包括雌性不育水稻SfSl (該不育系已被申請號為201210096970.7的發明專利公開)，攜帶雌性不育基因PTBl (野生型PTBl基因已被申請號為201010194553.7的發明專利公開，所述雌性不育基因PTBl即為野生型PTBl基因發生任何缺失、插入、替換等修飾后產生的不育基因)的雌性不育水稻；所述雌性不育水稻sfsl的野生型雌性可育基因序列如SEQ ID N0.1所示，所述野生型PTBl基因序列如SEQ ID N0.2所示。
[0012]所述花粉致死基因為ZM-AAl，其序列如SEQ ID N0.5所示；所述花粉致死基因由花粉發育后期特異性啟動子PG47驅動，其序列如SEQ ID N0.3所示；所述熒光篩選標記基因為RP，其序列如SEQ ID N0.8所示；所述突光篩選標記基由愈傷組織/種皮特異性啟動子END2驅動，其序列如SEQ ID N0.7所示。所述水稻表達載體為pCAMBIA1300。
[0013]雌性不育水稻的繁殖和雜交稻機械化制種中利用了包含3個表達盒的轉基因水稻進行轉育所獲得的水稻材料。 [0014]下面結合原理，對本發明作進一步說明:
[0015]本發明首先構建了攜帶水稻雌性可育基因、花粉致死基因和熒光篩選標記基因3個緊密連鎖的基因表達盒的水稻表達載體。利用水稻轉基因技術，將上述表達載體轉入雌性不育水稻。
[0016]本發明實質上提供了一種雌性不育水稻繁殖技術，以及利用這一技術機械化生產非轉基因雜交稻種子的方法。將水稻雌性可育基因、花粉致死基因和熒光篩選標記基因3個緊密連鎖的基因表達盒轉入雌性不育水稻。攜帶轉基因的雜合單株在自交結實過程中，攜帶轉基因的花粉粒敗育而不能參與受精；而沒有攜帶轉基因的花粉粒能與雌配子正常受精而結實。通過光電分選，獲得純合的雌性不育水稻用于雜交稻機械化制種，因為父本(恢復系)為雌性不育系，因此制種時可以混播混收。父母本按照一定的比例均勻混合，一次播種，能夠像常規水稻那樣進行育秧和大田栽培管理，可以直播、拋秧、機插等，大大簡化栽插工序。成熟后進行機械化收割；而攜帶轉基因的雜合種子，繼續用于雌性不育水稻的繁殖。
[0017]與現有技術相比，本發明的有益效果為:
[0018]本發明方法解決了雌性不育水稻繁殖技術難題，實現了雜交稻種子生產的混播混收；這一方法利用了轉基因技術，但生產的是非轉基因雜交稻種子。繁殖時，雌性不育水稻雖為轉基因水稻，但面積不大，易于隔離。制種時，可以箱式播插，也可以混播，父母本都不含有轉基因成分，不會造成轉基因的擴散漂移，有利于生物安全；收獲時，可以混收，雜交種子也不含有轉基因成分。這一混播混收的雜交水稻種子生產技術，可以減少制種操作程序，便于進行機械化操作，減輕勞動強度，降低種子生產成本，整體提高水稻種業的效益。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是實施例1中攜帶水稻雌性可育基因、花粉致死基因和熒光篩選標記基因3個基因表達盒的水稻表達載體圖譜；
[0020]圖2是實施例2中經農桿菌轉化后表達紅色熒光蛋白的水稻愈傷圖；
[0021]圖3是實施例2中經農桿菌轉化后獲得水稻轉基因植株圖；
[0022]圖4是實施例3中部分轉基因植株的PCR檢測圖(M:DNA分子量標準；+:正/陽性對照；一:負/陰性對照);
[0023]圖5是實施例3中部分轉基因植株的Southern blot檢測圖(一:陰性對照；+:以質粒作為陽性對照);
[0024]圖6是實施例4中I2-KI轉基因植株花粉粒圖；
[0025]圖7是實施例4中轉基因植株穗部性狀圖；
[0026]圖8是實施例5中小規模制種現場圖。
【具體實施方式】
[0027]下面通過具體實施例對本發明作進一步描述，但不因此限制本發明的范圍。
[0028]實施例1:攜帶水稻雌性可育基因、花粉致死基因和熒光篩選標記基因3個基因表達盒的水稻表達載體構建
[0029]在表達載體pCAMBIA1300上，插入3個表達盒:野生型PTBl表達盒、花粉致死的淀粉酶基因ZM-AAl表達盒、熒光篩選標記基因RP表達盒。野生型PTBl攜帶有自身的啟動子和終止子(其核苷酸序列見SEQ ID N0.2);淀粉酶基因ZM-AAl表達盒元件包括:玉米的花粉發育后期特異性啟動子PG47 (其核苷酸序列見SEQ ID N0.3)、玉米的轉運肽ZM-BTl (其核苷酸序列見SEQ ID N0.4)、玉米的淀粉酶基因編碼序列ZM-AAl (其核苷酸序列見SEQ IDN0.5)、玉米的終止子IN2-1 (其核苷酸序列見SEQ ID N0.6);紅色熒光蛋白基因RP表達盒元件包括:玉米的種子特異性啟動子END2 (其核苷酸序列見SEQ ID N0.7)、載體pLJ02上的RP編碼序列(其核苷酸序列見SEQ ID N0.8)、馬鈴薯的終止子PIN II (其核苷酸序列見SEQ ID N0.9)。完整的構建載體圖譜見附圖1。
[0030]所構建載體質導入農桿菌菌株EHA105用于水稻遺傳轉化。導入方法米用電擊轉化方法，主要參考bio-rad公司的電擊儀使用說明書進行，具體步驟如下:
[0031](I)將儲存于_80°C的DHlOB感受態細胞取出放在冰上凍融，Imm電激杯放在冰上預冷，把凍存的SOC放置在37°C解凍。
[0032](2)將干凈的EP離心管插在冰上預冷，一般EP離心管的數目比要轉化的樣品多兩個，一個用來做陰性對照(沒有加入DNA)、另一個做陽性對照(加入1μ I的IOng/μlpUC19)。
[0033](3)分別吸取1-2 μ I要轉化的DNA樣品放入預冷的EP離心管中，然后將融化的DHlOB感受態細胞20 μ I輕輕取出放入預冷的EP離心管底部，輕輕的將兩者混勻，盡量不要產生氣泡，離心管底部不要用手接觸，避免溫度變化對感受態轉化效率造成影響，操作過程盡量的快。
[0034](4)設置轉化參數，1800ν, 25 μ F，200 Ω，lmm, BioRad電激儀一般有推薦的使用參數。
[0035](5 )輕輕吸取感受態和DNA混合物，放入電激杯中，輕敲使混合物均勻的分布于杯底，改上蓋子放入電激槽中，關上安全蓋，按下電激紅色按鈕，待電激完成后(一般會儀器會發出完成提示音)，將在37°C預熱好的SOC放入電激杯中，將混合物旋起，用吸頭將混合物轉入搖菌管中，于37°C恒溫搖床,225rpm, Ihr0
[0036]實施例2:轉基因水稻獲得
[0037]2.1植物材料選擇
[0038]用于遺傳轉化的水稻(Oryza sativa L.)品種選擇為對應的攜帶PTBl基因(SEQID N0.1)的水稻雌性不育系。
[0039]2.2水稻胚性愈傷組織的誘導[0040]取授粉后10-15d的未成熟水稻種子剝去種皮，于70%酒精浸泡3min，再于0.1%升汞中浸泡15min (或再轉入20%的次氯酸鈉溶液中于搖床振蕩滅菌25min)，超凈工作臺中無菌水清洗3-5次，將消毒后種子的幼胚用鑷子擠出，接種于誘導培養基上，每個皿約放35粒，28°C暗培養4 一 5d，切除胚根，繼續培養12-15d，待愈傷長大后進行繼代培養，每兩周繼代一次，共繼代2-3次。
[0041]成熟胚去殼，經上述方法消毒后，置于誘導培養基上。28°C暗培養至長出愈傷組織。選用培養或預培養4天的愈傷組織作為轉化材料。(第三代開始可以選擇適當的胚性愈傷用于農桿菌轉化。
[0042]2.3愈傷組織的預培養
[0043]取生長旺盛的胚性愈傷組織(從繼代培養上挑選分散狀，顏色鮮黃的2 - 3mm的胚性愈傷顆粒)轉接到預培養培養基，27°C暗培養3~4天。生長旺盛的愈傷用于轉化。
[0044]2.4農桿菌介導的水稻轉化
[0045]農桿菌的培養。挑農桿菌單菌落接種于含50mg/L YM培養基上,260C暗培養2~3天后，用一金屬匙收集農桿菌菌體，將其懸浮于AAM液體懸浮培養基中。調整菌落濃度至0.D.600為0.8~1.0，即可用于轉化。
[0046]愈傷組織與農桿菌的共培養。用于轉化的愈傷組織在被農桿菌污染前均應先在新鮮的繼代培養基頂上預培養3~4天。轉化時將經過預培養的愈傷組織轉移到一無菌的三角瓶中，然后倒入適量的農桿菌懸浮液(至少保證有足夠的菌液與材料接觸)，室溫下放置10~20分鐘，并不時晃動。取出愈傷組織，在無菌紙上吸去多余的菌液，隨即將愈傷組織轉移到鋪有一層無菌濾紙的固體共培養基CM上于260C暗培養2~3天。
[0047]2.5抗性愈傷的篩選
[0048]將愈傷轉移到選擇培養基上篩選抗性愈傷，每兩周轉接I次。培養4 一 8周，多數愈傷褐化死亡,有少數瘤狀抗性愈傷從干癟褐化的愈傷表面長出。挑選這些抗性愈傷繼續在選擇培養基上暗培養2次，挑選長大后愈傷的一部分轉移到分化培養基上。
[0049]2.6抗性愈傷的分化培養
[0050]經抗生素篩選長出的抗性愈傷，轉入分化培養基中繼續培養，26°C~28°C，12h光照，12h黑暗條件下培養。
[0051]2.7轉基因植株的再生及幼苗移栽
[0052]轉移到分化培養基上的愈傷組織，培養2周后愈傷開始轉綠，3周后即可長出幼芽，隨之根也長出。將幼苗轉移到含生根培養基的小三角瓶內，每瓶一株，繼續光照培養，待苗高7~IOcm時，打開瓶蓋于溫室中煉苗5~7天，待小苗生長健壯后，移出培養瓶，洗凈跟上的培養基，移至溫室盆栽(鐵盤中)。注意保濕，以提高移栽成活率。[0053]實施例3:轉基因植株的分子檢測
[0054]3.1DNA大規模抽提
[0055]T0代轉基因水稻DNA抽提采用CTAB法(Murry and Thompson, 1980)。稱取新鮮葉片2 — 4克，剪碎后放入一 20°C預冷的研缽中，用液氮磨成粉末，轉入預冷的磨樣瓶中于一20°C保存備用。提取時加入預熱至100°C的10mll.5X CTAB，迅速攪勻，于56°C水浴保溫搖床振蕩20分鐘，然后用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提。離心后，上清液再用1/10體積預熱至56°C的10% CTAB緩沖液及等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提一次，然后上清加入1% CTAB沉淀DNA，離心后加入添加有RNase A的lmol/L NaCl溶解DNA，于56°C過夜完全溶解酒精沉淀后，溶于適量TE中，用DNA微量測定儀(DNA Fluorometer)測定DNA濃度，平衡DNA濃度至250ng/ul，存于4°C備用。
[0056]3.2PCR 分析
[0057]對TO代轉基因水稻DNA進行PCR檢測。以ZM-AAl基因作為模板設計引物。正向引物為:5’ -AAAAACGGAGACTTTGTGAGCCATT-3’ (SEQ ID N0.11)，反向引物為:5’-TCAACAAGTTTGGAATGAAGGATGC-3’ (SEQ ID N0.12)。擴增產物片段為 1043bp。PCR 反應體系:DNA30 — 90ng, IOx Buffer2.0ul, ImM dNTPl.8ul, 25mM MgCl2L 5ul, IOuM primer 兩種各0.5ul, Tag酶1.5U，然后加dd h20至20ul反應體積。PCR循環條件-MV，變性3分鐘；94°C，I分鐘，550C，1.5分鐘，72°C，1.5分鐘，40個循環；72°C，延伸5分鐘。電泳檢測:用1.4%瓊脂糖凝膠電泳，照相記錄電泳結果。
[0058]附圖4為部分轉基因植株PCR擴增結果，表明目的基因已整合進入水稻基因組中。
[0059]3.3Southern 印跡分析
[0060]取水稻總DNA2.5ug，用限制性內切酶XbaI37°C酶解20hr左右，經電泳檢測酶切完全后，用0.6~0.8%瓊脂糖(Sigma公司生產)凝膠電泳，經12 — 16hr電泳后，凝膠用0.2NHCl變性10分鐘，用0.4N NaOH溶液將凝膠上的DNA片段轉移至尼龍膜Hybond-N+上。轉移20小時，將尼龍膜用2X SSC漂洗2次，各5分鐘，膜晾干后于80 — 100°C真空烘烤3hr，取出冷卻后置于4°C冰箱中保存備用。
[0061]預雜交:先將尼龍膜用2X SSC漂洗，涼干后裝入雜交袋中，加入10 - 18ml (依膜的張數I 一 6張)預熱至65°C的雜交緩沖液。趕氣泡后，于65°C空氣搖床中預雜交6hr左右。
[0062]探針標記:用隨機引物法按下列步驟進行標記。探針DNAlOOng，加入dd H2O至IOul, 100。。變性10分鐘，冰浴5分鐘冷卻后，加入dNTP(A+G+T)3ul，隨機引物緩沖液
5.0ul, Klenow Fragment 酶 2U，最后加入 a — 32P — dCTP10_40uCi (按雜交膜數量)，混勻后于25 C保溫3小時以上。
[0063]雜交:加600ul雜交液到標記好的探針溶液中，打開管蓋，100°C變性10分鐘后，倒入雜交袋中，65 °C雜交6hr。
[0064]洗膜、壓片:雜交完畢后，將膜從雜交袋中取出，用洗膜液IX SSC、0.2%SDS室溫漂洗I次，然后再用預熱至65°c的洗膜液于65°C保溫搖床中熱洗I 一 2次，每次15分鐘。涼干后用保鮮膜包膜，壓片后于一 20°C放射自顯影約4 一 7天。
[0065]探針DNA制備。探針DNA選自3.2中的PCR擴增產物，擴增產物的序列見SEQ IDN0.10。[0066]附圖5為部分轉基因植株的Southern印跡分析。結果表明，目的基因已整合進入水稻基因組中。
[0067]實施例4:轉基因水稻植株的育性考察
[0068]對經過分子鑒定的轉基因植株考察了花粉育性和結實情況。取開花時的花藥，經常規的I2-KI染色后，觀察到部分花粉粒為黑染的可育花粉粒(見附圖6);與雌性不育對照比較，轉基因植株能正常結實(見附圖7)。
[0069]實施例5:水稻雌性不育系用于繁殖制種試驗
[0070]水稻雌性不育系的繁殖。將攜帶雜合轉基因的水稻雌性不育系自交。自交種子通過對紅色熒光的光電分選，可以篩選出具有紅色熒光的種子，獲得純合的雌性不育水稻用于混播混收的雜交稻機械化制種；而攜帶轉基因的雜合種子，繼續用于雌性不育水稻的繁殖。
[0071]水稻雌性不育系應用于雜交稻制種。因為父本(恢復系)為雌性不育系，因此制種時可以箱式栽插，也可以混播混收。父母本按照一定的比例均勻混合，一次播種，能夠像常規水稻那樣進行育秧和大田栽培管理，可以直播、拋秧、機插等。待成熟后進行機械化收割，收獲的均為 雜交水稻種子。附圖7展示了小規模的制種現場。
【權利要求】
1.一種利用雌性不育的雜交稻機械化制種方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: (1)將水稻雌性可育基因、水稻花粉致死基因和熒光篩選標記基因插入水稻表達載體； (2)將步驟(1)所制備的水稻表達載體導入雌性不育水稻，得到雜合的轉基因水稻； (3)將雜合的轉基因水稻自交，通過光電分選法對自交后得到的種子進行分選，篩選出不具有紅色熒光的種子，即為純合的雌性不育水稻種子，將該純合的雌性不育水稻種子用于箱式播插或者混播混收的雜交稻機械化制種；篩選出的具紅色熒光的種子即為轉基因種子，將該轉基因種子繼續用于雌性不育水稻的繁殖。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述水稻雌性可育基因為野生型PTBl基因或雌性不育水稻sfsl的野生型雌性可育基因；所述雌性不育水稻sfsl的野生型雌性可育基因序列如SEQ ID N0.1 ;所示野生型PTBl基因序列如SEQ ID N0.2所示。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述花粉致死基因為ZM-AA1，其序列如SEQID N0.5 所示。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述花粉致死基因由花粉發育后期特異性啟動子PG47驅動，PG47序列如SEQ ID N0.3所示。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述熒光篩選標記基因包括紅色熒光蛋白基因RP，其序列如SEQ ID N0.8所示。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述熒光篩選標記基由愈傷組織/種皮特異性啟動子END2驅動，END2序列如SEQ ID N0.7所示。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述水稻表達載體為pCAMBIA1300。
【文檔編號】A01H1/02GK103834684SQ201410116096
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月26日 優先權日:2013年3月29日
【發明者】曹孟良, 夏玉梅, 沈春修, 方真, 蔡立湘 申請人:湖南雜交水稻研究中心