一種多氯聯苯暴露條件下毛白楊基因分析材料的獲取方法
【專利摘要】本發明公開了一種多氯聯苯暴露條件下毛白楊基因分析材料的獲取方法，先分別制作aroclor1254暴露和空白條件下A、B、C、D四種毛白楊不定根分化固體培養基，將上述培養基各裝入三角瓶中，封口后進行滅菌；選擇毛白楊同一克隆的組培苗，切取頂芽下第二至第三片葉之間粗細一致莖段，分別接種于所述A、B、C、D固體培養基中，每個三角瓶接種3-5個莖段；在培養室培養20~30天；分別收取A、B、C、D固體培養基的毛白楊材料并編號，合并成組包裝、貯藏。該方法操作簡單，所獲取的毛白楊材料基因背景相同，經歷各個生長時期，且多氯聯苯影響因素確定，適合于進行廣泛的基因分析，為尋找對多氯聯苯耐受能力強的基因提供了試驗材料。
【專利說明】一種多氯聯苯暴露條件下毛白楊基因分析材料的獲取方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，具體而言涉及一種多氯聯苯暴露條件下毛白楊基因分析材料的獲取方法。
【背景技術】
[0002]多氯聯苯(PCBs，aroclor 1254是一種典型的多氯聯苯)是一類性質穩定、具有急性和慢性毒性、典型的持久有機污染物(POPs)，曾用在電容器和變壓器的絕緣油、蓄電池、復寫紙、涂料、潤滑劑、防火劑、粘接劑、石蠟擴充劑、農藥延效劑中，在電力工業、塑料加工業、化工和印刷業等領域均有廣泛使用，截至1979年，除少量特殊用途外，世界各國因公害原因停止生產和使用PCBs。世界估計有120萬噸PCBs，其中65%存在于電器系統、垃圾場或存儲在陸地上，31%流失到環境中。由于其持久性和難降解性，至今仍是環境中最重要的有機污染物之一。由于PCBs具有強毒性、致癌性、致畸性、致突變性，許多國家已把PCBs列為優先控制的有機污染物名單。
[0003]關于多氯聯苯的污染控制和土壤修復方法，主要有封存填埋法、高溫焚燒法、物理方法、化學方法、微生物降解法(專利CN102550425、CN102108361、CN103252345)和植物修復法(專利CN1663702、CN101966529)。植物修復法，是利用植物和植物生長及其共存的微生物作為技術手段來凈化環境中有機和無機污染物的方法，目前，植物修復法在實踐上主要是從厭氧-好 氧交替堆制(CN101966529)、雙接種(CN1663702)等方面對土壤進行修復，修復時選用對多氯聯苯分解或富集能力好的紫花苜蓿、西葫蘆等作物；在研究層面主要涉及植物萃取(phytoextraction)、植物固定(phytostabilisation)、植物降解(phytodegradation)、根際降解(rhizodegradation)和根濾作用(rhizofiltration)。一般而言，發現和篩選對多氯聯苯有較強耐受、富集和分解能力的植物基因，是開發降解多氯聯苯能力強、土壤修復效率高的植物新品種的關鍵，對植物修復法的理論和實踐有著重要的意義。而發現和篩選對多氯聯苯耐受、富集和分解能力強的植物基因，首先且極為重要的是要有基因背景相同、暴露條件可控、在多氯聯苯暴露條件下經歷各個生長時期且具有較高生物量的植物材料和相應的參比材料用于基因分析。目前植物修復研究中所用材料一般通過盆栽土培、容器液體培養等方法對靶試植物的種子或完整植物體進行暴露來獲得。盆栽土培方法因所用土壤成分復雜、微生物影響未知等因素導致生長條件與質量控制困難，進而無法比較植物的生長差異是否單純只與多氯聯苯暴露有關，用容器液體方式進行培養使操作又偏繁瑣，更大的局限性在于，如果用種子做暴露材料，因為不同的種子的基因背景不同，無法滿足在相同基因背景下進行基因分析的要求，如果用完整植物體做暴露材料，因為完整植物體的各器官已經健全，就使基因分析無法揭示植物器官在生長分化過程中受多氯聯苯的影響情況。上述弊端最終導致無法用種子或完整植物體進行多氯聯苯暴露條件下的基因分析或者使基因分析具有較大局限性。因此，現有技術中還沒有多氯聯苯暴露條件下，用于基因分析的靶試材料和參比材料的簡便獲取方法。
【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種多氯聯苯暴露條件下毛白楊基因分析材料的獲取方法，該方法操作簡單，所獲取的毛白楊材料基因背景相同，經歷各個生長時期，且多氯聯苯影響因素確定，適合于進行廣泛的基因分析，為尋找對多氯聯苯耐受能力強的基因提供了試驗材料。。
[0005]為實現上述目的，本發明采取以下技術方案:
一種多氯聯苯暴露條件下毛白楊基因分析材料的獲取方法，包括如下步驟:
(a)制作如下A、B、C、D毛白楊不定根分化固體培養基，蔗糖、瓊脂以所占固體培養基總質量的質量百分比表示，1/2MS為大量元素減半的MS培養基，IBA為吲哚丁酸:
A、1/2MS+ 1.(Tl.5% 蔗糖 + 0.6~1.0% 瓊脂，ρΗ5.0~6.0
B、1/2MS+ 0.5 mgLlBA + 1.(Tl.5% 蔗糖 + 0.6~1.0% 瓊脂，ρΗ5.0~6.0
C、1/2MS+ 2.0 ~8.0 mgL-1 aroclor 1254 + 1.(Tl.5% 蔗糖 + 0.6~1.0% 瓊月旨，ρΗ5.0~6.0
D、1/2MS+ 0.5mg L-1IBA + 2.0 ~8.0 mg L-1 aroclor 1254+ 1.(Tl.5% 蔗糖 +
0.6~1.0% 瓊脂，ρΗ5.0~6.0
將上述培養基各裝入三角瓶中，封口后進行滅菌；
(b)選擇毛白楊同一克隆的組培苗，切取頂芽下第二至第三片葉之間粗細一致莖段，分別接種于所述A、B、C、D固體培養基中，`每個三角瓶接種3-5個莖段；
(c)在培養室采用450-680nm的LED光源，以16小時光照8小時黑暗為光周期，光照強度為3000-4000 Lux,培養溫度為23~27°C，培養20~30天；
Cd)分別收取A、B、C、D固體培養基內的毛白楊材料并編號，合并成組包裝、貯藏。
[0006]優選的，所述步驟(a)中，A、B、C、D毛白楊不定根分化固體培養基為:
A、1/2MS + 1.2% 蔗糖 + 0.8% 瓊脂，ρΗ5.6
BU/2MS + 0.5 mgL-1IBA + 1.2% 蔗糖 + 0.8% 瓊脂，ρΗ5.6
CU/2MS + 4 mgL-1 aroclor 1254 + 1.2% 蔗糖+0.8% 瓊脂，ρΗ5.6
DU/2MS + 0.5mg L-1IBA + 4 mg I/1 aroclor 1254+ 1.2%蔗糖+ 0.8% 瓊脂，ρΗ5.6
所述步驟(b)中培養25天。
[0007]本發明的有益效果是，所用的固體培養基組成確定，能夠將毛白楊莖段直接插在培養基上，不要其他輔助裝置進行固定，克服了土壤成分復雜、影響因素不易確定、溶液培養需要單獨固定裝置、操作繁瑣的弊端，所用組培苗選擇同一克隆樣本，很好的消除了基因背景差異，而且所用莖段從器官分化開始經歷各個生長階段，消除了完整植物體無法研究器官分化以及生長過程中植物材料對暴露物的反應的局限性。本發明方法獲取的毛白楊材料為進行深入廣泛的基因分析提供了重要材料，有助于發現對多氯聯苯耐受能力強的基因。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1為A、B、C、D培養基中毛白楊莖段的生根情況比照圖；
圖2為不同劑量的Aroclro 1254單獨暴露以及協同0.Smgr1IBA暴露對毛白楊組培苗不定根生物量累積影響。【具體實施方式】
[0009]以下1/2MS為大量元素減半的MS基本培養基，屬于公知的培養基；IBA為吲哚丁酸；aroclor 1254為一種多氯聯苯，蔗糖、瓊脂的含量用各自所占固體培養基總質量的質量百分比表示，含有瓊脂的固體培養基公知的制作方法是先按量加入各組成成分配成水溶液，然后加熱至沸騰，再冷卻至40°C以下通過瓊脂凝固形成固體培養基。
[0010]實施例一:多氯聯苯暴露條件下毛白楊基因分析材料的獲取方法，包括如下步驟:
(a)制作如下A、B、C、D毛白楊不定根分化固體培養基:
A、1/2MS + 1.2% 蔗糖 + 0.8% 瓊脂，ρΗ5.6
BU/2MS + 0.5 mgL-1IBA + 1.2% 蔗糖 + 0.8% 瓊脂，ρΗ5.6
CU/2MS + 4.0 mgL-1 aroclor 1254 + 1.2%蔗糖+ 0.8%瓊脂，？昍.6
DU/2MS + 0.5 mg L-1IBA + 4.0mg L-1 aroclor 1254+ 1.2%蔗糖+ 0.8% 瓊脂，ρΗ5.6
將上述培養基各裝入三角瓶中，封口后在121°C下進行滅菌16min。
[0011](b)選擇毛白楊同一克隆的組培苗，切取頂芽下第二至第三片葉之間粗細一致莖段，分別接種于所述A、B、C、D固體培養基中，每個三角瓶接種3個莖段。
[0012](C)在培養室采用600nm的LED光源，該光源可以防止紫外光對多氯聯苯的分解作用，以16小時光照8小時黑暗為光周期，光照強度為3500 Lux,培養溫度為25°C，培養25天，各三角瓶內培養基底部的生根情況如圖1所示，由圖1可見，C培養基中單獨添加^igL-1的aroclor 1254暴露條件下毛白楊組培苗不定根生根率和不定根生長狀況明顯好于A培養基的空白對照。C培養基中毛白楊組培苗不定根生根率和不定根生長狀況與D培養基中另外添加0.Smgr1IBA協同效應基本一致，與B培養基中未添加aroclor 1254的情況類似，說明本培養環境下C、D培養基中得到的毛白楊材料在aroclor 1254暴露條件下得到了良好的生長，不定根生物量較高，與A、B培養基中毛白楊材料一起可以作為基因分析的材料。
[0013]Cd)分別收取A、B、C、D固體培養基的毛白楊材料并編號，每種材料注明對應的培養基，將四種材料合并成組包裝、貯藏，作為一組基因分析材料使用。通過對上述材料的基因分析和對比，有助于發現對aroclor 1254耐受力強的基因，為進一步開發植物新品種做準備。。
[0014]實施例二:多氯聯苯暴露條件下毛白楊基因分析材料的獲取方法，包括如下步驟:
(a)制作如下A、B、C、D毛白楊不定根分化固體培養基:
A、1/2MS + 1.0% 蔗糖 + 0.6% 瓊脂，ρΗ5.0
BU/2MS + 0.5 mgL-1IBA + 1.0% 蔗糖 + 0.6% 瓊脂，ρΗ5.0
CU/2MS + 2.0 mgL-1 aroclor 1254 + 1.0% 蔗糖 + 0.6% 瓊脂，ρΗ5.0
DU/2MS + 0.5 mg L-1IBA + 2.0mg L-1 aroclor 1254+ 1.0%蔗糖 + 0.6%瓊脂，？昍.0
將上述培養基各裝入三角瓶中，封口后在120°C下進行滅菌18min。
[0015](b)選擇毛白楊同一克隆的組培苗，切取頂芽下第二至第三片葉之間粗細一致莖段，分別接種于所述A、B、C、D固體培養基中，每個三角瓶接種4個莖段。
[0016](c)在培養室采用450nm的LED光源，該光源可以防止紫外光對多氯聯苯的分解作用，以16小時光照8小時黑暗為光周期，光照強度為3000 Lux,培養溫度為27°C，培養20天。C培養基中單獨添加ZmgI/1的aroclor 1254暴露條件下毛白楊組培苗不定根生根率和不定根生長狀況明顯好于A培養基的空白對照。C培養基中毛白楊組培苗不定根生根率和不定根生長狀況與D培養基中另外添加0.Smg^1IBA協同效應基本一致，與B培養基中未添加aroclor 1254的情況類似，說明本培養環境下C、D培養基中得到的毛白楊材料在aroclor 1254暴露條件下得到了良好的生長，不定根生物量較高，與A、B培養基中毛白楊材料一起可以作為基因分析的材料。
[0017]Cd)分別收取A、B、C、D固體培養基的毛白楊材料并編號，每種材料注明對應的培養基，將四種材料合并成組包裝、貯藏，作為一組基因分析材料使用。通過對上述材料的基因分析和對比，有助于發現對aroclor 1254耐受力強的基因，為進一步開發植物新品種做準備。
[0018]實施例三:多氯聯苯暴露條件下毛白楊基因分析材料的獲取方法，包括如下步驟:
(a)制作如下A、B、C、D毛白楊不定根分化固體培養基:
A、1/2MS + 1.5% 蔗糖 +1.0% 瓊脂，ρΗ6.0
BU/2MS + 0.5 mgL-1IBA + 1.5% 蔗糖 + 1.0% 瓊脂，ρΗ6.0
CU/2MS + 8.0 mgL-1 aroclor 1254 + 1.5%蔗糖+ 1.0% 瓊脂，ρΗ6.0
DU/2MS + 0.5 mg L-1IBA + 8.0mg L-1 aroclor 1254+ 1.5%蔗糖+ 1.0% 瓊脂，ρΗ6.0
將上述培養基各 裝入三角瓶中，封口后在125°C下進行滅菌15min。
[0019](b)選擇毛白楊同一克隆的組培苗，切取頂芽下第二至第三片葉之間粗細一致莖段，分別接種于所述A、B、C、D固體培養基中，每個三角瓶接種5個莖段。
[0020](c)在培養室采用680nm的LED光源，該光源可以防止紫外光對多氯聯苯的分解作用，以16小時光照8小時黑暗為光周期，光照強度為4000 Lux,培養溫度為23°C，培養30天。C培養基中單獨添加SmgL4的aroclor 1254暴露條件下毛白楊組培苗不定根生根率和不定根生長狀況明顯好于A培養基的空白對照。C培養基中毛白楊組培苗不定根生根率和不定根生長狀況與D培養基中另外添加0.Smg^1IBA協同效應基本一致，與B培養基中未添加aroclor 1254的情況類似,說明本實驗方法下C、D培養基中得到的毛白楊材料在aroclor 1254暴露條件下得到了良好的生長，不定根生物量較高，與A、B培養基中毛白楊材料一起可以作為基因分析的材料。
[0021]Cd)分別收取A、B、C、D固體培養基的毛白楊材料并編號，每種材料注明對應的培養基，經四種材料合并成組包裝、貯藏，作為一組基因分析材料使用。通過對上述材料的基因分析和對比，有助于發現對aroclor 1254耐受力強的基因，為進一步開發植物新品種做準備。
[0022]實施例四:不同aroclor 1254暴露劑量下不定根生物量的累積影響
制作若干aroclor 1254含量不同的固體培養基:1/2MS + 1.2%蔗糖+ 0.8%瓊脂+XmglA ρΗ5.6，X 取 2、4、6、8、IOJOmgL' 得到 aroclor 1254 系列；再制作含有 IBA 的aroclor 1254含量不同的固體培養基:1/2MS + 1.2%蔗糖+ 0.8%瓊脂+0.5 mg L4IBA+XmgL'pH5.6,X 取 2、4、6、8、10、20mgL-1,得至Ij aroclor 1254+IBA 系列。選擇毛白楊同一克隆的組培苗，切取頂芽下第二至第三片葉之間粗細一致莖段，分別插入上述兩系列的培養基中，在培養室采用600nm的LED光源，以16小時光照8小時黑暗為光周期，光照強度為3500 Lux,培養溫度為25°C，培養25天，記錄所生產不定根的生物量數據，然后作圖，如圖
2所示。由圖2可見，毛白楊組培苗不定根分化和生長過程中的2.0-8.0 mgL—1劑量aroclor1254的單獨暴露以及協同0.Smgr1IBA暴露，均促進不定根生物量的積累，其最高效應劑量為 4mgL'``
【權利要求】
1.一種多氯聯苯暴露條件下毛白楊基因分析材料的獲取方法，包括如下步驟: (a)制作如下A、B、C、D毛白楊不定根分化固體培養基，蔗糖、瓊脂以所占固體培養基總質量的質量百分比表示，1/2MS為大量元素減半的MS培養基，IBA為吲哚丁酸:
A、1/2MS+ 1.(Tl.5% 蔗糖 + 0.6~1.0% 瓊脂，ρΗ5.0~6.0
B、1/2MS+ 0.5 mgLlBA + 1.(Tl.5% 蔗糖 + 0.6~1.0% 瓊脂，ρΗ5.0~6.0
C、1/2MS+ 2.0 ~8.0 mgL-1 aroclor 1254 + 1.(Tl.5% 蔗糖 + 0.6~1.0% 瓊月旨，ρΗ5.0~6.0D、1/2MS+ 0.5mg L-1IBA + 2.0 ~8.0 mg L-1 aroclor 1254+ 1.(Tl.5% 蔗糖 +0.6~1.0% 瓊脂，ρΗ5.0~6.0 將上述培養基各裝入三角瓶中，封口后進行滅菌； (b)選擇毛白楊同一克隆的組培苗，切取頂芽下第二至第三片葉之間粗細一致莖段，分別接種于所述A、B、C、D固體培養基中，每個三角瓶接種3飛個莖段； (c)在培養室采用450-680nm的LED光源，以16小時光照8小時黑暗為光周期，光照強度為3000-4000 Lux,培養溫度為23~27°C，培養20~30天； (d)分別收取A、B、C、D固體培養基內的毛白楊材料并編號,合并成組包裝、貯藏。
2.如權利要求1所述的多氯聯苯暴露條件下毛白楊基因分析材料的獲取方法，其特征在于，所述步驟(a)中，A、B、C、D毛白楊不定根分化固體培養基為:
A、1/2MS + 1.2% 蔗糖 + 0.8% 瓊脂，ρΗ5.6
BU/2MS + 0.5 mgL-1IBA + 1.2% 蔗糖 + 0.8% 瓊脂，ρΗ5.6
CU/2MS + 4 mgL-1 aroclor 1254 + 1.2% 蔗糖+0.8% 瓊脂，ρΗ5.6
DU/2MS + 0.5mg L-1IBA + 4 mg I/1 aroclor 1254+ 1.2%蔗糖+ 0.8% 瓊脂，ρΗ5.6 所述步驟(b)中培養25天。
【文檔編號】A01H4/00GK103875536SQ201410152199
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年4月16日 優先權日:2014年4月16日
【發明者】杜克久, 李玉靈, 李燕玲, 劉霞, 王子嵐, 才滿, 孫然 申請人:河北農業大學