用于剔除標記基因的融合蛋白及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及基因工程，具體公開了一種用于剔除標記基因的CPP5-Cre融合蛋白及其應用，所述CPP5-Cre融合蛋白包括短的5氨基酸細胞穿膜肽CPP5（KLPVM）和位點特異重組酶Cre蛋白。利用表達純化后的CPP5-Cre融合蛋白與帶有篩選標記基因的豬成纖維細胞孵育后，獲得篩選標記基因剔除的陽性克隆后進行體細胞克隆，獲得F0代的篩選標記基因剔除的轉基因豬。
【專利說明】用于剔除標記基因的融合蛋白及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程，具體地說，涉及一種用于剔除標記基因的融合蛋白及其應用。
【背景技術】
[0002]動物轉基因技術是在經典遺傳學、分子遺傳學和DNA重組技術的基礎上，運用基因工程等技術手段，將感興趣的外源目的基因或重組基因穩定整合于宿主動物的染色體基因組并穩定遺傳給后代的一種新興生物技術。最早于1976年由Jaenisch首先利用逆轉錄病毒感染小鼠早期胚胎首次得到莫氏白血病病毒轉基因小鼠。隨著新技術新方法的出現，動物轉基因技術也在不斷的完善之中。利用傳統的轉基因方法，如顯微注射法、精子載體法、電穿孔法、體細胞克隆法等，已經制備了轉基因小鼠、大鼠、豬、牛、羊、雞等多種轉基因動物。而且由于豬于人類具有大量相似的解剖、生理、代謝、病理。例如，他們有一個非常相似的胃腸道解剖和功能、胰腺形態和代謝調節。因此豬比小鼠更適合用于人類疾病模型研究，同時豬肉又是人類主要的營養來源。伴隨著ZNF/TALEN/Cas9等最新技術的出現，使得轉基因大動物具有更加廣闊的應用前景，如制備動物生物反應器、提高畜禽生產能力及肉奶品質、培育抗病動物、生產人類用動物器官、建立人類疾病模型等，將給人類帶來巨大的經濟效益。在我國，主要畜牧類品種則嚴重依賴于進口，在主要的畜牧類品種中，奶牛品種依賴程度達100%，豬、雞品種依賴程度接近90%，這意味著作為動物農業整個產業鏈源頭的畜牧類品種，嚴重依賴于國際市場。因此轉基因技術提高迫切需要。目前最大限制轉基因技術發展的障礙是篩選標記基因的存在。因為在轉基因過程中，除了表達目的基因外，還需要篩選標記基因。標記基因即選擇性標記基因是指在遺傳轉化中能夠使轉化細胞(或個體)從眾多的非轉化細胞中篩選出來的標記基因。由于轉基因效率低，因此必須利用標記基因對陽性克隆進行篩選和富集。但標記基因的存在不僅對鄰近基因及其目的基因表達產生影響，同時還將帶來嚴重的安全性問題。目前雖然有一些技術可以去除篩選標記基因，但是這些方法主要用于小鼠，而且有很大缺陷。例如通過瞬時表達Cre重組酶載體，需要額外的細胞轉染過程，而且存在整合隱患和細胞毒性。在大動物的研究很少，2009年，本課題組利用體外轉錄mRNA瞬時表達Cre酶，獲得標記基因敲除的轉基因牛。目前為止，還沒有對豬進行篩選標記基因即(marker free)的相關研究。因此建立簡便、高效、快速標記基因敲除的轉基因豬技術研究顯得尤為重要。

【發明內容】

[0003]為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種用于剔除標記基因的融合蛋白及其應用。
[0004]為了實現本發明目的，本發明首先提供一種用于剔除標記基因的CPP5_Cre融合蛋白，所述融合蛋白包括細胞穿膜肽CPP5和位點特異重組酶Cre蛋白，所述細胞穿膜肽CPP5的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示。[0005]進一步地，所述融合蛋白的氣基酸序列如序列表SEQ ID N0.2所不。
[0006]本發明還提供了一種表達前述CPP5_Cre融合蛋白的載體。
[0007]本發明還提供了一種剔除轉基因豬篩選標記基因的方法，所述方法包括以下步驟:
[0008]1)構建CPP5_Cre原核表達載體；
[0009]2)利用步驟1)表達載體進行CPP5_Cre融合蛋白的表達及純化；
[0010]3)將步驟2)得到的CPP5_Cre融合蛋白與帶有篩選標記基因的豬體細胞共培養；
[0011]4)鑒定篩選標記基因剔除的陽性克隆；
[0012]5)通過體細胞克隆獲得H)代，篩選標記基因剔除的轉基因豬個體。
[0013]進一步地，所述步驟I)將含有CPP5序列及其NcoI和NdeI兩個酶切位點的引物對，通過體外做成linker ;用Ncol+Ndel酶雙切pET28.2-Cre,回收得到目的片段與linker連接，轉化、搖菌、小提質粒、酶切鑒定陽性的PCPP5-CRE載體；所述pCPP5-CRE載體的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.3所示。
[0014]進一步地，所述步驟3)將步驟2)得到的CPP5_Cre融合蛋白與帶有篩選標記基因的豬成纖維細胞，進行孵育共培養獲得克隆。
[0015]進一步地，所述步驟5)將步驟4)篩選得到的陽性克隆細胞作為核移植供體細胞，離體的卵母細胞為核移植受體細胞，通過核移植技術進行體細胞克隆獲得H)代篩選標記基因剔除的轉基因陽性豬。
[0016]本發明進一步提供了前述CPP5_Cre融合蛋白和表達該融合蛋白的載體在生產篩選標記基因剔除的轉基因豬中的應用。
[0017]本發明的有益效果在于:本發明提供了簡便、高效、快速的去除轉基因豬篩選標記基因方法即marker free。其原理是利用短的5氨基酸的細胞穿膜肽和位點特異重組酶Cre/1xP系統構建融合的蛋白使其具有穿膜、入核、剪切marker gene的功能。而且只要將純化出的蛋白與帶有marker gene的豬成纖維細胞孵育3h后，共培養獲得克隆，然后進行PCR鑒定，將陽性克隆用于后期核移植，即可在H)代獲得marker free的轉基因豬。
[0018]本發明解決了豬標記基因敲除的技術問題，對于大動物轉基因未來的應用及其基礎研究打下重要的基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為本發明含有短細胞穿梭肽和Cre酶的融合蛋白表達載體圖；
[0020]圖2為本發明CPP5_Cre蛋白純化圖；
[0021]圖3為本發明蛋白處理后獲得陽性克隆PCR鑒定結果；
[0022]圖4為本發明marker free陽性H)代豬PCR檢測結果；
【具體實施方式】
[0023]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0024]實施例中載體設計由本課題組完成，序列測定由北京華大基因完成。Taq酶、T4DNA連接酶、內切酶均購自北京NEB公司，體細胞克隆所用試劑均購自Sigma公司。酶切、連接、回收、轉化、PCR擴增、原核表達及其純化等常規實驗操作步驟詳見《分子克隆(第三版)》。實施例I含有短細胞穿梭肽和Cre酶的融合蛋白表達載體圖
[0025]將5氨基酸短肽CPP5構建到ρΕΤ28.2_Cre原核表達載體(addegene公司提供)中。
[0026]首先通過生工公司合成I對引物，引物中含有CPP5序列及其NcoI和NdeI兩個酶切位點:
[0027]Up:catgggcAAACTGCCGGTTATGggcca ；
[0028]Down:tatggccCATAACCGGCAGTTTgcc。
[0029]然后通過體外做成linker, 50體系:引物各22.5 μ 1、5μ I的IOxbufferPCR0 99度變性5分鐘室溫復性10分鐘，4度保存用于后面實驗。
[0030]用Ncol+Ndel 酶雙切 pET28.2_Cre，體系為 50μ1:載體 2μ1、酶各 2μ1、10xbuffer4加5μ 1、無菌水31 μ 1，37度酶切2h，跑膠回收得到6319bp的目的片段；將上述回收的片段和linker連接，體系10 μ 1:回收片段7 μ 1、大linker I μ I>IOxbuffer加I μ 1、Τ4連接酶I μ 1，16度過夜連接。
[0031 ] 轉化、搖菌、小提質粒、酶切鑒定陽性的pCPP5-CRE載體(核苷酸序列如SEQ IDN0.3所示)，備用。
[0032]實施例2 CPP5-Cre蛋白純化圖
[0033]1.CPP5-Cre 的原核表達 [0034]I)將含有表達載體的BL21菌接種到5ml的培養基中，37°C過夜培養；
[0035]2) 1:100轉接至500ml的培養基中，37°C培養2.5h ；
[0036]3)加入 IPTG 至終濃度 0.2mM, 16°C誘導 16h。
[0037]2.N1-Nta 柱純化
[0038]I)集菌，加入培養基體積1/10的solutionA，重懸并超聲破碎細胞；
[0039]2) 13000g離心10min,上清液用0.45 μ m的濾膜過濾；
[0040]3) Ni柱用5倍體積的milli Q水洗潘，再用5倍體積的solutionA平衡；
[0041]4)上樣；
[0042]5)樣品全部流完后，用8倍體積的solutionA沖洗柱子；
[0043]6)8倍體積solutionA+洗漆柱子；
[0044]7)用3倍體積的solution B將蛋白從柱子上洗漆下來；
[0045]8)用超濾柱將蛋白置換到10%甘油的DMEM中。
[0046]3.去內毒素
[0047]I)將Iml去內毒素凝膠加入柱床中，自然沉降；
[0048]2 )用5倍體積的0.2N NaOH洗滌凝膠并過夜浸泡；
[0049]3)用5倍體積的NaCl洗滌柱床；
[0050]4 ) 5倍體積Mi 11 iQ水洗滌柱床；
[0051 ] 5 )用5倍體積10%甘油DMEM洗滌柱床；
[0052]6)上樣，收集流出液；
[0053]7)用2倍體積10%甘油DMEM洗滌柱床，收集流出液；
[0054]8)步驟3.2到3.4步驟再生柱床，蛋白測定濃度后分裝及凍在_80°C保存。
[0055]實施例3蛋白處理后獲得陽性克隆PCR鑒定結果
[0056]1、長白胎兒成纖維細胞建立[0057]I)取妊娠30d的長白豬，處死后取輸卵管子宮、包扎出口、2h內運回實驗室。
[0058]從子宮內取出胎兒，用含抗生素的DPBS清洗胎兒，轉移到超凈工作臺內，用眼科剪去除胎兒頭部、四肢、內臟、用DPBS沖洗。
[0059]2)在直徑IOOmm細胞培養皿內用眼科剪將剩余部分盡量剪碎。
[0060]3)加入少許血清，將Iml槍頭尖端用剪刀剪斷，留下直徑約為40mm以上部分，接上Iml槍，將組織塊轉移到3個T25細胞培養瓶的底壁，用彎頭吸管將組織塊均勻鋪開。
[0061]4)將鋪有組織塊的一面向上，各加入5ml細胞培養液，放入CO2培養箱，39°C、5%C02、100%濕度培養。
[0062]5)待培養6_8h后，將鋪有組織塊的一面翻轉，使細胞培養液浸沒組織塊。
[0063]6)培養5天左右觀察組織塊周圍是否有細胞爬出。
[0064]7)待細胞生長至80%匯合時，進行傳代培養或進行冷凍保存。
[0065]2、重組蛋白與成纖維細胞孵育然后培養出克隆
[0066]將實施例2中表達的CPP5_Cre重組蛋白與長白胎兒成纖維細胞孵育培養。將5um-10um濃度的CPP5_Cre蛋白加入，常規培養豬成纖維細胞的培養基中，然后進行細胞培養，作用3-24小時后，PBS清洗然后換不含CPP5-Cre重組蛋白的細胞培養基，然后進行單細胞培養2周后獲得克隆，用于后面PCR鑒定。
[0067]3、蛋白去除marker gene后陽性克隆PCR鑒定
[0068]將上面獲得的克隆部分細胞凍存、部分細胞細胞提取基因組進行PCR鑒定(PCR分子鑒定圖如圖3-A所示)，鑒定原單敲豬原代細胞用Ml和M2兩個引物擴增會擴出2374bp和1102bp兩個片段，當標記基因刪除后，再用Ml和M2兩個引物擴增會擴出664bp和1102bp兩個片段，當PCR擴增過程中，延伸時間設為45s的時候，擴不2374bp條帶。出圖3-B顯示PCR擴增結果，其中2、4、5、7、9、11、12、14、15、17和18擴增除664bp和1102bp條帶，證明是標記基因刪除的陽性克隆，)，用于后續克隆實驗。
[0069]實施例4marker free陽性FO代豬PCR檢測結果
[0070]1、豬卵母細胞體外成熟
[0071]從屠宰場取卵巢，放入28°C _35°C，含青霉素和硫酸鏈霉素的生理鹽水中，2h內運回實驗室用配有18號針頭的20mL注射器抽吸卵巢上3-6mm的卵泡。將抽取液放于50mL離心管中，37°C水浴靜置15min去上清，加入PVA-TL-HEPES重懸沉淀，再靜置15min，重復一次，將重懸液放入直徑60_的塑料培養皿中，在體式顯微鏡下，用口吸管挑選卵丘包裹2層以上，致密，而且胞質均勻的卵丘細胞-卵母細胞復合體(Cumy Lus-Oocyte-complexes,COCs)，用成熟培養液洗滌3遍轉入在培養箱中至少已經平衡4h的培養液滴內(每100 μ L液滴放25枚)。每一直徑35mm的塑料培養皿中做4個液滴，用胚胎級礦物油覆蓋。將COCs先在成熟培養液中培養20±2h，然后轉移到無hCG以及eCG的成熟液中繼續培養20±2h。
[0072]2、體細胞準備
[0073]利用血清饑餓法，將實施例3中獲得的打靶陽性細胞待其生長至80%匯合時，進行血清饑餓處理，即把培養液中的FBS (Gibco, Life Technologies)濃度從20%降至0.5%繼續培養2-5d，按常規方法消化，離心洗滌，最后加ImL顯微操作液重懸細胞沉淀備用。
[0074]3、受體卵母細胞去核及供體細胞核移植
[0075] 利用盲吸法進行成熟卵母細胞去核，即成熟40_44h豬卵母細胞，脫卵丘后選擇胞質均勻，卵周隙清晰，胞膜完整的卵母細胞放入無Ca2+、Mg2+、HEPES緩沖NCSU-23備用轉移到顯微操作液滴內:核移植前Ih做好，直徑60mm細胞培養皿蓋中央(液滴50-80 μ l，2-3mm寬，8-10mm長，石蠟油覆蓋)，作用15_30min，把供體細胞以及成熟卵母細胞同時轉入其中于39%、5%C02、100%濕度平衡15min，安裝顯微固定管以及去核/注射針，調節好操作系統位置，在裝配有顯微操作儀及恒溫臺的倒置顯微鏡下，40X用固定管(內徑25-35 μ m，外徑100-120 μ m)吸持卵母細胞用內徑15-25 μ m的去核/注射針撥動卵母細胞，使第一極體處于鐘表1點鐘位置200 X下，從鐘表3點處將去核/注射針刺過透明帶，吸出第一極體及其附近少許細胞質退出去核/注射針，將第一極體以及少許胞質吐出挑選直徑15-20 μ m，折光性強，圓形，光滑的體細胞，200 X下用去核/注射針吸取一個供體細胞，從去核進針處將體細胞注射到透明帶下的卵周隙內用注射針點壓透明帶，使供體細胞與受體卵胞質的細胞膜彼此緊密接觸每批25-30個卵母細胞，構建完成后，結束后將供體細胞-卵胞質構成的細胞對(重構卵)轉移到NCSU-23+4mg/ml BSA中，39°C、5%C02、100%濕度培養箱中修復l_2h。
[0076]4、融合與激活
[0077]將恢復好的重構卵分批轉移到融合液中平衡3min，用融合/激活液洗滌3遍后，每批5個放入已經鋪滿融合液的融合槽內，用拉制的且尖端很細的實心玻璃針撥動重組卵，使供體細胞-受體卵細胞膜接觸面與電極平行用ECM2001融合儀施加一個30 μ s，2.0kv/cm的直流電脈沖誘導融合同時激活，用NCSU-23%+4mg/ml BSA洗滌5遍，立即轉入礦物油覆蓋的胚胎培養液中、39°C、5%C02、100%濕度培養0.5h~Ih后取出，在體視顯微鏡下判定融合。
[0078]5、胚胎培養
[0079]在開始顯微操作前至少4h預先做好培養液滴，在超凈臺內取35mm細菌培養皿，做6-8個30 μ L大的液 滴，小心加入2.5-3ml礦物油覆蓋，做好標記后放入CO2培養箱內平衡將上述融合的重構胚用胚胎培養液洗滌5遍后轉入，每個30 μ L的液滴培養8-10個重構胚，培養48h和168h時記錄卵裂和囊胚形成結果。
[0080]6、胚胎移植
[0081]用公豬試情或者觀察壓背反應，挑選自然發情母豬，一般在構建克隆胚的當天將在CO2培養箱中培養12-30h的1-2細胞克隆胚取出，裝入2.5ml細管內。用滅菌的錫箔紙包裝好，做好標記，放到恒溫運輸箱中運到豬移植地點，用40-60ml( lmg/100kg體重)生理鹽水溶解1-1.5mg硫噴妥鈉和地西泮，耳靜脈注射20ml，待受體豬初步麻倒后，將其抬到手術架上仰臥(青年后備母豬)或者側臥(經產母豬)保定對后備母豬:在腹部下面第I對和第2對乳頭之間，腹中線局部15X10cm2面積內清潔刮毛后先碘酒消毒，后酒精棉脫碘(對經產母豬:在腹部肷窩部15 X IOcm2的范圍內清潔，刮毛碘酒消毒后酒精脫碘)在準備動刀切開腹中線之前，把前面余下的麻醉藥再酌情注射20-30ml，沿腹中線切開一個長約8-10cm的口，打開腹腔，探進去一只手，取出卵巢后用潤濕的滅菌脫脂紗布蓋上(而對經產母豬:沿側腹部做一個與腹中線面垂直的長約IOcm的切口)在手術人員即將取出卵巢，調整好輸卵管傘之際，將裝在吸管內的胚胎取出放在熱臺上，體視顯微鏡下將胚胎裝入移植管內，手術人員和胚胎移植人員相互協調，將移植管從輸卵管傘部探入輸卵管至少5cm大致到了壺腹-峽部結合處，一邊推動注射器，以便外撤移植管移植后體視鏡下觀察胚胎是否仍滯留在移植管內，確認沒有后，開始卵巢回位，術口縫合胚胎移植后第IOd肌肉注射800IUhCG，13d注射500IU PMSG。[0082]7、囊胚細胞計數
[0083]取出重構胚囊胚，在含3.7%多聚甲醛的DPBS中洗滌3遍后再固定IOmin將固定后的囊胚轉移到含10 μ g/ml Hoechst33342 (bisbenzimide)的DPBS中避光的暗盒中室溫孵育IOmin染色結束后，將囊胚轉移到載玻片上，盡量少帶液體，盡快用9:1的凡士林/石蠟油在其四角點四個柱，蓋上蓋玻片，在實體顯微鏡下小心按壓蓋玻片，使卵受壓后稍微膨大但不至于破碎為宜，用指甲油封片，NikonESOO顯微鏡，紫外光激發下觀察、照相、計數。
[0084]實施例5R)代公豬陽性鑒定
[0085]FO代豬組織基因組DNA的提取:
[0086]將豬場出生的公豬(來源于實施例3中的陽性細胞克隆)取少量尾巴組織塊，剪碎或細胞沉淀放入1.5ml離心管中，加700 μ I DNA抽提緩沖液，20 μ I蛋白酶K (20mg/ml),混勻56°C水浴消化18h以上，直至組織塊或細胞沉淀完全消失，間歇搖動以獲得更好的效果,加入700 μ ITris-飽和酹,溫和搖動12min, 12000 rpm離心12 min。將上層液相轉移至另一新的離心管中，重復上一步驟，將上層液相轉移至另一新的離心管中，加入700μ I酚:仿(1:1)，溫和搖動12min, 12000rpm離心12min。將上層液相轉移至另一新的離心管中,加Λ 700 μ I氯仿,溫和搖動12 min, 12000rpm離心12 min。將上層液相轉移至另一新的離心管中，加2倍體積無水乙醇，顛倒混勻后，12000rpm離心10 min。棄上清，用70%乙醇洗沉淀和管壁，傾棄乙醇，浙盡殘液，室溫下敞口放置20~30min，使乙醇完全揮發，加適量(約100 μ DTE緩沖液，于56°C水浴中溶解DNA，0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA濃度，測量260/280nm波長下檢測基因組DNA的濃度和純度，將其調整至適當濃度，_20°C保存，同時進行PCR鑒定打靶陽性公豬。進行瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA，假如擴出SOObp和388bp條帶的既為marker free陽性,如果只擴出800bp為野生型或者單敲沒有去處markergene的個體，檢測結果如 圖4所示，其中其中1_12號12頭H)代豬都為marker free成功個體，其中WT即野生型和+/_單敲的為對照。
[0087]雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
【權利要求】
1.一種用于剔除標記基因的CPP5-Cre融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括細胞穿膜肽CPP5和位點特異重組酶Cre蛋白，所述細胞穿膜肽CPP5的氨基酸序列如序列表SEQID N0.1 所示。
2.根據權利要求1所述的CPP5-Cre融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示。
3.表達權利要求1或2所述CPP5-Cre融合蛋白的載體。
4.一種剔除轉基因豬篩選標記基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟:. 1)構建CPP5-Cre原核表達載體； .2)利用步驟I)表達載體進行CPP5-Cre融合蛋白的表達及純化； . 3)將步驟2)得到的CPP5-Cre融合蛋白與帶有篩選標記基因的豬體細胞共培養； . 4)鑒定篩選標記基因剔除的陽性克隆； . 5)通過體細胞克隆獲得H)代，篩選標記基因剔除的轉基因豬個體。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟I)將含有CPP5序列及其NcoI和NdeI兩個酶切位點的引物對，通過體外做成linker ;用Ncol+Ndel酶雙切pET_28.2CRE，回收得到目的片段與linker連接，轉化、搖菌、小提質粒、酶切鑒定陽性的pCPP5-CRE載體；所述PCPP5-CRE載體的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.3所示。
6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟3)將步驟2)得到的CPP5-Cre融合蛋白與帶有篩選標記基因的豬成纖維細胞，進行孵育共培養獲得克隆。
7.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟5)將步驟4)篩選得到的陽性克隆細胞作為核移植供體細胞，離體的卵母細胞為核移植受體細胞，通過核移植技術進行體細胞克隆獲得H)代篩選標記基因剔除的轉基因陽性豬。
8.權利要求1或2所述的CPP5-Cre融合蛋白在生產篩選標記基因剔除的轉基因豬中的應用。
9.權利要求3所述的載體在生產篩選標記基因剔除的轉基因豬中的應用。
【文檔編號】A01K67/027GK103992409SQ201410158270
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年4月18日 優先權日:2014年4月18日
【發明者】李寧, 孫照霖, 康倩倩, 李秋艷, 趙蕊, 孫永川 申請人:中國農業大學