一種用于獲得無標記轉基因植物的農桿菌轉化載體組合物及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于獲得無標記轉基因植物的農桿菌轉化載體組合物及其應用。本發明提供了一種用于獲得無標記轉基因植物的農桿菌專用載體組合物，由獨立包裝的重組載體和pClean系列載體的pClean-Soup載體組成；所述重組載體為將目的基因插入pClean系列載體的pClean-Green載體T-DNA區中，且將標記基因插入所述pClean-Green載體的另一個T-DNA區中，得到表達所述目的基因和標記基因的重組載體。從上述可以看出，本發明利用標記基因和目的基因在同一載體的不同T-DNA區的5TBTG154組合物，后代均可以獲得較高比例的無選擇標記轉基因植株。本發明對轉基因植物研究，尤其是小麥無選擇標記轉基因植株的獲得和利用具有重要意義。
【專利說明】一種用于獲得無標記轉基因植物的農桿菌轉化載體組合物及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一種用于獲得無標記轉基因植物的農桿菌轉化載體組合物及 其應用。
【背景技術】
[0002]植物轉基因技術是進行基因功能研究和通過基因工程進行植物遺傳改良的重要工具。自1996年首例轉基因作物商業化種植以來，目前世界各國已累計批準23種轉基因作物進行商業化生產，涉及13類目標性狀，包括抗蟲、抗除草劑、抗病、育性改變、品質改良等。以抗除草劑和抗蟲為主的大豆、玉米、棉花、油菜等轉基因作物已經在全球22個國家和地區種植，2012年種植面積已達1.7億公頃。轉基因作物產業化已成為全球新的經濟增長點，是增強農業國際競爭力的重要保障。
[0003]目前植物遺傳轉化方法眾多，其中根癌農桿菌介導法(Agrobacterium-mediatedtransformation)和基因槍轟擊法(particle bombardment transformation)是植物遺傳轉化的主要方法。兩種方法各有優缺點，農桿菌介導法外源基因在植物遺傳轉化中的轉化機理清楚、整合位點較穩定、拷貝數低、整合后的外源基因結構變異較小、遺傳穩定性好，但存在受體基因型限制和骨架序列整合的缺點；基因槍轉化法基本不受材料基因型的限制，但卻存在轉基因植株中整合有載體骨架序列和抗生素標記、目的基因的多拷貝、轉基因沉默以及轉基因后代遺傳穩定性差等問題。
[0004]盡管多數國家對轉基因產品的態度日趨積極，但轉基因作物的潛在安全風險問題仍然受到公眾的普遍關注，特別在歐洲一些國家轉基因作物的爭議非常激烈。在轉基因作物中爭議最大的是抗除草劑和抗生素類選擇標記可能帶來的潛在風險。如在環境方面，由于花粉飄移可能形成超級雜草、增加靶標生物抗性、對生物多樣性影響等。在食品安全方面，包括標記基因所表達蛋白質致敏性，以及對受體作物本身營養成分、天然毒素和抗營養物質含量等方面的影響及其它可能的非預期效應。另外標記基因的存在也不利于基因的重復轉化。因此建立安全轉基因技術體系和培育無標記轉基因植物已成為轉基因技術研發的主要方向，也是各國在轉基因【技術領域】進行技術創新的熱點之一。
[0005]雙元載體的發展和Gateway克隆技術的應用大大促進了農桿菌介導的遺傳轉化在植物基因工程改良中的應用，同時也使其成為獲得無選擇標記轉基因植物的重要工具。從1983年Hoekema等把根癌農桿菌Ti質粒上的vir區和T-DNA區分離并置于兩個復制子中，提出雙元載體策略以來，雙元載體的發展已取得了突破性的進展。雙元載體的種類從最早pBinl9和pBI121的構建至今二十幾年間，已發展了二十多個系列幾十種載體,如:pCAMBIA, pMDC和pGreen雙元載體系列等。與此同時,雙元載體在以下幾個方面得到了大幅度的優化:添加廣適的復起制點，使其在大腸桿菌和農桿菌中能夠自由復制；運用高拷貝復制子，以提高質粒的產量，便于體外亞克隆操作；降低載體質粒的長度和增加T-DNA內限制性內切酶位點，便于外源基因的亞克隆操作。在提高轉化效率和增強外源基因表達穩定性方面，通過添加額外的vir基因、T-DNA轉移增強序列(overdrive)、基因沉默抑制子等方面的改良，提高植物遺傳轉化效率和外源基因的穩定表達。雙元載體的發展，使農桿菌介導的植物遺傳轉化技術廣泛應用于植物基因研究的各個領域，如RNA干擾、基因過表達、多基因傳遞、功能基因組和蛋白質組研究等。然而通過傳統的酶切、連接方法構建不同用途的載體，不僅耗時耗力，而且還受到酶切位點的限制，特別是對于高通量的功能基因組和蛋白質組研究來說，載體構建是一個最大的‘瓶頸’。Gateway技術的出現,克服了傳統載體構建中遇到的上述問題。
[0006]Gateway克隆技術是Invitrogen公司基于λ曬菌體介導的位點特異性整合和刪除系統而開發的。位于特異性位點att間的DNA片段,在重組酶BP Clonase或LR ClonaseEnzyme Mix的作用下,通過一步反應(attBXattP或attLXattR)便可將DNA片段轉移到含相應重組位點的目的載體中，避免了載體構建中的酶切、連接等繁瑣步驟。目前已報道了多種 Gateway兼容的雙元載體,如pW、pMDC、pEarleyGate系列載體，每種載體系列都含有多種不同用途的載體類型。如PW系列載體包括過表達和反義表達載體、用于啟動子分析含有LUC、GUS和GFP-GUS等基因的載體、用于基因融合的含GFP基因的載體和用于基因沉默的RNA干擾載體。
[0007]農桿菌介導的共轉化標記基因剔除法以其操作簡單、適用性廣，且易產生非連鎖位點而被廣泛應用。共轉化法將目的基因和標記基因分別置于兩個獨立的T-DNA中，農桿菌介導轉化時，兩個獨立T-DNA可隨機整合到染色體的不同位點，產生連鎖或非連鎖的共整合植株，這些非連鎖的共整合植株通過自交和后代的分離便可獲得無標記轉化植株。兩個獨立的T-DNA可位于同一質粒上或各位于一個質粒上，共存于同一農桿菌中或各位于一個質粒上，存在于不同的農桿菌中。此外，其它形式結構的載體如利用載體骨架上的篩選基因和雙RB邊界等方法，也可通過農桿菌介導的共轉化法獲得無標記的轉基因植株。如Huang等把目的基因置于T-DNA內，而將標記基因置于T-DNA左邊界外的骨架序列上，將此載體轉化玉米，實驗結果表明，此法比利用多T-DNA法可獲得較高的無標記植株；Lu等構建了含雙R B和一個LB結構的T-DNA的載體，將標記基因置于兩個RB序列間，而目的基因位于LB和RB間，用此載體轉化水稻，有36-64%!；植株的后代發生了分離，并獲得了抗水稻齒葉矮縮病毒無標記基因的轉基因水稻植株。
[0008]Hellens等基于pBluescript載體構建了 pGreen/pSoup雙元載體。其具有以下特點:減少了質粒長度，提高了在E.coli中拷貝數，便于體外操作和克隆；pGreen質粒只含有pSa-ori基因，只有在輔助質粒pSoup中pSa-RepA的存在下,才能夠在農桿菌中復制,這樣pGreen在非選擇性條件下是不穩定的，在一定程度上增強了質粒的生物安全性；適應性廣，可適合于單雙子葉植物的轉化；便于載體的改良和構建不同用途的載體，如可在pSoup質粒的多克隆位點附加額外的vir基因，從而提高大片段基因的轉化和提高谷類作物的轉化效率。通過將pSoup上連接一個T-DNA，使得pGreen和pSoup載體中均含有獨立的T-DNA，從而產生marker-free轉基因植株。
[0009]目前，pGreen載體已經廣泛地應用于多種植物的轉化，如擬南芥、煙草、豌豆、番爺等。此外，一些改良的新型pGreen/pSoup載體也已成功地應用于谷類作物如小麥、水稻的轉化，用于提高轉化效率或用于產生marker-free轉基因植株的研究。如Wu等利用含Komari片段(包含VirB、VirC和VirG基因)pSoup載體,作為輔助質粒同pGreen載體轉化四倍體小麥，結果表明，與pSoup載體(轉化效率O)相比,含有Komari片段的改良載體可顯著提高四倍體小麥Ofanto的轉化效率(平均轉化效率3.0%，最高可達9.7%)。用此改良載體在另一四倍體小麥Steward的轉化中，也獲得了一個較高的轉化效率(平均轉化效率
4.7%，最高可達12.3%)。Afolabi等通過在pSoup質粒中引入T-DNA，使之成為T載體，期望與pGreen載體中獨立T-DNA的共轉化,可獲得marker-free的植株。在水稻轉化實驗中，成功分離獲得了無選擇標記的轉基因水稻植株，并發現在Ttl陽性植株中，有50%的植株中標記基因和目的基因位于非連鎖位點。
[0010]Thole等通過對pGreen載體改良，構建了 pClean系列載體。pClean系列雙元載體，包括pClean-Green和pClean-Soup兩種質粒。與pGreen載體相比,pClean系列載體具有如下特點:進一步減少了 T-DNA中的非必需序列(全長102nt，包括52nt的多克隆位點，而pGreen T-DNA結構全長777nt，包含728nt的多克隆位點);降低了 pClean-G與pSoup載體的同源性，增加了質粒的穩定性，pClean-G/pClean-S可與pGreen/pSoup匹配使用；優化了部分載體的LB序列，使其與胭脂型和章魚堿型T-DNA的LB序列一致，擴大了宿主范圍；部分質粒的RB外添加了額外VirGwt基因以提高轉化效率；pClean-S質粒上添加了獨立的T-DNA,可用于多基因的傳遞或marker-free植株的產生；pClean_G質粒LB外的骨架序列上含有多個單酶切位點，便于backnone的利用，如通過在backnone上插入選擇標記基因，可獲得maker-free植株的載體；部分載體含有雙LB序列，以降低T-DNA的通讀頻率,減少骨架序列的整合。
[0011]綜上所述，上述研究只采用了一種載體構建策略并應用于個別植物的遺傳轉化，目前在小麥和其它作物中的應用尚未見報道。此外，大部分載體的構建是為了驗證農桿菌傳遞2獨立T-DNA，產生mark-free植株的可行性，因此很多載體只在模式植物如煙草等中進行了轉化，并未在重要農作物如小麥中應用。另外，目前報道的用于產生marker-free植株的載體，多數是通過傳 統酶切連接構建的，很多載體是以gus基因為目的基因的，因為受酶切位點的限制，有些載體不便于用于目的基因的替換。

【發明內容】

[0012]本發明的一個目的是提供一種用于獲得無標記轉基因植物的農桿菌專用載體組合物。
[0013]本發明提供的專用載體組合物(5TBTG154)，由獨立包裝的重組載體和pClean系列載體的pClean-Soup載體組成；
[0014]所述重組載體(pG1854-UG)為將目的基因和標記基因插入pClean系列載體的pClean-Green載體2個不同的T-DNA區中，得到表達所述目的基因和標記基因的重組載體。
[0015]上述的載體組合物中，
[0016]所述目的基因通過通過gatway重組到pClean系列載體的pClean-Green載體的T-DNA 區；
[0017]所述標記基因以兩端分別融合2LB和RB的DNA分子的形式插入pClean系列載體的酶切位點間，形成另一個含有標記基因的T-DNA區。
[0018]上述的載體組合物中，
[0019]所述pClean-Green 載體為 pCG181 或 pCG185 ；所述 pClean-Green 載體具體為pCG185 ；
[0020]所述pClean-Soup 載體為 pALl54。
[0021]上述的載體組合物中，
[0022]所述目的基因為⑶S基因，所述標記基因為bar基因。 [0023]上述的載體組合物中，
[0024]所述gus基因以gus表達盒的形式插入所述pClean-Green載體中；所述gus表達盒包括啟動子Ub1、gus基因和終止子Nos ；
[0025]所述兩端分別融合2LB和RB的DNA分子包括LB、第二個LB、啟動子ub1、bar基因、終止子Nos和RB。
[0026]上述的載體組合物中，所述DNA分子的核苷酸序列為序列表中序列I自5’末端第1-3149位所示的核苷酸；序列I自5’末端第10-34位核苷酸為LB序列，35-60為間隔序列，61-85為LB序列，第1009-3004位核苷酸為ubi，第421-972位核苷酸為bar，第147-406位核苷酸為nos，第3079-3103位核苷酸為RB。
[0027]所述gus表達盒的核苷酸序列為序列表中序列2所示的核苷酸。
[0028]序列2所示的ub1:gus:nos表達盒，自5’末端第1-2034位核苷酸為ub1、自5’末端第2044-4059位核苷酸為gus、自5’末端第4069-4377位核苷酸為nos。
[0029]所述重組載體按照如下方法制備:
[0030]I)將 DNA 片段 attRl-cmR-ccdB_attR2 插入所述 pClean-Green 載體,得到中間載體A ;
[0031]2)將所述以兩端分別融合2LB和RB的DNA分子的形式插入所述中間載體A酶切位點間，，形成另一個含有標記基因的T-DNA區，得到中間載體B ；
[0032]3)將所述目的基因與入門載體進行TOPO反應得到入門重組載體，再將所述入門重組載體與所述中間載體B進行LR反應，使所述目的基因插入所述中間載體B的另一T-DNA區，得到重組載體。
[0033]所述DNA片段attRl-CmK-CCdB-attR2的核苷酸序列為序列表中的序列3。
[0034]上述的載體組合物在鑒定或培育無標記轉基因植物中的而應用也是本發明保護的范圍；所述培養為利用農桿菌轉染植物進行；
[0035]所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；
[0036]所述單子葉植物具體為小麥。
[0037]本發明的另一個目的是提供一種用于獲得無標記轉基因植物的方法。
[0038]本發明提供的方法，包括如下步驟:
[0039]I)將上述的載體組合物中的重組載體和pClean-Soup載體共轉染到植物外植體中，得到TO代轉基因植物；
[0040]2)從TO代轉基因植物中選取目的基因和標記基因共表達的TO代轉基因植物，進行播種，收獲Tl代轉基因植物；
[0041]3)選取所述Tl代轉基因植物中無標記基因且有目的基因的植株，得到無標記轉基因植株。
[0042]上述選取所述Tl代轉基因植物中無標記基因且有目的基因的植株的方法如下:
[0043]鑒定無標記基因bar的方法為PCR檢測或BAR氨鹽檢測；[0044]鑒定有目的基因gus的方法為PCR檢測或⑶S染色。
[0045]上述方法中，所述植物外植體為胚；
[0046]所述目的基因為gus基因，所述標記基因為bar基因。
[0047]上述方法中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；
[0048]所述單子葉植物具體為小麥。
[0049]本發明利用pClean雙元載體系列中的pClean_G181、pClean_G185和pClean-S167作為基礎載體，對其T-DNA和載體骨架進行了一系列改良，如在pClean_G181、pClean_G185、pClean-S167T_DNA內引入Gateway系統，便于載體的快速構建；pClean-S167T-DNA內分別引入Ubiqutin啟動子驅動的bar選擇標記基因，可直接用于單子葉轉化中的篩選標記；在pClean_G181和pClean_G185載體的backnone上插入了帶不同T-DNA邊界結構的bar表達盒,如含多個左邊界或獨立T-DNA等。構建了系列Gateway兼容的新型pClean安全高效雙元載體,并用此轉化小麥，成功獲得了 marker-free轉化植株。
[0050]本發明的實驗證明，本發明通過gateway重組技術直接把目的基因或表達盒定向引入目的載體的T-DNA內，而另一 T-DNA內含有選擇標記基因bar。利用此系統，通過把目的基因和選擇基因分別置于同一質粒的兩T-DNA內或2質粒的T-DNA內或把標記基因置于載體骨架上，通過農桿菌轉化，可獲得無選擇標記的轉基因小麥。所述獲得無標記轉基因小麥的方法是，通過2個獨立的T-DNA或載體骨架與T-DNA共轉化小麥未成熟胚，經篩選獲得轉基因植株，整合到 染色體不同位點的非連鎖的T-DNA植株，經自交和后代分離，通過PCR檢測，便可獲得無標記的轉基因小麥植株。利用本發明可進行植物尤其是小麥、玉米和水稻表達載體的高通量構建和培育無選擇標記的轉基因小麥、玉米和水稻。
[0051]從上述可以看出，本發明利用2種組合載體可以獲得高的篩選無bar基因而只含有gus的無標記轉基因植株效率，其中利用標記基因和目的基因在不同載體的T-DNA區5G7B組合物和利用標記基因和目的基因在同一載體的兩個不同T-DNA區5TBTG154組合物，均可以獲得高轉化效率(分別為2.8±0.8%和4.0±2.1%)。結合后代獲得無選擇標記的轉基因植株比例(分別為23.4%和19.7%)，我們認為，這兩個載體組合更適合于獲得無選擇標記的轉基因植物研究。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0052]圖1為pClean雙元載體
[0053]圖2為Gateway兼容的pClean雙元載體酶切鑒定
[0054]圖3 為 pENTR/D-T0P0_ub1:bar:nos 載體構建及驗證
[0055]A:ub1: bar: nos 表達盒的擴增；B:pENTR/D-T0P0_ub1: bar: nos 菌液 PCR 檢測；C:SspI酶切鑒定；D:載體結構。
[0056]圖4為中間載體pG185_ub1:bar:nos載體
[0057]A:Pme1-PacI酶切驗證；B:載體結構
[0058]圖5 為 pCG1852、pCG1853 和 pCG1854 載體的構建
[0059]圖6為pCS1671-UB載體的構建
[0060]A:菌液PCR檢測結果；B:載體結構
[0061]圖7 為 T0P0_ub1: gus:nos 載體構建[0062]圖8為LR重組在各載體中引入gus cassette
[0063]圖9為用于農桿菌轉化的5個載體組合
[0064]圖10為農桿菌介導的不同載體組合轉化小麥過程
[0065]圖11為轉5G7B載體部分植株的PCR檢測
[0066]M =Marker DL2000 ；CK:非轉基因植株;1_15:轉基因植株。其中株系1、2、4、6、9、
11、12、13為bar、gus共整合植株;3、5、7、8、10、14、15為只含bar的植株。
[0067]圖12為TO代轉5G7B小麥的Southern雜交
[0068]左圖為Southern雜交圖；右圖為pG1851_UG載體結構圖
[0069]圖13為Ttl代轉5G7B小麥獨立株系后代個體在Tl代的分離分析
[0070]圖14為Ttl代轉5G7B小麥獨立株系后代個體的遺傳分離分析
[0071 ] A:bar和gus基因的PCR檢測。bar和gus PCR產物混合跑樣；B:⑶S染色驗證；C:bar表達驗證;圖A、B、C中1-15相對應。
[0072]圖15為邊界整合檢測各引物位置示意圖
[0073]圖16為5G7B株系 邊界整合PCR檢測結果
【具體實施方式】
[0074]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0075]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0076]質粒pGreenll-UB 記載在如下文獻中:Hellens RP, Edwards EA, LeylandNR，Bean Sj Mullineaux PM.2000.pGreen: a versatile and flexible binary Tivector for Agrobacterium-mediated plant transformation.Plant MolecularBiology42, 819 - 832，公眾可從中國農業科學院作物科學研究所獲得。
[0077]質粒pClean 系列包括:pClean_G181 (pCG181)、pClean_G185 (pCG185)、pClean_S167 (pCS167)，上述質粒均記載在如下文獻中:Tholej V.，Worland B.，SnapeJW.，Vain P.2007.The pCLEAN dual binary vector system for Agrobacterium-mediatedplant transformation.Plant Physiologyl45:1211-1219.公眾可從中國農業科學院作物科學研究所獲得。
[0078]質粒PAL156 均記載在如下文獻中:He，Y.，Jones, HD.，Chen, XM.，Chen,Wang,DW.，Li，KX.，XiajLQ.2010.Agrobacterium-mediated transformation ofdurum wheat(Triticum turgidum L.var.durum cv Stewart)with improvedefficiency.61:1567-1581.公眾可從中國農業科學院作物科學研究所獲得。
[0079]質粒PAL154 記載在如下文獻中:He，Y.，Jones, HD.，Chen, XM.，Chen, Wang, DW.，Li,KX., Xiaj LQ.2010.Agrobacterium-mediated transformation of durum wheat (Triticumturgidum L.var.durum cv Stewart)with improved efficiency.61:1567-1581.公眾可從中國農業科學院作物科學研究所獲得。
[0080]PrimerStar平末端高保真聚合酶、Taq DNA聚合酶、dNTP購自大連寶生物工程有限公司。減性憐酸酶 SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase)、Klenow Fragment 和 T4DNA聚合酶購自Ferments公司。各種限制性內切酶購自NEB公司。pENTR? DirectionalTOPO Cloning Kits、Gateway Vector Conversion System with One Shot ccdBSurvival2TICompenent Cells購自 Invitrogen公司。DH5 α 感受態、克隆載體pEASY-Blunt購自北京全式金生物技術有限公司。質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、PCR產物純化試劑盒購自天根生化科技有限公司。其它試劑均為國產分析純產品。
[0081]實施例1、用于獲得無標記轉基因植物的農桿菌專用載體組合物
[0082]一、Gateway 兼容的 pCG1811、pCG1851、p C S1671 通用雙元載體的構建
[0083]pCG181、pCG185、pCS167載體的結構如圖1，分別在其T-DNA內插入ccdB讀碼框的DNA片段attRl-CmK-CCdB-attR2 (該DNA片段的核苷酸序列為序列表中的序列3，購自Invitrogen公司),得到雙元載體pCG1811、pCG1851、p C S1671 ;具體過程如下:
[0084]l、pCG1811載體的構建
[0085]I)去P的平末端載體骨架的獲得
[0086]將pCG181載體用Not I酶切，回收2718bp的酶切產物；再將上述回收的酶切產物依次經Klenow片段補平突出末端、純化、去P反應，得到去P的平末端pCG181載體骨架，具體步驟和體系如下:
[0087]將上述回收的酶切產物經Klenow片段補平突出末端，得到補平產物；
[0088]反應體系如表1所示:
[0089]表1為補平突出末端反應體系
【權利要求】
1.一種用于獲得無標記轉基因植物的農桿菌專用載體組合物，由獨立包裝的重組載體和pClean系列載體的pClean-Soup載體組成； 所述重組載體為將目的基因和標記基因插入pClean系列載體的pClean-Green載體2個不同的T-DNA區中，得到表達所述目的基因和標記基因的重組載體。
2.根據權利要求1所述的載體組合物，其特征在于: 所述目的基因通過通過gatway重組到pClean系列載體的pClean-Green載體的T-DNA區； 所述標記基因以兩端分別融合2LB和RB的DNA分子的形式插入pClean系列載體的pClean-Green載體的酶切位點間，形成另一個含有標記基因的T-DNA區。
3.根據權利要求1或2所述的載體組合物，其特征在于: 所述 pClean-Green 載體為 pCG181 或 pCG185 ;所述 pClean-Green 載體具體為 pCG185 ； 所述 pClean-Soup 載體為 pAL154。
4.根據權利要求3所述的載體組合物，其特征在于: 所述目的基因為GUS基因，所述標記基因為bar基因。
5.根據權利要求4所述的載體組合物，其特征在于: 所述gus基因以gus表達盒的形式插入所述pClean-Green載體中；所述gus表達盒包括啟動子ub1、gus基因和終止子Nos ； 所述兩端分別融合2LB和RB的DNA分子包括LB、第二個LB、啟動子ub1、bar基因、終止子Nos和RB。
6.根據權利要求1-5中任一所述的載體組合物，其特征在于: 所述DNA分子的核苷酸序列為序列表中序列I自5’末端第1-3149位所示的核苷酸； 所述gus表達盒的核苷酸序列為序列表中序列2所示的核苷酸。
7.權利要求1-6中任一所述的載體組合物在鑒定或培育無標記轉基因植物中的而應用； 所述植物為單子葉植物或雙子葉植物； 所述單子葉植物具體為小麥。
8.一種用于獲得無標記轉基因植物的方法，包括如下步驟: 1)將權利要求1-6中任一所述的載體組合物中的重組載體和pClean-Soup載體共轉染到植物外植體中，得到TO代轉基因植物； 2)從TO代轉基因植物中選取目的基因和標記基因共表達的TO代轉基因植物，進行播種，收獲Tl代轉基因植物； 3)選取所述Tl代轉基 因植物中無標記基因表達且有目的基因表達的植株，得到無標記轉基因植株。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于:所述植物外植體為胚； 所述目的基因為gus基因，所述標記基因為bar基因。
10.根據權利要求8或9所述的方法，其特征在于: 所述植物為單子葉植物或雙子葉植物； 所述單子葉植物具體為小麥。
【文檔編號】A01H5/00GK103966257SQ201410160278
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年4月21日 優先權日:2014年4月21日
【發明者】夏蘭琴, 王根平, 杜文明, 孫永偉 申請人:中國農業科學院作物科學研究所