一種球孢白僵菌菌株scwj-2及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種球孢白僵菌菌株(Beaueria bassaria(Balsamo)Vuillemin)SCWJ-2，該菌株的培養方法，由該菌株制備的孢子粉，以及該孢子粉在制備生防制劑中的應用，所述生防制劑可用于煙粉虱、西花薊馬、蔥蚜和/或桃蚜的防治。使用該生防制劑能對高溫環境下的昆蟲進行防治，且防治效果好，田間防治效果均高于75％。CGMCC No.92532014.05.28
【專利說明】-種球孢白僵菌菌株SCWJ-2及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬于農業生物【技術領域】，具體涉及一種球孢白僵菌菌株SCWJ-2及其在防 治煙粉虱，西花薊馬，桃蚜和蔥蚜上的應用。

【背景技術】
[0002] 煙粉風Bemisatabaci(Gennadius),西花薊馬Frankliniella occidentalis(Pergand)和桃姆Myzuspersicae(Sulzer)均是世界性的重要農業害蟲，寄 主包括蔬菜，花舟和煙草等多種經濟作物。蔥姆Neotoxopteraformosana(Takahashi)是 近年來我國蔥、蒜和韭菜上為害逐年加重的害蟲之一。這些害蟲的共同特點通過刺吸或銼 吸式口器取食植物汁液對作物造成嚴重的直接為害，更為嚴重的是，它們作為植物病毒病 的傳播媒介給溫室和露地多種作物造成極大的經濟損失。這些害蟲的防治通常以化學防治 為主，而它們對化學合成的殺蟲劑抗性的發展引起人們對其它害蟲防治策略的興趣，其中 微生物防治可能扮演著重要角色（BiologicalcontrolofBemisiatabaciwithfungi， FariaM.，WraightS.P.，CropProt. 2001. 20 :767-778.)。
[0003] 在眾多的微生物防治因子中，蟲生真菌是防治具有刺吸式（或銼吸式）口器 昆蟲的最有前途的一種病原物，因為它具有直接穿透昆蟲表皮侵染的獨特作用方式 (BiologicalcontrolofBemisiatabaciwithfungi.FariaM,WraightSP.Crop Prot. 2001. 20 :767-778.)。盡管有大量研究篩選出對這些害蟲高毒力的真菌菌株，但是這 些實驗大多是在真菌的適宜溫度下完成的。煙粉虱、蔥蚜等均為喜溫昆蟲，在炎熱的夏季種 群發生達到最高峰；西花薊馬和桃蚜對高溫的喜好和耐受能力雖然不如前兩種昆蟲，但它 們在田間自然發生時的溫度也經常超出了真菌的適宜溫度范圍。不利環境溫度能降低真 菌對于寄主昆蟲的侵染效率（SelectionofBeauveriabassianaisolatesforcontrol ofthewhitefliesBemisiatabaciandTrialeurodesvaporariorumonthebasisof theirvirulence,thermalrequirements,andtoxicogenicactivity.Quesada-Moraga E，MaranhaoE.A.Aetal.BiologicalControl. 2006. 36:274-287·)。以前的研究證明 了同一種真菌的不同菌株間有著顯著的耐熱性差異（ColdactivityofBeauveriaand Metarhizium,andthermotoleranceofBeauveria.FernandesE.K.K. ,RangelD.E.N.et al.JournalofInvertebratePathology. 2008. 98 :69-78.;對西花薊馬高效的球抱白僵 菌菌株篩選及產孢特性研究.李銀平，雷仲仁，王海鴻.中國生物防治學報.2013. 29 (2): 219-226.)。因此，為了將蟲生真菌有效地應用到害蟲的綜合治理中，不僅要考慮它對靶標 害蟲的毒力，還要考慮它對于害蟲發生棲境溫度的適合度。此外，產孢量也是真菌能否大量 生產和實際應用的重要考核指標。


【發明內容】

[0004] 球抱白僵菌（Beauveriabassiana(Balsamo)Vuillemin)是侵染許多種昆蟲的常 見的病原物，大量的研究證明有許多有效侵染煙粉虱、西花薊馬，桃蚜和蔥蚜的菌株。為了 能在高溫環境下，例如大棚環境（其溫度可高達42-46攝氏度）下有效防治靶標昆蟲，以及 將篩選出的菌株大量生產和應用。本申請進行了一系列實驗，包括（a)篩選了 21株不同地 理位置和寄主來源的白僵菌菌株對靶標昆蟲的致病性，（b)根據（a)的結果，比較了高致病 性菌株的產孢量，（c)根據（a)和（b)的結果，檢查了高致病性，高產孢量菌株的孢子對高 溫的耐受性。最終，我們篩選出了SCWJ-2性狀優良的菌株可以作為上述靶標昆蟲的有效生 防菌株。
[0005] 因此，本申請提供一種球孢白僵菌（Beauveriabassiana)菌株SCWJ-2,保藏于中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3 號，保藏號為CGMCCNo. 9253,保藏日期為2014年5月28日，屬于叢梗孢目，叢梗孢科，球孢 白僵菌屬。
[0006] 本發明還提供一種上述菌株的培養方法。
[0007] 優選的，所述培養方法包括以下步驟：
[0008] 將球孢白僵菌SCWJ-2接種于薩氏培養基SDAY上，所述薩氏培養基SDAY含有 1 %的蛋白胨、1 %的酵母膏，4%的葡萄糖和2%的瓊脂。優選的，培養條件為保持溫度 25-27°C，培養7-10d，生產出活化好的SCWJ-2的孢子粉。
[0009] 本發明還提供一種菌株SCWJ-2的孢子粉，所述孢子粉由上述菌株SCWJ-2經上述 培養方法培養制備而成。
[0010] 本發明還提供一種上述活化孢子粉在制備生防制劑中的應用。優選的，所述孢子 粉和其他的殺蟲劑聯合應用。
[0011] 本發明還提供一種制備生防制劑的方法。將上述孢子粉經過一級種子液培養、二 級種子液培養、固相發酵和孢子粉的干燥和收獲步驟制備而成。
[0012] 優選的，所述步驟為以下步驟：
[0013] (1)一級種子液的培養
[0014] 種取上述活化好的SCWJ-2的孢子粉，接入薩氏培養液SDY得到種子液，所述薩 氏培養液SDY含有1 %的蛋白胨、1 %的酵母膏，4%的葡萄糖，種子液的初始孢子濃度為 I.OXIO6個·πιΓ1，在25°C、120r·mirT1條件下振蕩培養48hr，得到一級種子液。
[0015] ⑵二級種子液的培養
[0016] 將一級種子液按5%的接種量接入薩氏培養液SDY培養液，在7升液體發酵罐中培 養。加入發酵液體積的0.5%豆油，培養溫度為25-271：，轉速為100-200印111，初始溶氧量為 50%以上。培養40hr后得到二級種子液。
[0017] (3)固相發酵
[0018] 用開水浸泡大米30分鐘，撈出控去多余水份，121°C滅菌30分鐘后，按IOOg大米 加入15ml二級種子液的比例接菌，發酵器具為20X30cm的塑料袋。接種后鋪放于25-26°C 的條件下培養7-10d。
[0019] ⑷孢子粉的干燥和收獲
[0020] 固相發酵后的物料置于30°C下干燥3d，再用孢子收獲機，例如Mycoharvester Company，UK的收獲機，收獲孢子粉。
[0021] 本發明還提供一種生防制劑，由上述方法制備而成。
[0022] 本發明還提供一種上述生防制劑在防治靶標昆蟲的應用，所述靶標昆蟲為煙粉 虱、西花薊馬、蔥蚜和/或桃蚜。優選的所述昆蟲生活在高溫環境。更優選的，所述高溫環 境為42-46°C的大棚環境。
[0023] 本發明還提供一種防治靶標昆蟲的方法，所述方法包括向易感作物噴灑上述生防 制劑，所述靶標昆蟲為煙粉虱、西花薊馬、蔥蚜和/或桃蚜。優選的所述昆蟲生活在高溫環 境。更優選的，所述高溫環境為42_46°C的大棚環境。
[0024] 本發明篩選得到的菌株侵染率高，致病力強，對煙粉虱4齡若蟲8天內的累積死亡 率達到73. 2%，致死中時LT5tl為4. 48天；對西花薊馬2日齡成蟲8天內的累積死亡率達到 89%，致死中時LT5tl為4. 14天；對蔥蚜1日齡成蟲5天內的累積死亡率達到86%，致死中 時LT5tl為2. 98天；對桃蚜1日齡成蟲5天內的累積死亡率達到95 %，致死中時LT5tl為2. 70 天；產孢量高，為3. 82XIO8個孢子/cm2 ;耐熱性好，45°C處理a后，SCWJ-2的相對萌發率 仍然高達79. 4%。其各項綜合指標表現良好，可以有效的防治煙粉虱、西花薊馬、蔥蚜和桃 蚜，尤其適合在大棚等高溫環境下應用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1 :球孢白僵菌對煙粉虱4齡若蟲8天的累計死亡率和致死中時LT5tl(MeaniSE)
[0026] 圖2 :不同球孢白僵菌菌株的產孢量
[0027] 圖3:不同菌株的耐熱性比較

【具體實施方式】
[0028] 下面結合實施例進一步說明本發明，應當理解，這些實例不能作為本發明的限制， 在不背離本發明精神和實質的情況下，所作的修改或替換均屬于本發明的范圍。若未特別 指明，下述實施方案中的手段為本領域所熟知的常規手段。
[0029] 實施例1篩選毒力高的菌株
[0030] 1. 1昆蟲種群
[0031] 煙粉虱于2013年從中國農業科學院廊坊科研基地的溫室大棚中的煙草上采集， 并在本試驗室中用甘藍苗飼養2-3代。甘藍苗放在養蟲籠（40X40X30cm)中，飼養條件 為26±2°C，光周期為12 : 12(L:D)。為了使甘藍葉片上有足夠且均勻的煙粉虱若蟲用 于球孢白僵菌的毒力試驗，試驗時挑選高約25cm，長有5-6片嫩葉的甘藍幼苗，置于養蟲籠 中，48h后取出并驅趕所有成蟲，使每片葉片上約有100-150只卵。取出后的幼苗放入光照 培養箱，條件為26±1°C、12 : 12(L:D)，待煙粉虱的卵發育成4齡若蟲時剪下葉片待用。
[0032] 西花薊馬最初于2006年從門頭溝區碧坤蔬菜種植基地的茄子上采集，并在本試 驗室中用菜豆豆莢多代飼養。豆莢放在兩端開口的玻璃筒中，兩端用尼龍紗封口。飼養條 件26±2°C，光周期為12 : 12(L:D)。其間不規律地從田間采集個數不等的個體放入本 種群中，以防種群衰退。
[0033] 蔥蚜于2014年4月從北京市順義區植保站實驗基地的韭菜大棚中采集，然后在本 實驗室用亜菜飼養。飼養時，將育有亜菜的花盆置于養蟲籠中（40X40X30cm)，然后將米集 的蔥蚜接種上。飼養條件為26°C、光周期12 : 12(L:D)。
[0034]桃蚜于2014年4月從中國農業科學院科研溫室內的甘蘭苗上采集，并在本試驗室 中用甘蘭苗飼養。飼養條件26±2°C，光周期為12 : 12(L:D)。
[0035] I. 2供試菌株
[0036] 本試驗所用菌株來源于全國各地被白僵菌天然侵染的昆蟲上。采集的菌株經分離 后接種于斜面培養基上并在4°C條件下儲存于本試驗室。
[0037]

【權利要求】
1. 一種球抱白僵菌（Beaueria bassaria (Balsamo) Vuillemin)菌株 SCWJ-2,其特征在 于，該菌株保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CGMCC No. 9253,保藏日期為2014年 5月28日，屬于叢梗孢目，叢梗孢科，球孢白僵菌屬。
2. 權利要求1的球孢白僵菌菌株SCWJ-2的培養方法，其特征在于，將菌株SCWJ-2接 種于薩氏培養基SDAY上進行培養，所述薩氏培養基SDAY含有1%的蛋白胨、1%的酵母膏， 4%的葡萄糖和2%的瓊脂。
3. 如權利要求2所述的培養方法，其特征在于，所述培養方法將球孢白僵菌SCWJ-2接 種于薩氏培養基SDAY上，保持溫度25-27°C，培養7-10d，生產出活化好的SCWJ-2的孢子 粉。
4. 一種菌株SCWJ-2的孢子粉，其特征在于，所述孢子粉由權利要求2-3任意培養方法 培養制備而成。
5. 權利要求4的孢子粉在制備生防制劑中的應用。優選的，所述孢子粉和其他的殺蟲 劑聯合應用。
6. -種包含菌株SCWJ-2的生防制劑的制備方法，其特征在于，將權利要求4的孢子粉 經過一級種子液培養、二級種子液培養、固相發酵和孢子粉的干燥和收獲步驟制備而成。
7. 如權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟為以下步驟： (1) 一級種子液的培養 取活化好的SCWJ-2的孢子粉，接入薩氏培養液SDY得到種子液，所述薩氏培養液 SDY含有1 %的蛋白胨、1 %的酵母膏，4%的葡萄糖，種子液的初始孢子濃度為1. OX 106 個· ι?Γ1，在25°C、120r · mirT1條件下振蕩培養48hr，得到一級種子液。 (2) 二級種子液的培養 將一級種子液按5%的接種量接入薩氏培養液SDY培養液，在7升液體發酵罐中培養。 加入發酵液體積的〇. 5%豆油，培養溫度為25-27°C，轉速為100_200rpm，初始溶氧量為 50%以上。培養40hr后得到二級種子液。 (3) 固相發酵 用開水浸泡大米30分鐘，撈出控去多余水份，121°C滅菌30分鐘后，按100g大米加入 15ml二級種子液的比例接菌，發酵器具為20X 30cm的塑料袋。接種后鋪放于25-26°C的條 件下培養7-10d。 (4) 孢子粉的干燥和收獲 固相發酵后的物料置于30°C下干燥3d，再用孢子收獲機收獲孢子粉。
8. -種生防制劑，所述生防制劑由權利要求6-7任意方法制備而成。
9. 權利要求8所述生防制劑在防治靶標昆蟲中的應用，所述靶標昆蟲為煙粉虱、西 花薊馬、蔥蚜和/或桃蚜。優選的所述昆蟲生活在高溫環境。更優選的，所述高溫環境為 42-46°C的大棚環境。
10. -種防治靶標昆蟲的方法，所述方法包括向易感作物噴灑權利要求8所述生防制 齊U，所述靶標昆蟲為煙粉虱、西花薊馬、蔥蚜和/或桃蚜。優選的所述昆蟲生活在高溫環境。 更優選的，所述高溫環境為42-46°C的大棚環境。
【文檔編號】A01N63/04GK104263655SQ201410449469
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月1日 優先權日:2014年9月1日
【發明者】王海鴻, 王登杰, 張桃, 雷仲仁 申請人:中國農業科學院植物保護研究所