一種過表達gma-miR156b培育高產株型植物的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用gma-miR156b及其前體基因培育高產植物的方法，首先構建含有SEQ ID NO：2所示microRNA前體序列的重組表達載體，然后利用此重組表達載體構建轉化體，再利用此轉化體侵染目的植物，篩選得到與正常植物相比具有多分枝、多莢、多籽粒的高產轉基因植物。通過在大豆植株中過表達上述microRNA，可以顯著增加大豆的分枝數，由平均的2個分枝增加到8個分枝，轉基因大豆的單株莢數也增加了59％，單株莢粒數也增加了2-3倍。通過在小麥植株中過表達上述microRNA，發現轉基因小麥的分蘗數由平均的3.3個分蘗增加到4.4個，小麥穗長、穗粒數、單穗平均粒重均顯著增加。
【專利說明】-種過表達gma-miR156b培育高產株型植物的方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種植物中與株型和產量相關的microRNA，特別涉及來源于大豆的與 株型發育相關的gma-miR156b及其在培育高產大豆及小麥新品種方面的應用。

【背景技術】
[0002] 大豆和小麥是非常重要的、具有特殊經濟價值的作物。株型是大豆和小麥植株整 體特征的集中表現，在大豆和小麥高產育種中發揮著非常重要的作用。大豆和小麥株型包 括株高、節數、莖粗的動態變化、分枝/分蘗數、分枝長度和角度等植株形態特征。在生產 中大豆和小麥的抗倒伏能力是其廣適性栽培及其在不同環境條件下高產穩產的重要條件 (Mancuso and Caviness, 1991)。具有理想株型的大豆和小麥品種具有更好的抗倒伏能力。
[0003] miRNA是近年來在生物體中發現的一類長度約為20-24nt非編碼的小分子RNA，通 過序列互補與特定靶基因的mRNA結合，因引起mRNA降解或抑制mRNA翻譯而調控一些重要 生理過程，被認為是植物重要性狀分子調控的關鍵或主控調節元件（Master regulators), 已經成為世界生物科學研究的熱點和前沿。


【發明內容】

[0004] 本發明要解決的技術問題是提供一種利用gma-miR156b及其前體基因培育多分 枝、多莢、多籽粒高產植物的方法。
[0005] 為解決上述技術問題，本發明所采取的技術方案如下。
[0006] 序列表中SEQ ID N0 :1所示gma-miR156b的在培育多分枝和/或多莢和/或多籽 粒株型植物中的應用。
[0007] 作為本發明的一種優選技術方案，在植物中過表達SEQ ID N0 :1所示的 gma-miR156b，培育出具有多分枝和/或多莢和/或多籽粒株型的轉基因植物。
[0008] 作為本發明的一種優選技術方案，首先構建含有gma_miR156b前體序列的重組表 達載體，然后利用此重組表達載體構建轉化體，再利用此轉化體侵染目的植物，篩選得到與 正常植物相比具有多分枝、多莢、多籽粒的高產轉基因植物；所述gma-miR156b前體序列如 SEQ ID N0 :2 所示。
[0009] 作為本發明的一種優選技術方案，構建含有SEQ ID N0 :2所不多核苷酸序列的重 組表達載體的步驟為：
[0010] 1)、首先以植物葉片DNA為模板，擴增獲得SEQ ID N0 :2所示多核苷酸序列并連接 至T載體上，然后用限制性內切酶Age I和BamH I酶切所得T載體質粒，回收酶切產物；
[0011] 2)、然后用限制性內切酶Age I和BamH I酶切空載體pEGAD，回收載體骨架；
[0012] 3)、最后用T4連接酶將步驟1)的酶切產物和步驟2)的載體骨架連接；
[0013] 4)、將步驟3)的連接產物熱激轉化大腸桿菌感受態DH5 α菌株，37 °C過夜培養，挑 取陽性克隆進行測序驗證，得重組表達載體PEGAD-35S: :gma-miR156b。
[0014] 作為本發明的一種優選技術方案，采用液氮凍溶法轉化農桿菌EHA105得轉化體， 具體操作步驟包括：
[0015] a.取出凍存的200 μ 1感受態農桿菌細胞，融化后加入5-10 μ 1重組表達載體的質 粒DNA，輕彈管壁混勻，冰上放20-30min ;
[0016] b.放入液氮中5min后取出，將管轉入37°C、5min融化后，加入800μ 1YEP液體培 養基，28°C低速振蕩、150rpm，4-5h ;
[0017] d. 10000rpm，30sec，去上清，加100μ 1YEP液體培養基，懸浮菌體后涂板；
[0018] e.置于28°C培養至白色轉化子長出，挑取陽性單克隆搖菌，用于植株子葉節轉 化。
[0019] 作為本發明的一種優選技術方案，所述目的植物為大豆或小麥。
[0020] 本發明還包括gma-miR156b的前體序列,其具有SEQ ID N0 :2所示的核苷酸序列， 在植物細胞內被剪切并表達得到對應的microRNA。
[0021] 本發明還包括含有gma_miR156b前體序列的重組表達載體。
[0022] 本發明還包括含有gma_miR156b前體序列的轉化體。
[0023] 本發明還包括擴增gma_miR156b前體序列的引物對，其核苷酸序列如SEQ ID N0 : 3 和 SEQ ID NO :4 所示。
[0024] 采用上述技術方案所產生的有益效果在于： 申請人:的系列實驗證明，通過在大豆 植株中過表達gma-miR156b，可以顯著增加大豆的分枝數，由平均的2個分枝增加到8個分 枝；此外，轉基因植株的單株莢數也增加了 59%，更重要的是，單株莢粒數也增加了 2-3倍； 最終大幅度的提1? 了大?的廣量。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1為實施例1的試驗結果，顯示gma_miR156b在大豆不同組織中的表達模式，可 見其在大豆葉片中的表達水平較高。
[0026] 圖2為gma-miR156b過表達轉基因植株的分子鑒定（實施例2步驟5)，對PCR鑒 定純合的株系（圖2A)進行了草丁膦涂抹（圖2B)及Bar試紙條（圖2C)的分析；從圖中 可見，PCR陽性的轉基因植株也呈現了對草丁膦的抗性，說明Bar基因正常表達，其蛋白具 有膦化麥黃酮乙酰轉移酶的活性。
[0027] 圖3為gma_miR156b在轉基因大豆植株當中的分子鑒定及過表達植株的農藝性 狀分析（實施例2步驟6);結果顯示，在純合轉基因株系中目的基因 gma-miR156b的表 達水平和野生型中的表達相比有明顯提高（圖3A);過表達gma-miR156b的轉基因植株同 對照野生型W82相比，株高沒有顯著變化（圖3C)，但株型發生顯著變化（圖3B);過表達 gma-miR156b可以顯著增加大豆的分枝數，由平均的2個分枝增加到8個分枝（圖3D);此 夕卜，過表達gma-miR156b轉基因植株的單株莢數也增加了 59% (圖3E);更重要的是，單株 莢粒數也增加了 2-3倍（圖3F)。
[0028] 圖4為實施例3步驟5-1中Bar基因的檢測結果，通過PCR方法鑒定出156b-2_3 和156b-5-8兩個獨立來源的陽性轉基因小麥株系。
[0029] 圖5為gma_miR156b在轉基因小麥植株當中的分子鑒定及過表達植株的農藝性狀 分析；圖5-A、B顯示實施例3步驟5-2中轉基因小麥植株同對照野生型科農199相比，穗 長顯著升高；圖5-C顯示轉基因小麥植株同對照野生型相比，分蘗數由平均的3. 3個增加到 4. 4個；圖5-D顯示轉基因小麥植株同對照野生型相比，穗粒數顯著增加；圖5-E顯示轉基 因小麥植株同對照野生型相比，單穗平均粒重顯著增加。

【具體實施方式】
[0030] 以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑公司購買得到的。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質量百分含量。以 下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。
[0031] 實施例lgma_miR156b在大豆中的的表達模式分析
[0032] 通過實時熒光定量PCR技術分析gma_miR156b在大豆葉、莖、根及根瘤中的表達特 性，同時檢測gma-miR156b在轉基因植株中的表達特性。
[0033] (1)材料獲取：實驗所用材料為Wilimas82(威廉姆斯82,下文簡稱W82)，材料按 照以下流程進行處理：大豆種子用70 %的酒精滅菌30S，播種于低氮營養液浸泡的蛭石珍 珠巖（3:1)混合基質中，于培養室中培養，16h光/8h暗，光強7000LUX,溫度26°C，相對濕 度為70 %。播種后7天，每株接種慢生型根瘤菌USDA110菌液（0D_ :0.08) 30ml，在接菌后 28天時取大豆葉、莖、根及根瘤；
[0034] (2)大豆不同組織中RNA的分離：取上步所得的大豆不同組織，提取RNA，具體提取 方法如下：
[0035] ①用液氮在研缽中將材料充分研磨，將50mg-100mg研磨好的粉末放入1. 5ml離心 管中，加入lmL Redzol試劑（Vigorous公司），冰上放置lOmin ;
[0036] ②加入200 μ 1氯仿，200 μ 1 RNA-free NaAC，振蕩均勻后室溫靜置2-3min ;
[0037] ③ 4。(：，12, 000g 離心 lOmin ;
[0038] ④將上清移入另外一個離心管中，加入等體積的異丙醇，振蕩混勻，-20°C沉淀 30min ；
[0039] ⑤ 4。(：，12, 000g 離心 lOmin ;
[0040] ⑥棄上清，用75%的乙醇（DEPC處理過的無菌水配制）洗1-2次；
[0041] ⑦小心去上清（盡力吸干），室溫靜置使RNA干燥；
[0042] ⑧加適量DEPC處理水溶解RNA ;
[0043] ⑨電泳檢測RNA完整性。
[0044] (3)反轉錄 PCR :使用 TIANGEN 公司出品的 FastQuant RT Kit (With gDNase)試 劑盒（目錄號：KR106)對上步所得大豆組織的RNA進行反轉錄克隆：
[0045] ①首先將總RNA末端進行gDNA去除處理，在10 μ 1體系中加入總RNA 5yl5XgDNA Buffer 2yl，RNase-Free ddH20 3 μ1，徹底混勻上述配制的反應液，短暫離 心后，42°C反應3min，放置于冰上；
[0046] ②然后配置反轉錄反應體系：10XFast RT Buffer 2 μ 1，RT Enzyme Mix lul,miR156b RT Primer(SEQ ID NO ：5) 1 μ 1, miR1515a RT Primer 1 μ 1, RNase-Free ddH205 μ 1 ；
[0047] ③將反轉錄反應中的mix加到gDNA去除步驟（步驟①）的反應液中，充分混勻； 42°C，孵育15min ;95°C，孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA可以直接進行下游熒光定量 檢測，或-20°C低溫保存。
[0048] (4)實時熒光定量PCR分析：使用TaKaRa公司出品的SYBR Premix Ex Tag?進行 定量PCR分析；
[0049] ①在20 μ 1體系中加入上步所得cDNA模板2 μ 1、正反向引物各0.4 μ 1、SYBR Primix Ex taq?(2X) 10 μ 1, ROX Reference Dye II (50X)0. 4 μ 1, ddH206. 8 μ 1 ；
[0050] ②擴增程序為：95 °C 30s ;95 °C 5s，60 °C 34s，45cycles ;95 °C 15s，60 °C lmin， 95 °C 15s ;其中，正向引物為：GGACCTGACAGAAGAGAGAG(SEQ ID NO :6);反向引物為： GTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID NO ：7)；
[0051] (5)結果：gma_miR156b在大豆不同組織中的表達模式如圖1所示，結果顯示 gma-miR156b在大豆葉片中的表達水平較高。
[0052] 實施例2、理想高產株型大豆的培育
[0053] 1、Wi 1 imas82 大豆 DNA 的提取
[0054] a.大豆組織于研缽中用液氮研磨，將充分研磨的粉末移至1. 5mL離心管中；加入 500μLCTAB提取液（100mM，Tris-HCl(pH8·0)，4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA(pH8·0)，2% CTAB，使用前加入2mL/100mL β -巰基乙醇），混勻；
[0055] b. 65°C水浴30min，中間輕微振蕩幾次；
[0056] c.置于冰上 5min ;
[0057] d.加等體積的氯仿：異戊醇（24:1)，輕輕混勻；
[0058] e.室溫，靜置lOmin，12000rpm冷凍離心15min，取上清；
[0059] f.加 2倍體積冰乙醇，混勻，_20°C靜置30min ;
[0060] g.離心，排出上清液；
[0061] h. 70 %乙醇lmL漂洗2次，晾干；
[0062] I.無菌水100 μ 1溶解，_20°C冰箱長期保存。
[0063] 2、構建重組表達載體
[0064] (1) gma_miR156b 基因的克隆
[0065] gma-miR156b的前體序列共181bp(SEQ ID NO :2)，根據該序列設計引物對，根據載 體pEGAD多克隆位點，引物末端分別引入Age I和BamH I酶切識別位點，以大豆品種W82 的DNA為模板進行PCR，擴增gma-miR156b的前體序列；引物序列為：
[0066] gma-miR156b-F :5'-TGCACCGGTGGGTTCTATTGGTGGTTG-3'（SEQ ID NO :3)
[0067] gma-miR156b-R :5'-CGGGATCCCGTCTACTTTGGCTAGAAAG-3'（SEQ ID NO :4)
[0068] 擴增程序為：95°C 5 分鐘；95°C 30 秒，57°C 30 秒，72°C 40 秒，26 個循環；72°C 30 秒；
[0069] PCR擴增產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳，采用上海生工膠回收試劑盒回收純化 181bp大小的條帶；
[0070] 回收的DNA片段與pMD19_T載體（Takara公司）連接，10 μ 1體系中加入T vector lyl，solution I 5μ1，回收片段4μ1，混勻混合液，16°C連接過夜，熱擊法轉入E.coli 大腸桿菌感受態細胞，過夜培養，挑陽性克隆，送交invitrogen公司測序。
[0071] (2)重組表達載體的構建
[0072] 1)、提取含有正確測序的gma_miR156b前體基因序列的T載體質粒，用限制性內切 酶Age I和BamH I酶切，回收酶切產物；
[0073] 2)、用限制性內切酶Age I和BamH I酶切空載體pEGAD，回收載體骨架；
[0074] 3)、用T4連接酶將步驟1的酶切產物和步驟2的載體骨架連接；
[0075] 4)、將步驟3的連接產物熱激轉化大腸桿菌感受態DH5 α菌株，37°C過夜培養，挑 取陽性克隆進行測序；測序結果表明，得到了重組質粒PEGAD-35S: :gma-miR156b。
[0076] 3.農桿菌EHA105的轉化
[0077] 采用液氮凍溶法轉化農桿菌，具體操作如下：
[0078] a.取出凍存的200 μ 1感受態細胞，融化后加入5-10 μ 1質粒DNA，輕彈管壁混勻， 冰上放20-30min ;
[0079] b.放入液氮中5min后取出，將管轉入37°C (5min)融化后，加入800μ 1YEP (無抗 性）液體培養基，28°C低速振蕩（150rpm)4-5h;
[0080] cL 10000rpm，30sec，去上清，加 ΙΟΟμΙΥΕΡ液體培養基，懸浮菌體后涂板（含 50mg/ml卡那霉素）；
[0081] e.置28°C培養至白色轉化子長出，挑取陽性單克隆搖菌，用于大豆子葉節轉化；
[0082] 4.農桿菌EHA105介導的大豆子葉節遺傳轉化
[0083] ①以大豆品種W82為材料，取種子材料用氯氣消毒10小時；
[0084] ②在B5培養基（培養基配方：2 %蔗糖，0· 8 %瓊脂粉（sigma)，1 XGAMB0RG B_5BASAL(Phyto Technology Laboratories，貨號：G398)，pH調至 5. 7 左右；）上萌發 5 天， 用手術刀先將大豆帶2cm胚軸切下，放入培養皿中，然后沿著子葉下軸垂直將其切開，留取 下胚軸2mm左右，除去仍然連接在子葉上的胚軸組織；在子葉和子葉下胚軸的連接處的軸 向上作5-7個切口，在活化的農桿菌EHA105中侵染30min (0D6QQ :0. 8左右）；
[0085] ③將外植體轉至共培養培養基（培養基配方：2 %蔗糖，0. 8 %瓊脂粉 (sigma),1. 67mg/L 6-BA, 0. 25mg/L GA3, 0. 1XGAMB0RG B-5 BASAL(Phyto Technology Laboratories,貨號：G398, pH調至5. 4左右；）上共培生長3天后，再轉至誘導培養基 上誘導叢生芽（培養基配方：2%蔗糖，0.8%瓊脂粉（以 81^)，1.671^/16-84，1〇11^/1 glufosinate，lXGAMB0RG B_5BASAL(Phyto Technology Laboratories，貨號：G398)，pH調 至5· 7左右）；
[0086] ④在誘導叢生芽后2周，取已生成的分生組織，在生長點的基部作新的切口（水 平方向的），并將培養組織移入伸長培養基（培養基配方：2%蔗糖，0. 8%瓊脂粉（sigma)， 0. lmg/L IAA, lmg/L Zeatin, 0. 5mg/L GA3, l〇mg/L glufosinate, 1 XMURA SHIGE&SK00G BASAL MEDI0M w/VITAMINS (Phyto Technology Laboratories,貨號：M404)，pH 調至 5. 7 左右）；
[0087] ⑤每兩周將培養物向新的培養基上轉移一次；每次轉移時在外植體的基部作一個 新的水平切口；
[0088] ⑥在6-8周培養以后，將伸長的芽（一般剪取芽長> 4cm)在lmg/ml IBA中蘸 根后移入生根培養基上生根（培養基配方：2%蔗糖，0.8%瓊脂粉（sigma)，0.5XMURA SHIGE&SK00G BASAL MEDI0M w/VITAMINS(Phyto Technology Laboratories，貨號：M404)， pH調至5. 7左右））；培養大約2-4周，長出足量的根系時，進行移栽；
[0089] ⑦將生根的小苗小心移入小花盆中，花盆里放入（進口土：營養土 = 1 :1)培養 土；移栽后需套保鮮袋一周，使苗習慣于土壤的新環境并保持濕度，培養間的溫度于26°C， 一周后取下保鮮袋；
[0090] ⑧待轉基因苗恢復生長后用Bar基因檢測、草丁膦glufosinate(SIGMA，45520)涂 抹葉片以及Bar試紙條（ENVIR0L0GIX，042043)三種方法進行轉化鑒定，收獲Bar基因陽性 轉基因株系，在T1、T2代的陽性植株及T3代的純合轉基因株系進行目的基因的表達分析以 及表型的鑒定。
[0091] 5.轉基因植株的分子鑒定
[0092] 對Τ1和Τ2代陽性的植株后代進行了較為系統的選擇Bar基因表達及基因產物功 能的鑒定。其中包括純合株系PCR鑒定Bar基因、葉片涂抹草丁膦及Bar試紙條的分析。
[0093] 1)PCR檢測反應法：提取大豆基因組DNA用于PCR檢測。檢測Bar基因是 否轉入大豆基因組中。Bar 基因引物：F:CTACATCGAGACAAGCACGGTCAA(SEQ ID N0:8)， R:AGAAACCCACGTCATGCCAGTTC(SEQ ID N0:9)。大豆葉片 DNA 提取方法如下：
[0094] a.大豆組織于研缽中用液氮研磨，將充分研磨的粉末移至1. 5mL離心管中；加入 650mLCTAB提取液（100mM，Tris-HCl(pH8·0)，4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA(pH8·0)，2% CTAB，使用前加入2mL/100mL β -巰基乙醇），混勻；
[0095] b. 65°C水浴30min，中間輕微振蕩幾次；
[0096] c.置于冰上 5min ;
[0097] d.加等體積的氯仿：異戊醇（24:1)，輕輕混勻；
[0098] e.室溫，靜置lOmin，12000rpm冷凍離心15min，取上清；
[0099] f.加 2倍體積冰乙醇，混勻，-20°C靜置30min ;
[0100] g.離心，排出上清液；
[0101] h. 70%乙醇lmL漂洗2次，晾干；
[0102] 無菌水100 μ 1溶解，_20°C冰箱長期保存。
[0103] 2)除草劑涂抹法：將Basta原液稀釋為濃度130mg/L，在大豆第一對三出復葉完 全展開時，以主葉脈為分界線，用記號筆標記半片葉子，然后用棉簽蘸取草丁膦液體擦拭已 標記的半片葉子，5天后觀察葉片對除草劑的反應。如為陽性植株則除草劑涂抹過的葉片 與未涂抹的葉片相比沒有太大變化，如為陰性植株則涂抹過除草劑的葉片明顯變黃甚至枯 萎。
[0104] 3) Bar試紙條快速鑒定法：取少許葉片放入1. 5mL離心管中，用研磨棒研碎葉片， 加入300μ L提取液，攪拌均勻，將試紙條按規定的方向插入混合液中，5min后觀察結果。試 紙條出現2條帶就表明該植株是陽性植株，出現1條說明是陰性植株。
[0105] 6.結果觀察
[0106] l)Bar基因檢測結果：對T1和T2代陽性的植株后代進行了較為系統的選擇Bar 基因表達及基因產物功能的鑒定。其中對PCR鑒定純合的株系（圖2A)進行了草丁膦涂抹 (圖2B)及Bar試紙條（圖2C)的分析。從圖中可見，PCR陽性的轉基因植株也呈現了對草 丁膦的抗性，說明Bar基因正常表達，其蛋白具有膦化麥黃酮乙酰轉移酶的活性。
[0107] 2) gma_miR156b在轉基因植株當中的分子鑒定及農藝性狀分析：由于 gma-miR156b是和Bar基因共轉化的，因此，對上述Bar基因純合株系隨后進行了 gma_miR156b的表達分析。如圖3所不，在純合轉基因株系中目的基因 gma_miR156b的表 達水平和野生型中的表達相比有明顯提高（圖3A)。并對這些轉基因植株的生長習性、株 型特點等農藝性狀進行了跟蹤觀察。發現過表達gma-miR156b的轉基因植株同對照野生型 W82相比，株高沒有顯著變化（圖3C)但株型發生顯著變化（圖3B)。過表達gma-miR156b 可以顯著增加大豆的分枝數，由平均的2個分枝增加到8個分枝（圖3D);此外，過表達 gma-miR156b轉基因植株的單株莢數也增加了 59% (圖3E);更重要的是，單株莢粒數也增 加了 2-3倍（圖3F)，從而大幅度的提高了大豆的產量。因此，gma-miR156b是決定大豆理 想株型和高產的重要的基因。
[0108] 實施例3、理想高產株型小麥的培育
[0109] 1、大豆DNA的提取
[0110] a.大豆組織于研缽中用液氮研磨，將充分研磨的粉末移至1. 5mL離心管中；加入 500yL CTAB 提取液（100mM，Tris-HCl(pH8.0)，4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA(pH8.0)，3% CTAB，使用前加入2mL/100mL β -巰基乙醇），混勻；
[0111] b. 65°C水浴30min，中間輕微振蕩幾次；
[0112] c.置于冰上 5min;
[0113] d.加等體積的氯仿：異戊醇（24:1)，輕輕混勻；
[0114] e.室溫，靜置lOmin，12000rpm冷凍離心15min，取上清；
[0115] f.加2倍體積冰乙醇，混勻，-20°C靜置30min ;
[0116] g.離心，排出上清液；
[0117] h. 70 %乙醇lmL漂洗2次，晾干；
[0118] I.無菌水100 μ 1溶解，-20°C冰箱長期保存。
[0119] 2、構建重組表達載體
[0120] (1) gma_miR156b 基因的克隆
[0121] gma-miR156b的前體序列共181bp(SEQ ID N0:2)，根據該序列設計引物對，根據載 體pEGAD多克隆位點，引物末端分別引入Age I和BamH I酶切識別位點，以大豆品種W82 的DNA為模板進行PCR，擴增gma-miR156b前體的編碼基因；引物序列為：
[0122] gma-miR156b-F :5'-TGCACCGGTGGGTTCTATTGGTGGTTG-3'（SEQ ID NO :3)
[0123] gma-miR156b-R :5'-CGGGATCCCGTCTACTTTGGCTAGAAAG-3'（SEQ ID NO :4)
[0124] 擴增程序為：95°C 5 分鐘；95°C 30 秒，57°C 30 秒，72°C 40 秒，26 個循環；72°C 30 秒；
[0125] PCR擴增產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳，采用上海生工膠回收試劑盒回收純化 181bp大小的條帶；
[0126] 回收的DNA片段與pMD19_T載體（Takara公司）連接，10 μ 1體系中加入T vector lyl，solution I 5μ1，回收片段4μ1，混勻混合液，16°C連接過夜，熱擊法轉入E.coli 大腸桿菌感受態細胞，過夜培養，挑陽性克隆，送交invitrogen公司測序。
[0127] (2)重組表達載體的構建
[0128] 1)、提取含有正確測序的gma_miR156b前體基因序列的T載體質粒，用限制性內切 酶Age I和BamH I酶切，回收酶切產物；
[0129] 2)、用限制性內切酶Age I和BamH I酶切空載體pEGAD，回收載體骨架；
[0130] 3)、用T4連接酶將步驟1的酶切產物和步驟2的載體骨架連接；
[0131] 4)、將步驟3的連接產物熱激轉化大腸桿菌感受態DH5a菌株，37°C過夜培養，挑 取陽性克隆進行測序；測序結果表明，得到了重組質粒PEGAD-35S: :gma-miR156b。
[0132] 3.小麥成熟胚基因槍遺傳轉化
[0133] 1)成熟胚愈傷組織的誘導：
[0134] 小麥品種科農199種子用70%的酒精消毒5min,然后用0. 1 %的升萊浸泡種子 13min，無菌水沖洗5次；然后將小麥種子置于10mg/L的噻二唑苯基脲（TDZ)溶液中在25°C 室溫條件下處理15h ;剝取成熟胚，接種于成熟胚愈傷組織誘導培養基上誘導愈傷組織；小 麥成熟胚愈傷組織誘導培養基以通用MS培養基（Phyto Technology Laboratories,貨號： G398)為基準，添加如下物質：2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D) :2. 0mg/L，鹽酸硫胺素（VB1): 8. 0mg/L，水解酪蛋白：500mg/L，L-天門冬酰胺：250mg/L，L-谷氨酰胺：200mg/L ;鹿糖： 15g/L，麥芽糖：15g/L，瓊脂：5g/L ;pH = 5. 7 ;小麥成熟胚組織誘導培養6天后陸續產生成 熟胚愈傷組織，挑選誘導兩周質地致密的成熟胚愈傷組織轉移到高滲培養基中，于20°C黑 暗條件培養6h ;高滲培養基配方為上述小麥成熟胚愈傷組織誘導培養基中再附加0. 2mol/ L的甘露醇和0· 2mol/L的山梨醇；
[0135] 2)基因槍轟擊轉化：
[0136] 經高滲處理后的成熟胚愈傷組織用常規的基因槍轉化方法進行轟擊轉化，基因 槍轟擊參數為：金粉直徑1. 〇 μ m，阻擋網與轟擊材料之間的距離為9. 0cm，可裂膜壓力為 llOOPa，每槍金粉 /pEGAD-35S: :gma-miR156b 用量為 0. 5μ g/30y g，每皿材料轟擊 1 次；
[0137] 3)恢復培養：
[0138] 基因槍轟擊后的成熟胚愈傷組織在高滲培養基上繼續暗培養18h后，將愈傷組織 從高滲培養基轉移至恢復培養基中，于26°C暗培養兩周；小麥成熟胚愈傷組織恢復培養基 以通用MS培養基為基準，添加以下物質：2,4_二氯苯氧乙酸（2,4-D) :1.5mg/L，6-呋喃 基氨基嘌呤（KT) :0. 5mg/L，水解酪蛋白：500mg/L，L-天門冬酰胺：250mg/L，L-谷氨酰胺： 200mg/L，鹽酸硫胺素（VB1) :8. 0mg/L，蔗糖：15g/L，麥芽糖：15g/L，瓊脂：5g/L ;pH = 5. 7 ;
[0139] 4)分化培養：
[0140] 恢復及篩選培養后的成熟胚愈傷組織轉至分化培養基上進行分化培養；培養溫 度為25?28°C，分化培養基以通用培養基MS為基準，添加以下物質：6_呋喃基氨基嘌呤 (KT) :2.0mg/L，α-萘乙酸（NAA) :0.01mg/L，酪蛋白：500mg/L，生物素：0.5mg/L，鹽酸硫胺 素（VB1) :8. 0mg/L，蔗糖：15g/L，麥芽糖：15g/L，瓊脂：5g/L ;pH = 5. 7 ;
[0141] 5)生根培養：
[0142] 待成熟胚愈傷組織分化的芽苗長至2?3片葉時轉移到生根培養基上，于25°C、 3000Lux光照條件下進行生根培養；生根培養基以通用培養基MS為基準，且將MS通用培養 的無機鹽濃度降低一半，其中添加 ct 一奈乙酸（NAA)0. 5mg/L，鹿糖：30g/L，瓊脂：5g/L ;pH =5.7 ;待轉基因苗恢復生長后用Bar基因檢測，收獲Bar基因陽性轉基因株系，在ΤΙ、T2 代的陽性植株及Τ3代的純合轉基因株系進行目的基因的表達分析以及表型的鑒定。
[0143] 4.轉基因植株的分子鑒定
[0144] 對Τ1和Τ2代陽性的植株后代采用PCR方法進行了 Bar基因的鑒定。
[0145] PCR檢測反應法：提取小麥基因組DNA用于PCR檢測。檢測Bar基因是否 轉入小麥基因組中。Bar 基因引物：F:CTACATCGAGACAAGCACGGTCAA(SEQ ID NO :8)， R:AGAAACCCACGTCATGCCAGTTC(SEQ ID NO ：9)〇
[0146] 5.結果觀察
[0147] l)Bar基因檢測結果：對T2代陽性的植株進行了 Bar基因鑒定。如（圖4)顯示， 通過PCR方法鑒定出156b-2-3和156b-5-8兩個獨立來源的陽性轉基因小麥株系。
[0148] 2)gma_miR156b在轉基因小麥中的農藝性狀分析：對這些轉基因植株的生長習 性、穗型特點等農藝性狀進行了跟蹤觀察。發現過表達gma-miR156b的轉基因植株同對照 品種科農199相比，穗長顯著增加（圖5A, 5B)。過表達gma-miR156b可以顯著增加轉基因 小麥的分蘗數，由平均的3. 3個分蘗增加到4. 4個分蘗（圖5C);此外，過表達gma-miR156b 轉基因植株的穗粒數也顯著增加（圖;更重要的是，單穗平均粒重也顯著增加（圖5E)， 從而大幅度的提高了小麥的產量。因此，gma-miR156b是決定小麥分蘗和高產的重要的基 因。
[0149] 上述描述僅作為本發明可實施的技術方案提出，不作為對其技術方案本身的單一 限制條件，例如：含有本發明miRNA的前體序列，成熟miRNA序列的表達載體及序列本身，擴 增所需引物，轉基因細胞系及宿主菌等均屬于本發明的保護范圍。
【權利要求】
1. 序列表中SEQ ID NO :1所示microRNA的在培育多分枝和/或多莢和/或多籽粒株 型植物中的應用。
2. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于：在植物中過表達SEQ ID NO :1所示的 microRNA，培育出具有多分枝和/或多莢和/或多籽粒株型的轉基因植物。
3. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于：首先構建含有所述microRNA前體序列的 重組表達載體，然后利用此重組表達載體構建轉化體，再利用此轉化體侵染目的植物，篩選 得到與正常植物相比具有多分枝、多莢、多籽粒的高產轉基因植物；所述microRNA的前體 序列如SEQ ID NO :2所示。
4. 根據權利要求3所述的應用，其特征在于：構建含有SEQ ID NO :2所示多核苷酸序 列的重組表達載體的步驟為： 1) 、首先以植物葉片DNA為模板，擴增獲得SEQ ID NO :2所示多核苷酸序列并連接至T 載體上，然后用限制性內切酶Age I和BamH I酶切所得T載體質粒，回收酶切產物； 2) 、然后用限制性內切酶Age I和BamH I酶切空載體pEGAD，回收載體骨架； 3) 、最后用T4連接酶將步驟1)的酶切產物和步驟2)的載體骨架連接； 4) 、將步驟3)的連接產物熱激轉化大腸桿菌感受態DH5 α菌株，37 °C過夜培養，挑取陽 性克隆進行測序驗證，得重組表達載體pEGAD-35S: : gma-miR156b。
5. 根據權利要求3所述的應用，其特征在于：采用液氮凍溶法轉化農桿菌EHA105得轉 化體，具體操作步驟包括： a. 取出凍存的200 μ 1感受態農桿菌細胞，融化后加入5-10 μ 1重組表達載體的質粒 DNA，輕彈管壁混勻，冰上放20-30min ; b. 放入液氮中5min后取出，將管轉入37°C、5min融化后，加入800 μ 1YEP液體培養基， 28°C 低速振蕩、150rpm，4-5h ; d. 10000rpm，30sec，去上清，加100μ 1YEP液體培養基，懸浮菌體后涂板； e. 置于28°C培養至白色轉化子長出，挑取陽性單克隆搖菌，用于植株子葉節轉化。
6. 根據權利要求1-5任一項所述的應用，其特征在于：所述目的植物為大豆或小麥。
7. 權利要求1所述microRNA的前體序列，其具有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列，在 植物細胞內被剪切并表達得到對應的microRNA。
8. 含有權利要求7所述microRNA前體序列的重組表達載體。
9. 含有權利要求7所述microRNA前體序列的轉化體
10. 擴增權利要求7所述microRNA前體序列的引物對，其核苷酸序列如SEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO :4 所示。
【文檔編號】A01H5/00GK104232682SQ201410478207
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月18日 優先權日:2014年9月18日
【發明者】李霞, 王幼寧, 紀洪濤, 姜瓊, 趙芳, 石磊, 杜琳倩 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所