一種聚合含抗三種病害基因的水稻選育方法
【專利摘要】本發明公開了一種聚合含抗三種病害基因的水稻選育方法。本發明采用分子標記輔助選擇技術、花藥培養與常規育種技術相結合，快速實現抗白葉枯病基因 Xa23 、抗稻瘟病基因 Pi-1 與抗條紋葉枯病基因 Stvb-i 的聚合。結果表明：所獲得的聚合三種抗病基因的花培材料所含的抗病基因，均能穩定遺傳，且高效抗病。本發明的水稻選育方法創造出一批抗性穩定的水稻新種質資源，為水稻抗病育種提供了物質基礎。
【專利說明】一種聚合含抗三種病害基因的水稻選育方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種水稻品系的選育方法及應用。更具體地說是一種聚合含抗三種病 害基因的水稻選育方法及其應用。

【背景技術】
[0002] 水稻是我國第一大糧食作物，也是單產水平最高的糧食作物，常年種植面積不足 糧食作物的30%，產量卻占糧食總產量的40%以上；我國有60%以上人口以稻米為主食，尤 其是以粳米為主食的城鄉居民日益增多。所以發展水稻生產，對解決我國糧食安全供給具 有舉足輕重的作用。
[0003] 在水稻生產中，病害是水稻高產穩產的重要限制因子，其中白葉枯病（由病原黃單 胞菌的變種心/7從Offlmas. orjza pv.引起的一種水稻細菌性病害)、稻癌病（由稻癌病菌 grisea)引起的一種水稻真菌性病害)、條紋葉枯病（由灰飛風介導水稻條紋 葉枯病毒Crice rirys, RSV)引起的一種水稻病毒性病害)廣泛發生在全國各個稻 區，每年均有不同程度的發生，年發生面積約500萬公頃，流行年份一般減產10-20%，重者 高達40-50%，甚至絕收，年損失稻谷約10億公斤，而且其危害面積、危害程度都日趨嚴重。 生產上主要通過兩種途徑防治病害：一是使用化學農藥，二是種植抗病優良品種。前者過多 使用農藥不僅生產成本較高，而且易污染環境、殺傷害蟲天敵、增大稻谷中農藥殘留等許多 問題；而后者不僅可以提高水稻產量，減輕病害造成的損失，還可以減少農藥使用量，減輕 環境污染，實現現代農業健康可持續發展。實踐證明，選育、應用抗病品種是保證水稻穩產、 高產的最為經濟有效的措施之一。
[0004] 當前主栽粳稻品種綜合抗病性較好的有花育409、徐稻3號、吉粳88、鹽豐47、南粳 46等，但這些品種多是單一抗性，不能對多種病害同時表現抗病。絕大多數抗稻瘟病、白葉 枯病水稻品種大面積推廣:T5年以后，因某一致病生理小種的變化，使品種的抗性下降或 喪失。因此，采用基因聚合技術，將不同的抗病基因轉入同一品種中，使同一品種對多種病 害表現抗病，是今后水稻抗病育種的發展方向和必然趨勢。通過開展粳稻多種抗病基因分 子聚合與種質創新研究，對創新多抗水稻種質、提高綜合抗病性、減輕各種病害對水稻生產 的危害、提高水稻產量具有重要意義。
[0005] 選擇是育種工作中的重要環節。常規育種周期長、效率低，耗費大量人力物力，對 目標性狀多采用直接選擇的方法，但許多農藝性狀不容易觀測，易受環境影響，表現不穩 定，直接選擇比較困難。傳統的水稻抗病育種主要依賴于抗性鑒定和植株表型的選擇，要求 豐富的經驗和長達數年甚至十幾年的時間，并且受有無合適的病菌菌株和病菌發病條件的 限制，鑒定結果容易造成誤差，甚至造成抗性基因的丟失，所以選擇效率低、周期長。
[0006] 隨著近年來越來越多的水稻基因被發現、定位和克隆，傳統技術同分子標記輔助 選擇、花藥培養以及轉基因手段等現代生物技術相結合，進行多基因抗病育種，已經成為水 稻種質資源創新的新途徑。不同水稻病害由于抗病育種基礎理論研究的深度和廣度不同， 其進展也不盡相同。目前水稻抗白葉枯病、稻瘟病、條紋葉枯病單一抗性育種都取得較顯著 的成效。
[0007] 將分子標記輔助選擇進行基因聚合應用于水稻抗病育種的實踐中，已取得一些實 質性進展。用一些與一些目標基因共分離或緊密連鎖的分子標記進行了基因聚合研究，將 數個抗性基因聚合到一個品種中，產生了一批很有價值的育種材料。將多個單一病害不同 的抗性基因聚合到同一個水稻品種中被認為是建立持續抗性的重要途徑之一。Satomi等用 與抗性基因連鎖的RFLP和RAH)標記聚合了抗白葉枯病基因ZM+ 仏獲得穩定 純合系，其中具有辦辦辦川的純系出現了在抗譜上由原單個抗性基因所沒有的新的抗性 類型。據鄭康樂等報道，國際水稻研究所已通過MAS方法成功地獲得分別聚合3個抗稻瘟 病基因和3個抗白葉枯病基因的株系。Huang等用RFLP和PCR標記對白葉枯病抗性基因累 加系進行選擇，成功地構建了含名的多基因累加系。巴沙拉特等以攜帶 Za么xaHWHaW四個抗白葉枯病基因的IRBB60與8個水稻新品系，組配8個雜交組合， 應用分子標記輔助選擇技術從F 2和F3群體中共獲得216個攜帶4個抗白葉枯病基因的純 合體。Yoshimura等通過RFLP和RAH)標記將來自不同組合的5個白葉枯病抗性基因Xa7、 和聚合在一起。徐建龍等[76]在3個晚粳品系中聚合了抗白葉枯病基因 ZaJ和聚合后的抗性水平和抗擴展能力強于雙親。Singh等把3個水稻白葉枯病抗性基 因Bi 和ZaW進行分子標記輔助聚合，獲得了含2個或3個白葉枯病抗性基因的品 系，該品系在自然條件下表現出較高的抗譜，并把上述3個基因聚合到PR106秈稻品種中。 Sanchez 等聚合 3 個抗性基因 到 IR655982112、IR6560024 和 IR65600296 中。Hittal-mani等已成功地利用RFLP標記技術將朽7、AU、朽-te三個稻瘟病抗性基 因聚合到秈稻BL124中。陳志偉等將水稻品種地谷、BL-l、Pi-4號中朽-t/似、 基因聚合到保持系秈稻品種R 46B中，其稻瘟病抗性明顯提高。鄧其明等[8°]通過常規回交 育種結合分子標記輔助選擇技術，將來自IRBB24的2個抗白葉枯病基因聚合到 感病的雜交秈稻恢復系綿恢725中，加速育成了新的高度抗性的雜交秈稻恢復系蜀恢207。 王弋等通過回交-自交的育種方法，結合分子標記輔助選擇和組織培養，把稻瘟病抗性基 因導入不具有稻瘟病抗性的華兩優103和華兩優105的父本T1007中，以期提高這2 個組合的稻瘟病抗性。柳武革等以含廣譜稻瘟病抗性基因Z 7Z-7和-J?的BL122為供體，溫 敏核不育系⑶-7S為受體，通過雜交、回交和自交并結合分子標記輔助選擇，將Z^i-7、/Y-J? 基因導入溫敏核不育系GD-7S中，獲得5個攜帶兩個抗性基因的純合改良不育株系。
[0008] 利用多種抗病基因同時改良多個性狀、利用多種方法聚合多種抗性基因成為基因 工程研究方向之一。王興春等利用分子標記輔助選擇與花藥培養相結合快速聚合水稻白葉 枯病抗性辦J?7基因。馮道榮等將多個抗病抗蟲基因在水稻中的遺傳和表達。王愛菊等利 用沒（基因和基因轉化獲得抗螟蟲、白葉枯病的轉基因水稻。姜明松等利用轉抗白葉 枯病Za W基因純合穩定的圣稻301與轉抗螟蟲價基因、轉抗除草劑知r基因的純合穩定 株系GK-I雜交，依據田間抗病蟲性表現，利用標記基因選擇，分子標記輔助選擇，獲得了多 抗轉基因水稻植株。倪大虎等將高抗白葉枯病的心J?7基因和高抗稻瘟病基因轉到 不同秈稻品系中，并且得到了含雙抗基因的純合株系。倪大虎等通過分子標記輔助選擇與 傳統的雜交、自交相結合的方法，將抗稻瘟病的基因和抗白葉枯病的心J?7及ZaM 基因聚合到同一株系中，經多代大田或和溫室接菌鑒定、室內標記選擇和田間農藝性狀的 篩選，獲得了 4個三基因聚合且農藝性狀優良的株系L17-L20。He等應用分子標記技術將 多組水稻抗病基因聚合，提高病害抗性：分別將水稻白葉枯病抗性基因Za7和水稻白 葉枯病抗性基因名泛7和抗蟲性價基因聚合到秈稻明恢63 ;將稻瘟病抗性基因朽-7、/^-J? 聚合到秈稻珍汕97。何光明等通過分子標記輔助選擇結合回交轉育，首次成功在進行了抗 衰老基因77T、抗白葉枯病基因和抗稻瘟病基因的聚合，并向兩系雜交稻親本進 行轉移。通過標記選擇，Narayanan等聚合3個主效基因/?'和到Co39, 2個 主效基因和辦J?7到IR50。楊子賢等將抗白葉枯病基因和抗水稻螟蟲基因沒t 導入93-11，獲得含和基因均為純合的株系，經改良的93-11及其所配的雜交種顯 示出良好的抗蟲、抗病性。
[0009]


【發明內容】
本發明采用分子標記輔助選擇技術、花藥培養與常規育種技術相結合，快速實現抗白 葉枯病基因名以?、抗稻瘟病基因-7與抗條紋葉枯病基因泣M-i的聚合，創造出一批抗性 穩定的水稻新種質資源，為水稻抗病育種提供了物質基礎。
[0010] 為實現上述目的，本發明公開了如下的技術內容： 一種聚合含抗三種病害基因的水稻選育方法，其特征在于按如下的步驟進行： (1) 抗兩種病害基因的聚合：用含有抗白葉枯病基因的BG152和含有抗稻瘟病 /^/-7基因的Rl 18分別與含抗條紋葉枯病泣M-i基因的花育409通過有性雜交進行雙抗病 基因聚合，分別獲得含抗白葉枯病心」?J基因與抗條紋葉枯病泣M-i基因的F tl種子和含抗 稻瘟病朽-7基因與抗條紋葉枯病泣M-i基因的Ftl種子； (2) 抗三種病基因的聚合：利用分子標記分別對含抗白葉枯病辦以基因與抗條紋葉 枯病泣M-i基因的F1植株和含抗稻瘟病朽-7基因與抗條紋葉枯病泣M-i基因的Fl植 株鑒別真假雜種，然后再將兩個帶有雙抗抗病基因的真雜種彼此雜交，獲得含抗白葉枯病 ZaW基因、抗稻瘟病朽-7基因與抗條紋葉枯病泣M-i基因的復交F tl種子； (3) 含抗三種病害基因雜合型聚合體的獲得：按劃格方式稀播復交F1群體，于3葉期對 所有單株逐株取葉提取DNA，再采用與三種抗性基因緊密連鎖的分子標記檢測各個體的抗 性基因，從中篩選出聚合了含抗三種病害基因型的雜合型個體； (4) 含抗三種病害基因雜合型聚合體的花藥培養：從篩選出的聚合了含抗三種病害基 因型的個體中，進一步選擇農藝性狀比較好的個體進行花藥培養，獲得花培一代H tl ; (5) 含抗三種病害基因的純合型聚合體的獲得：花培一代Htl自然加倍，收獲二倍體植株 種子；按劃格方式稀播二倍體植株種子，于3葉期對所有個體取葉提取DNA，再采用與三種 抗性基因緊密連鎖的分子標記檢測各個體的抗性基因，從中篩選出聚合了含抗三種病害基 因的純合型聚合體花培植株，按株系收種； (6) 含抗三種病害基因的純合型聚合體的選育：播種所有含抗三種病害基因的純合 個體，每個播種量為50-100g ;移栽時將其分成四份，一份用于人工接種的白葉枯病接種鑒 定，一份采用在病區種植進行條紋葉枯病鑒定，一份用于人工接種結合病區種植進行稻瘟 病鑒定，一份種在水田考察農藝性狀和測產，最終根據PCR檢測與抗病鑒定結果，篩選出聚 合三種抗病基因、抗三種病害且綜合農藝性狀優異的個體。其中三種病害的指的是：白葉枯 病、稻瘟病、條紋葉枯病。
[0011] 本發明進一步公開了了聚合含抗三種病害基因的水稻選育方法在培育抗多種病 害水稻方面的應用；其中的多種病害指的是：白葉枯病、稻瘟病、條紋葉枯病。
[0012] 本發明的實驗結果如下： 1.用含有抗白葉枯病基因的BG152和含有抗稻瘟病朽-7基因的R118分別與含 抗條紋葉枯病泣基因的花育409進行通過有性雜交進行聚合，獲得單交Ftl種子180 粒、105粒。利用分子標記鑒別真假雜種，然后再將兩個帶有雙抗抗病基因的真雜種彼此雜 交，分別獲得復交F tl種子720粒和678粒聚合。
[0013] 2.含抗三種病害基因的雜合型聚合體的獲得：按劃格方式稀播復交F1群體，于3 葉期對901單株逐株取葉提取DNA，采用與3種抗性基因緊密連鎖的分子標記檢測各個體的 抗性基因，從中篩選出聚合三種抗病基因的單株52株。
[0014] 3.含抗三種病害基因的純合型聚合體的獲得：將52株含三種抗病基因的復交 F1單本移栽于大田，選取田間無病蟲害的農藝性狀好的單株進行花藥培養。共接種20700 枚花藥，出愈傷6543塊，平均出愈率為29. 65% ;轉管4000塊，分化出苗1148叢，分化率為 28. 70%。766株花培苗Htl自然加倍，獲得雙倍體378株，占49. 35%。
[0015] 4.含抗三種病害基因的純合型聚合體的選育：對378份H1植株進行PCR檢測與 抗病鑒定，篩選出聚合三種抗病基因的Hl株系14個，占3. 7%，抗病性鑒定表現為抗（R)。 對14份聚合三種抗病基因的H2植株進行PCR檢測及抗病鑒定。結果表明，所獲得的聚合 三種抗病基因的花培材料所含的抗病基因，均能穩定遺傳，且高效抗病。
[0016] 本發明更加詳細的描述如下： 材料與方法 1實驗材料 1. 1材料 供體親本為攜帶抗白葉枯病基因的粳型材料BG152和抗稻瘟病/^-7基因的秈型 材料Rl 18,由中國農業科學院作物科學研究所提供；受體親本為攜帶抗條紋葉枯病泣M-i 基因的優質粳稻品種花育409,由天津市農作物研究所提供(可以購買）；以及攜帶三個抗病 基因Xa23、Pi-l與Stvb-i的水稻材料。
[0017] 1.2 試劑 提取DNA、PCR反應、電泳等所用試劑為進口或國產分析純產品，其中Taq聚合酶購自華 美公司，dNTPs為Oharmacia公司產品，華美公司分裝。引物由上海生工生物工程技術服務 有限公司合成。
[0018] 2.2實驗方法 2. 2. 1多種抗病基因聚合 用含有抗白葉枯病心」?J基因的中間材料和含有抗稻瘟病Z^i-7基因的中間材料分別與 抗條紋葉枯病、優質粳稻品種進行有性雜交，分子標記鑒別真假雜種后，將兩個帶有抗病基 因的真雜種彼此雜交，獲得足夠多的復交F tl種子，該群體中3種抗病基因均呈現分離和自 由組合。按劃格方式稀播復交F1群體，確定每一個體的具體位置，于3葉期逐株取葉提取 DNA，再采用與3種抗性基因緊密連鎖的分子標記檢測各個體的抗性基因型，從中選擇聚合 了 3種基因型的個體，再從中進一步選擇農藝性狀比較好的個體分別花培。花培一代自然 加倍，收獲二倍體植株種子；花培二代（H 1)采用同樣方法，分子標記檢測各個體3個抗性基 因位點的基因型，選聚合了 3種抗性基因純合的個體分單株收種。理論上花培一代個體加 代后基因型應該是純合穩定，但個體之間可能互不相同。移栽時將H 1分成四份，一份種植 在水池用于白葉枯病接種鑒定，一份采用人工接種結合在病區種植進行條紋葉枯病鑒定， 一份用于人工接種結合病區種植進行稻瘟病鑒定，一份種在水田考察農藝性狀和測產。最 終根據PCR檢測與抗病鑒定結果，篩選出聚合三種抗病基因、抗三種病害且綜合農藝性狀 優異的個體。
[0019] 2. 2. 1.1 有性雜交 采用人工剪穎去雄方法進行有性雜交，每個組合作250-300個穗子，每個穗子留60-80 朵小花，預收1500-2000粒Ftl代種子。
[0020] 2. 2. 1. 2 種植方式 按劃格方式稀播單交F1及復交F1群體，確定每一個體的具體位置，便于個體跟蹤，苗期 經PCR檢測后，單本移栽，株行距為16. 7cmX 20cm。管理同一般大田。
[0021] 2.2.2 PCR 檢測 2. 2. 2. I DNA 提取 在苗期對多種抗病基因的聚合植株及花培植株提取DNA，并用核酸蛋白分析儀ND1000 進行檢測，確定提取DNA的濃度及純度，高純度DNA稀釋后用于PCR檢測。
[0022] 采用簡易SDS法提取基因組DNA。具體步驟如下： 1) 取約300mg新鮮的水稻嫩葉用液氮速凍后研磨成粉末，迅速轉移至I. 5mL離心管 中； 2) 加入650 ii L經65°C預熱的SDS抽提緩沖液，65°C水浴40min，每隔IOmin搖動混勻； 3) 加入等體積的氯仿異戊醇混合液，搖動混勻3min，靜置3min ; 4) IOOOOrpm離心8min，小心轉移上清于另一潔凈的I. 5mL離心管中； 5) 加入0. 8倍體積異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置片刻出現白色絮狀沉淀； 6) 10000 rpm離心5min，棄上清收集沉淀； 7) 加入800 ii L75%的乙醇洗滌沉淀； 8) 12000 rpm離心3min后棄上清； 9) 超凈臺上吹干沉淀后加入200 ii L TE (pH8.0)溶解備用。
[0023] 2. 2. 2. 2 PCR 擴增 反應體系 總體積為20 u L : DNA 10-30ng IOXBufTer (含 20 mM Mg2+) 2u L dNTP (2. 5mM) 0. 2mM primer I 0. 2 u M primer2 0. 2 u M Taq 酶 IU ddH20 補至 20 ii L 引物序列 與抗白葉枯病辦以基因緊密連鎖的RM206序列： -CCCATGCGTTTAACTATTCT-3' -CGTTCCATCGATCCGTATGG-3' 與抗稻瘟病朽-7基因緊密連鎖的MRG4766序列： F : 5' -ATTGCTGCAAAGTGGGAGAC-3' -AAGTGGAGGCAGTTCACCAC-3' 與抗條紋葉枯病泣M-i基因緊密連鎖的RMl 1-8序列： F : 5' -TAGCCATGCTCATGCGTCAT-3， R : 5' -CGCGGTTTGCAGTAGTTGC-3' PCR擴增程序 ①94°C預變性5min ②94°C變性Imin ③55°C退火Imin ④72°C延伸Imin ②一④循環35次 ⑤72°C延伸IOmin。
[0024] 2. 2. 2. 3 電泳 每管擴增產物加2 ii L的溴酚藍(含0. 25%溴酚藍、40%蔗糖水溶液)混勻，點入3%瓊脂 糖凝膠中電泳，EB染色后，取出凝膠，在凝膠成像系統上觀察、照相。
[0025] 2. 2. 3抗病鑒定 每份待鑒定材料同期播種、插秧，插2行區，每行10穴，每穴單株，株行距為 13. 3cmX30cm。田間管理同一般水田。抗病鑒定的方法參照天津市植物保護研究所進行抗 病性鑒定的方法及標準，稻瘟病病菌由天津市植物保護研究所提供。
[0026] 2. 2. 3. 1抗白葉枯病鑒定 接種鑒定材料種植在網室中，在大田嚴格隔離的條件下接種白葉枯病。
[0027] 白葉枯病菌來源 白葉枯病原菌P6、V5生理小種為強致病株，由中國農業科學院作物科學研究所和天津 農學院提供。
[0028] 人工接種鑒定 在分蘗期和孕穗期，通過剪葉法(用剪刀蘸菌液再剪葉尖〇. 5cm處）對充分伸展的葉片 接種白葉枯病強致病菌P6小種和我國的優勢致病型V5菌系，每株接種5張以上葉片。病原 菌接種于 PSA 培養基（馬鈴薯 300g/L，Ca (NO3) 2*4H20 0.5 g/L，Na2HPO4 *12H20 2.0 g/L， 蔗糖15 g/L，瓊脂粉15 g/L)上置28°C條件下培養72h，調節濃度至IO9細胞/mL，接種15d (分蘗期）?2〇d (孕穗期）左右當病斑長度明顯而穩定時進行調查，每一植株測量三片葉，求 其平均值分別評價目標株系的苗期和成株期抗性表現。
[0029] 白葉枯病分級標準苗期分級標準 〇級：無可見斑(免疫）； 1級：病斑局限于圍繞接種點的l-2mm ; 2級：病斑近橢圓，不超過2-3cm長； 3級：病斑伸長，擴展至葉片大約1/2或稍短； 4級：病斑向長和寬擴展，毀壞葉片的3/4 ; 5級：病斑擴展和破壞全葉； 6級：病斑擴展和破壞全葉片以及葉鞘的1/2以內； 7級：葉片和葉鞘被破壞有淡黃色癥狀； 8級：葉片和葉鞘破壞，植株淡黃色，近25%幼苗被殺死； 9級：大約50%或更多的幼苗全部被殺死。
[0030] 孕穗期分級標準 0級：無可見斑(免疫）； 1級：病斑局限于圍繞接種點的l-2mm ; 2級：病斑近橢圓，不超過2-3cm長； 3級：病斑伸長，不及葉片的1/2 ; 4級：病斑闊廣，葉子上半部死亡，擴展葉表面下半部的1/4 ; 5級：病斑連接，葉子上半部死亡，擴展葉表面下半部的1/4 ; 6級：病斑擴展至葉片下半部的大約3/4 ; 7級：病斑擴展至基部并破壞全葉片； 8級：病斑破壞了全葉片擴展到葉鞘的1/2處； 9級：病斑完全毀壞葉片和葉鞘。
[0031] 白葉枯病抗性評價標準 0級：〇免疫（頂）； 1級：0. 1-1.0高抗（HR); 3 級：1. 1-3.0 抗（R) ; 5 級：3. 1-5. 0 中抗（MR); 7 級：5. 0 -7. 1 感（S) ; 9 級：7. 1-9. 0 高感（HS) 2. 2. 3. 2抗稻瘟病鑒定 病菌來源：采用2003?2005年天津市優勢穩定小種混合菌株。
[0032] 人工接種鑒定 苗瘟鑒定接種：苗齡在3葉1心期接種天津市4個生理小種和江蘇省5個生理小種， 用超低噴霧器接種于葉面，接種量為每平方米40ml孢子，接種后覆蓋塑料布保溫、保濕48h 后，去掉塑料布，每天隔3h噴1次水，噴水3d。
[0033] 穗頸瘟鑒定接種： 用手持噴霧器噴霧接種，水稻抽穗始期為第一次接種，每隔2d接種1次，共接4次，選 擇傍晚或陰天接種，接種量為150_200ml/m2孢子液，接種后搭架覆蓋塑料布加蓋遮陽網保 濕60h，在保濕48h以后中午放風噴水，晚上覆蓋塑料布，每隔噴水5-6次，噴水7d，促使發 病。
[0034] 調查時間與方法 苗瘟接種后7-10d調查病情，穗頸瘟在水稻乳熟期調查。按全國統一分級標準調查記 載，計算病情指數，根據病情指數評價抗性類型。為保證穗瘟鑒定結果，同時將材料種在病 區進行評價。
[0035] 苗、葉瘟分級標準 〇級：無病斑；（HR) 1級：僅有針尖大小的褐點；（R) 2級：有較大褐點；（R) 3級：圓形至橢圓形灰色病斑，邊緣褐色，病斑直徑約l_2mm ; (R) 4級：橢圓形或狹長紡錘形病斑，局限于兩條葉脈之間，病斑面積不超過葉面積的2% ; (MR) 5級：典型稻瘟病斑，受害面積為3-10% ; (MS) 6級：典型稻瘟病斑，受害葉面積為11%_25% ; (MS) 7級：典型稻瘟病斑，受害葉面積為26%-50% ; (S) 8級：典型稻瘟病斑，受害葉面積為51%-75% ; (HS) 9級：全部葉片枯死。（HS) 穗頸瘟發病率分級標準 〇級：無病；（HR) 1級：病穗率低于5%; (R) 3 級：病糖率 5. 1-10% ; (MR) 5 級：病穗率 10. 1-25% ; (MS) 7 級：病穗率 25. 1-50%; (S) 9 級：病穗率 50. 1-100%。（HS) 穗頸瘟損失率分級標準 〇級：無病； 1級：每穗損失5%左右(個別小枝梗發病）； 2級：每穗損失20%左右（1/3左右枝梗發病）； 3級：每穗損失50%左右(穗頸或主軸發病，谷粒半癟）； 4級：每穗損失70%左右(穗頸發病，大部癟谷）； 5級：每糖損失100%左右(糖頸發病，造成白糖)。
[0036] 穗頸瘟損失率抗性評價分級標準 〇級：無病；（HR) 1級：損失率低于5% ; (R) 3級：損失率低于5. 1-15% ; (MR) 5級：損失率低于15. 1-30% ; (MS) 7級：損失率低于30. 1-50% (S) 9級：損失率低于50%以上。（HS)

【權利要求】
1. 一種聚合含抗三種病害基因的水稻選育方法，其特征在于按如下的步驟進行： (1) 抗兩種病害基因的聚合：用含有抗白葉枯病基因的BG152和含有抗稻瘟病 /^/-7基因的R118分別與含抗條紋葉枯病泣M-i基因的花育409通過有性雜交進行雙抗病 基因聚合，分別獲得含抗白葉枯病心」?J基因與抗條紋葉枯病泣M-i基因的匕種子和含抗 稻瘟病朽-7基因與抗條紋葉枯病泣M-i基因的匕種子； (2) 抗三種病基因的聚合：利用分子標記分別對含抗白葉枯病辦以基因與抗條紋葉 枯病泣M-i基因的Fi植株和含抗稻瘟病朽-7基因與抗條紋葉枯病泣M-i基因的F1植 株鑒別真假雜種，然后再將兩個帶有雙抗抗病基因的真雜種彼此雜交，獲得含抗白葉枯病 基因、抗稻瘟病朽-7基因與抗條紋葉枯病泣M-i基因的復交匕種子； (3) 含抗三種病害基因雜合型聚合體的獲得：按劃格方式稀播復交匕群體，于3葉期對 所有單株逐株取葉提取DNA，再采用與三種抗性基因緊密連鎖的分子標記檢測各個體的抗 性基因，從中篩選出聚合了含抗三種病害基因型的雜合型個體； (4) 含抗三種病害基因雜合型聚合體的花藥培養：從篩選出的聚合了含抗三種病害基 因型的個體中，進一步選擇農藝性狀比較好的個體進行花藥培養，獲得花培一代 H(l ; (5) 含抗三種病害基因的純合型聚合體的獲得：花培一代％自然加倍，收獲二倍體植株 種子；按劃格方式稀播二倍體植株種子，于3葉期對所有個體取葉提取DNA，再采用與三種 抗性基因緊密連鎖的分子標記檢測各個體的抗性基因，從中篩選出聚合了含抗三種病害基 因的純合型聚合體花培植株，按株系收種； (6) 含抗三種病害基因的純合型聚合體的選育：播種所有含抗三種病害基因的純合 個體，每個播種量為50-100g ;移栽時將其分成四份，一份用于人工接種的白葉枯病接種鑒 定，一份采用在病區種植進行條紋葉枯病鑒定，一份用于人工接種結合病區種植進行稻瘟 病鑒定，一份種在水田考察農藝性狀和測產，最終根據PCR檢測與抗病鑒定結果，篩選出聚 合三種抗病基因、抗三種病害且綜合農藝性狀優異的個體。
2. 權利要求1所述的水稻選育方法，其中三種病害的指的是：白葉枯病、稻瘟病、條紋 葉枯病。
3. 采用權利要求書1所述的聚合含抗三種病害基因的水稻選育方法在培育抗多種病 害水稻方面的應用；其中的多種病害指的是：白葉枯病、稻瘟病、條紋葉枯病。
【文檔編號】A01H1/04GK104255443SQ201410562006
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年10月22日 優先權日:2014年10月22日
【發明者】孫海波, 鄒美智, 任洪巖, 王景余, 李艷萍, 馮瑞光 申請人:天津市農作物研究所