本發明屬于植物生物技術領域，具體涉及一種利用葉柄為外植體誘導烏桕植株再生的方法。

背景技術：
隨著全球經濟和社會的發展，對能源的需求日益增長，而化石燃料的儲存量有限，可再生能源的發展受到越來越多的關注。烏桕(SapiumsebiferiumRoxb)是我國的四大木本油料之一，屬于大戟科烏桕屬多功能樹種。其適應性強，不僅耐干早、瘠薄和耐短期積水，且是抗鹽性強的喬木樹種之一；它的籽實含油率高，最高可達55％，是具有很好應用前景的生物能源樹種；除了用于制取生物柴油外，烏桕種子還可提制“皮油”和“清油”，前者供制高級香皂、蠟紙、蠟燭等，后者供油漆、油墨等用，具有極高的經濟價值；此外，烏桕還是集觀果、觀葉、觀型與一身的優良的園林景觀樹種，具有重要的觀賞價值，在我國已有1400年的栽培歷史。優良品種的培育對于提高烏桕產量、改善油脂品質具有重要意義。采用傳統的育種方式對烏桕進行品種改良，不僅育種過程繁瑣而且育種周期長；以基因工程、組織培養等生物技術對烏桕進行品種改良可大大縮短育種周期，提高育種效率。而利用基因工程手段對植物進行品種改良，需建立在高效、穩定的植株組培再生體系的基礎上。目前有關烏桕組培再生的研究已有報道，主要集中在利用種子實生苗和幼胚為外植體對烏桕植株進行快繁，這種再生體系的建立對于多年生烏桕優良種質的保存和擴繁意義不大。另外，有關利用帶腋芽的莖段對烏桕優良株系進行快繁的研究，普遍存在污染率高、褐化嚴重、再生效率低等問題。專利(烏桕組培不定芽高頻率植株再生的方法，公開號101057556，公開日2007-10-24)公開了以下技術方案:取烏桕種子去除種皮,雙氧水表面消毒后接種到種子發芽培養基中,長出完整的烏桕種子苗植株；將烏桕種子苗的縱向一分為二的子葉塊、含未展開真葉的頂芽以及下胚軸和根切段,分別接種在適合頂芽、下胚軸和根等不定芽誘導培養基上,通過直接誘導不定芽或經過愈傷組織誘導獲得嫩綠色不定芽叢；然后移入不定芽伸長培養基,獲得伸長不定芽幼苗；再轉入幼苗擴繁培養基進行擴大繁殖,將經擴繁的幼苗轉接于生根培養基上,長成真葉展開且根系發達的健壯烏桕試管植株,最后移栽到室外在自然條件生長成活,得到烏桕的健壯苗,此種方法直接誘導叢生芽，以種子實生苗為材料來源很難保持母本植株優良性狀，誘導率為70-90％。專利(一種通過幼胚胚狀體發生途徑誘導烏桕植株再生的方法，公開號103004594A，公開日2013-04-03)公開了以下技術方案：首先取烏桕未成熟種子，剝去果殼后，在無菌操作臺內進行表面消毒；然后剪開種殼取出未成熟合子胚，用鑷子進行部分損傷后，接種于胚狀體誘導培養基中，經過2個月左右黑暗培養，獲得2種經不同發育途徑產生的胚狀體；將兩種胚狀體接種在相應的誘導培養基中進行繼代和增殖培養；然后轉至成苗培養基上誘導成苗；培養20-30d左右，待幼苗長成2-4片葉子時，進行煉苗移栽，獲得健壯的烏桕再生苗，此種方法直接形成胚狀體，幼胚為雜合體，作為材料來源很難保持母本植株優良性狀，不利于后期的快繁研究，誘導率為90％。專利(一種烏桕葉盤高效再生的方法，公開號104012416A，公開日2014-09-03)用優良烏桕株系離體無菌苗葉片為外植體，通過直接誘導叢生芽發生來獲得烏桕再生植株，在此基礎上一方面可以對烏桕優良株系進行快繁，另一方面也可利用分子生物學手段對相對優良的烏桕株系進行遺傳改良；但由于葉片較薄，較嫩，在進行基因工程操作(農桿菌浸染或基因槍轟擊)過程中容易受到機械損傷，影響轉化效果。葉柄相對于葉片而言耐受機械損傷能力較強，適于進行遺傳轉化研究，而目前尚無有關以烏桕葉柄為外植體建立烏桕再生體系的研究，上述報道和建立的烏桕再生體系并不適于葉柄的組培再生。本發明公開一種以野外優良單株為材料來源的葉柄直接和間接再生體系，為烏桕優良株系的快繁和遺傳改良奠定基礎。

技術實現要素：
本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，運用植物組織培養技術，提供一種利用葉柄為外植體誘導烏桕植株再生的方法。該方法利用野外烏桕優良株系組培苗的葉柄為外植體，通過直接誘導不定芽和間接誘導愈傷組織兩條途徑建立烏桕高效再生體系，不僅為后期的烏桕優良株系的快繁提供了新的技術途徑，而且為通過基因工程的方法對烏桕進行遺傳改良提供了支撐。為了實現上述目的，本發明的技術方案如下：一種利用葉柄為外植體誘導烏桕植株再生的方法，包括以下步驟：(1)對野外烏桕優良株系的帶腋芽的莖段進行消毒、培養，獲得烏桕無菌苗；(2)切取步驟(1)中所獲得的無菌苗的葉柄作為外植體，并接種于誘導培養基中誘導不定芽或愈傷組織；其中，無菌苗的葉柄在接種于誘導培養基前切成0.3～0.6cm大小的切段；愈傷組織的誘導培養基為：MS+0.2～2.0mg/LNAA+0.2～1.0mg/L6-BA+0.01～0.1mg/LIAA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L瓊脂，pH＝5.8；(3)將步驟(2)中產生不定芽或產生愈傷組織的外植體，轉接于增殖培養基中分別進行不定芽和愈傷組織的增殖培養；其中，不定芽的增殖培養基為：MS+0.2～2.0mg/L6-BA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L瓊脂，pH＝5.8；愈傷組織的增殖培養基為：MS+1.0～3.0mg/LNAA+0.2～1.0mg/L6-BA+0.01～0.2mg/LIAA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L瓊脂，pH＝5.8；(4)將步驟(3)中增殖后的愈傷組織轉入分化培養基中進行愈傷組織分化；其中，愈傷組織的分化培養基為：MS+0.5～2.0mg/L6-BA+0.01～0.2mg/LIBA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L瓊脂，pH＝5.8；(5)將步驟(3)中增殖后的不定芽叢或步驟(4)中分化成不定芽點的愈傷組織轉接于不定芽的伸長培養基中，進行不定芽的伸長；其中，不定芽的伸長培養基為：MS+0.2～1.0mg/L6-BA+0.0～0.1mg/LIAA+0.01～0.1mg/LGA3+3.0g/L蔗糖+0.7g/L瓊脂，pH＝5.8；(6)待不定芽伸長后將其轉到生根培養基中進行生根培養；2～3周后，待苗長至3～4cm,并伴有2～4個真葉時進行馴化、移栽，獲得健壯的烏桕再生植株；其中，所述步驟(2)中的不定芽的誘導培養基為：MS+2.0～4.0mg/L6-BA+0.01～0.2mg/LIAA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L瓊脂，pH＝5.8；在烏桕葉柄再生的整個過程中除了葉柄誘導愈傷組織的培養條件為23±2℃、黑暗培養，其它再生過程的培養條件均為23±2℃、光照培養，光照強度2000～2200lx,光照時間為12～16h。優選地，所述步驟(4)中的愈傷組織轉入分化培養基前切成(0.3～0.5)×(0.3～0.5)cm2大小的切塊。與現有技術相比，本發明存在以下有益效果：本發明具有以下突出優點：其一，葉柄取材于野外烏桕優良株系再生的無菌苗，一方面能保持母本植株的種質特性；另一方面可以避免野外直接取材污染率高的問題，取材方便、無污染，可以實現對野外烏桕優良單株的快繁；其二，再生過程簡單、高效，通過簡單的激素配比調節，可以同時建立兩條不同的烏桕再生途徑；其三，本發明中所用的葉柄外植體較本發明人前期建立的葉片再生體系中所采用的葉片外植體健壯，有較強的耐受基因工程操作過程中機械損傷的能力，適于農桿菌或基因槍介導的遺傳改良。因此，本發明所提供的一種利用葉柄為外植體誘導烏桕植株再生的方法，不僅為后期的烏桕優良株系的快繁提供了新的技術途徑，而且為以后通過基因工程的方法對烏桕進行品種改良提供了技術支持。附圖說明附圖1為誘導前的烏桕葉柄切段。附圖2為葉柄叢生芽的誘導。附圖3為葉柄叢生芽的增殖。附圖4為葉柄愈傷組織的誘導。附圖5為葉柄愈傷組織的增殖。附圖6為葉柄愈傷組織的分化。附圖7為兩種不同再生途徑所獲得的不定芽的伸長。附圖8為烏桕無菌苗的生根。附圖9為烏桕再生植株的移栽。具體實施方式下面結合實施例對本發明做進一步詳細說明。實施例1一種利用葉柄為外植體誘導烏桕植株再生的方法，具體操作如下：1、對野外烏桕優良株系的帶腋芽的莖段進行消毒、培養，獲得烏桕無菌苗；2、切取第1步驟所獲得的無菌苗的葉柄作為外植體，將葉柄切成0.5cm左右的切段,接種于不定芽誘導培養基中，于溫度為25℃，光照強度為2000lx,光照周期為12/12h的條件下進行不定芽的誘導(圖1)，其中所述的不定芽誘導培養基為MS+2.0mg/L6-BA+0.1mg/LIAA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L瓊脂，pH＝5.8；3、光照培養2～3周后，葉柄兩端誘導出不定芽(圖2)，然后將產生不定芽的葉柄橫切一分為二，轉接于增殖培養中進行不定芽的增殖培養，其中所述的不定芽增殖培養基為：MS+0.75mg/L6-BA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L瓊脂，pH＝5.8；4、3周后，將步驟3中增殖的不定芽叢(平均每個不定芽叢上有36.7個不定芽)(圖3)轉接于不定芽伸長培養基中，進行不定芽的伸長，其中所述的不定芽的伸長培養基為：MS+0.5mg/L6-BA+0.02mg/LGA3+3.0g/L蔗糖+0.7g/L瓊脂，pH＝5.8；5、待叢生芽伸長到2～3cm(圖7)，進行生根培養，待苗長至3～4cm,并伴有2～4個真葉(圖8)時，移至土中進行馴化、移栽，獲得健壯的烏桕再生植株(圖9)。實施例2：一種利用葉柄為外植體誘導烏桕植株再生的方法，具體操作如下：1、對野外烏桕優良株系的帶腋芽的莖段進行消毒、培養，獲得烏桕無菌苗；2、切取第1步驟所獲得的無菌苗的葉柄作為外植體，將葉柄切成0.5cm左右的切段,接種于愈傷組織誘導培養基中，于溫度為25℃，黑暗條件下誘導愈傷組織(圖1)，其中所述的愈傷組織誘導培養基為MS+1.0mg/LNAA+0.4mg/L6-BA+0.05mg/LIAA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L瓊脂，pH＝5.8；3、黑暗培養2～3周后，將產生愈傷組織的外植體(圖4)轉接于增殖培養中，于溫度為25℃，光照強度為2000lx,光照周期為12/12h的條件下進行愈傷組織增殖培養，其中所述的愈傷組織增殖培養基為：MS+2.0mg/LNAA+1.0mg/L6-BA+0.01mg/LIAA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L瓊脂，pH＝5.8；4、培光照養2周后，將增殖后的愈傷組織(圖5)切成0.3×0.5cm2大小，轉接于分化培養基上，于溫度為25℃，光照強度為2000lx,光照周期為12/12h的條件下進行愈傷組織分化研究，所述的愈傷組織分化培養基為MS+1.0mg/L6-BA+0.05mg/LIBA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L瓊脂，pH＝5.8；5、培養3～4周后將步驟4中的愈傷組織分化所獲得的不定芽叢(圖6)，轉接于不定芽伸長培養基中，于溫度為25℃，光照強度為2000lx,光照周期為12/12h的條件下，進行不定芽的伸長，其中所述的不定芽的伸長培養基為：MS+0.5mg/L6-BA+0.02mg/LGA3+0.01mg/LIAA+3.0g/L蔗糖+0.7g/L瓊脂，pH＝5.8；6、待叢生芽伸長到2～3cm(圖7)，進行生根培養，待苗長至3～4cm,并伴有2～4個真葉(圖8)時，移至土中進行馴化、移栽，獲得健壯的烏桕再生植株(圖9)。對比試驗表1中列出了已報道的以烏桕不同材料為外植體對烏桕株系進行再生的研究與本發明所述的方法效果對比。可以看出，本發明具有無污染、無褐化、再生率高、能保持母本株系優良性狀和有利于后期基因工程操作研究等優點，具有明顯的有益效果。表1：相關研究與本發明效果對比文獻1：韓珊，石大興等.紅葉烏桕莖段離體培養的研究[J].四川農業大學學報，2006年9月第24卷第3期。文獻2：郄亞微，徐有明等.能源林樹種烏桕莖段離體培養與快速繁殖[J].東北林業大學學報，2009年12月第37卷第12期。文獻3：陳建勇，李寶銀等.烏桕莖段誘導組培快繁技術研究[J].福建林業科技，2009年6月第36卷第2期。文獻4：蔣祥娥，歐陽紹湘等。烏桕的組織培養及植株再生研究[J].湖北林業科技，2010.1,20-22。文獻5：蔣澤平，倪競德等.烏桕優選單株的離體快速繁殖技術研究[J].江蘇林業科，技2011年10月第38卷第5期。文獻6：陳佳，陳凌艷等.烏桕離體快繁再生技術研究[J].西南林業大學學報，2013年第33卷第6期。文獻7：畢君，張往祥等.紅葉烏桕組織培養技術研究[J].中國農學通報，2013,29(28)：60-65。文獻8：李建科等.野生烏桕的組培和再生[J].北方園藝，2010(13):164-166.文獻9：陳穎等.烏桕不同外植體高效再生探索[J].西北植物學報，2010,30(12)：2542-2549。文獻10：田良濤.烏桕胚乳三倍體植株再生與轉基因研究[M].湖北大學碩士學位論文,2011。專利1：李霞，何小蘭.烏桕組培不定芽高頻率植株再生的方法。專利號：CN100581352C。專利2：吳麗芳，侯金艷等.一種通過幼胚胚狀體發生途徑誘導烏桕植株再生的方法。專利號：CN103004594A。專利3：吳麗芳，侯金艷等.一種烏桕葉盤高效再生的方法。公開號：CN104012416A。以上所述的僅為本發明較佳的實例，并不用以限制本發明。本領域技術人員可以根據本發明所述的內容進行顯而易見的等同變換，如不脫離本發明實質的基礎上，對個步驟中的培養基成分在一定范圍內作出一些調整，仍然沒有超出本發明的范圍。