堇葉紫金牛快速工廠化生產(chǎn)方法
【專利說明】
一、技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及堇葉紫金?？焖俟S化生產(chǎn)方法
[0002]二、研究背景
[0003]堇葉紫金牛(Ardisia V1lacea)，又名裹堇紫金牛，屬紫金?？谱辖鹋?，是一種特產(chǎn)于浙江和臺(tái)灣的珍稀瀕危植物。堇葉紫金牛莖皮灰褐色，被微柔毛，葉片略呈蓮座狀，葉片基部鈍圓或微心形，上面微帶紅色，下面帶淡紫色，邊緣呈不規(guī)則波狀淺圓齒，傘形花序單生于葉腋或莖的上部，花冠白色，花期6-7月，植株姿態(tài)幽雅，紅果艷麗經(jīng)久，圓滑晶瑩，清秀、典雅，紅果配紫葉，令人賞心悅目，并且具有較強(qiáng)的耐蔭性和耐旱性，可作為庭院地被、林下地被和觀葉觀果小盆栽類產(chǎn)品，具有極高的市場(chǎng)開發(fā)價(jià)值。由于堇葉紫金牛為野生資源，且資源量極為有限，常規(guī)的繁育方式，無法在最大化保護(hù)野生資源的基礎(chǔ)上進(jìn)行工廠化生產(chǎn)，而組培快繁技術(shù)體系的建立則能夠以較少的野生資源為材料，短時(shí)間內(nèi)來進(jìn)行大規(guī)模的工廠化生產(chǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)該瀕危植物的資源保護(hù)和種苗繁育，并推動(dòng)該物種市場(chǎng)化的進(jìn)程。
三、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供一種堇葉紫金牛的快速工廠化生產(chǎn)方法，提高了生產(chǎn)效率和成活率，降低了生產(chǎn)成本，并且獲得的再生苗能夠穩(wěn)定的延續(xù)野生資源的優(yōu)良性狀。
[0005]為此，本發(fā)明采取如下的技術(shù)方案:
[0006]I)將無病蟲害的堇葉紫金牛性狀優(yōu)良的單株于3月份開始恢復(fù)生長(zhǎng)時(shí)，將其放到溫室內(nèi)養(yǎng)護(hù)，每隔一周葉面噴灑一次0.3%-0.5%的多菌靈溶液，直至5月份左右。待新芽抽出后，剪取其中半木質(zhì)化的嫩莖，將葉片沿葉柄基部切去，嫩莖切成小段，先用0.5%的新潔爾滅+洗潔精混合溶液攪拌消毒處理lh，倒掉消毒液，在流水下沖洗lh，備用。超凈工作臺(tái)中，處理過備用的小段用無菌水沖洗一下，倒掉無菌水，用70%-75%的酒精溶液消毒60-90s，倒掉酒精后，再用0.1%的升汞溶液消毒5-10min，倒掉消毒液，最后用無菌水反復(fù)沖洗
4-5次，備用。無菌水沖洗和消毒處理的過程中，都要不間斷地?fù)u動(dòng)，以保證無菌水和消毒液能夠完全與外植體接觸，提高消毒效率;將以上消毒處理過的莖段切成2cm左右的小段(每段上有I個(gè)休眠的腋芽)，用無菌刀片先把莖段最下端切口褐化的部分切去，迅速將腋芽莖段的芽向上接種到啟動(dòng)培養(yǎng)基上。培養(yǎng)條件為:溫度25±2°C，光照時(shí)間為10h/d，光照強(qiáng)度為 1500-2000Lx，濕度為60%-65%。啟動(dòng)培養(yǎng)基為:MS+0.15-0.30mg/L氯吡苯脲(CPPU) +
0.10-0.20mg/L 萘乙酸(NAA)+3% 蔗糖+0.7%瓊脂，pH 為 5.8-6.0；
[0007]2)啟動(dòng)培養(yǎng)20d以后，休眠的腋芽萌發(fā)，將新萌發(fā)的嫩芽切下來，接種到不定芽分化(增殖)培養(yǎng)基上。不定芽分化培養(yǎng)基為:MS+0.50-0.80mg/L氯吡苯脲(CPPU)+0.10-0.20mg/L 萘乙酸(NAA)+3% 蔗糖+0.7%瓊脂，pH為 5.8-6.0;
[0008]3)增殖培養(yǎng)40d以后，腋芽分化產(chǎn)生大量不定芽，不定芽以芽叢的形式存在。將得到的不定芽叢，輕輕撥散成單個(gè)不定芽，將單個(gè)不定芽接種到壯苗生根培養(yǎng)基上。壯苗生根培養(yǎng)條件為:溫度25±2°C，光照時(shí)間為8h/d，光照強(qiáng)度為100Lx，濕度為60%-65%。所述的壯苗生根培養(yǎng)基為:MS+0.10-0.15mg/L氯吡苯脲(CPPU)+0.5-0.8mg/L吲哚丁酸(IBA) +
0.5g/L 活性炭+2 % 蔗糖+0.6 % 瓊脂，pH 為 5.8-6.0；
[0009]4)壯苗生根培養(yǎng)20d以后，不定芽逐漸分化為健壯的再生小苗，同時(shí)基部產(chǎn)生少量愈傷組織，愈傷組織上部分化出少量不定根。培養(yǎng)40-50d以后，再生小苗的平均株高為4.68cm，平均單株小苗的根系條數(shù)為4.28。將生根的組培瓶苗轉(zhuǎn)移到煉苗坑道中的苗床上，自然環(huán)境下煉苗10d。移栽前3-4d，將組培瓶的瓶蓋松動(dòng)，但不要完全打開，移栽前l(fā)-2d，將組培瓶的瓶蓋完全打開，并往組培瓶?jī)?nèi)灌入少量的無菌水，生根組培苗移栽前，先用鑷子將生根苗輕輕地從培養(yǎng)基內(nèi)夾出來，將根部所帶的培養(yǎng)基用清水完全清洗干凈，將清洗好的生根苗以3-4株為一叢種入煉苗基質(zhì)(松鱗，移栽前I周左右，用0.8%高錳酸鉀溶液消毒處理)中。最后，用0.3%多菌靈溶液對(duì)移栽的生根苗和基質(zhì)表面進(jìn)行均勻噴施，以松鱗完全浸濕為宜，然后用塑料薄膜做成封閉的小拱棚，進(jìn)行保溫保濕40d左右。待生根小苗長(zhǎng)出新的須狀根并恢復(fù)健壯生長(zhǎng)后，將小拱棚的兩端打開，緩慢放風(fēng)，約I周后，將小拱棚完全打開，使其在自然條件下生長(zhǎng)。
[0010]本發(fā)明與傳統(tǒng)的繁育技術(shù)和常規(guī)的組培技術(shù)相比，能夠?qū)⒔M培快繁過程中的壯苗培養(yǎng)和瓶?jī)?nèi)生根培養(yǎng)兩個(gè)階段合二為一，使再生苗在增壯的同時(shí)進(jìn)行瓶?jī)?nèi)生根，縮短組培苗生產(chǎn)周期的同時(shí)減少了組培苗繼代的次數(shù)，大大節(jié)約了生產(chǎn)成本。其中不定芽增殖系數(shù)高達(dá)12.8，瓶?jī)?nèi)生根率高達(dá)96.7%,煉苗移栽成活率可達(dá)到95 %以上，整個(gè)快繁周期縮短到只有4.5個(gè)月，大大提高了生產(chǎn)效率，并且獲得的再生苗能夠穩(wěn)定的延續(xù)野生資源的優(yōu)良性狀。
四、【具體實(shí)施方式】
[0011]實(shí)施案例I
[0012]2014年5月12日，溫室內(nèi)選取生長(zhǎng)旺盛，無病蟲害，性狀表現(xiàn)優(yōu)良的堇葉紫金牛野生單株，剪取當(dāng)年新發(fā)幼嫩枝條，用剪刀將葉片沿葉柄基部切去，嫩莖切成小段，用清水反復(fù)沖洗3-4次，先用0.5 %的新潔爾滅+洗潔精混合溶液攪拌消毒處理30min，倒掉消毒液，在流水下沖洗lh，備用。超凈工作臺(tái)中，處理過備用的小段用無菌水沖洗一下，倒掉無菌水，用70 % -75 %的酒精溶液消毒30s，倒掉酒精后，再用0.1 %的升汞溶液消毒5min，倒掉消毒液，最后用無菌水反復(fù)沖洗4-5次，備用。無菌水沖洗和消毒處理的過程中，都要不間斷地?fù)u動(dòng)，以保證無菌水和消毒液能夠完全與外植體接觸，提高消毒效率；
[0013]將以上消毒處理過的莖段切成2cm左右的小段(每段上有I個(gè)休眠的腋芽)，用無菌刀片先把莖段最下端切口褐化的部分切去，迅速將腋芽莖段的芽向上接種到啟動(dòng)培養(yǎng)基上。培養(yǎng)條件為:溫度25±2°C，光照時(shí)間為10h/d，光照強(qiáng)度為1500-2000LX，濕度為60%-65%。啟動(dòng)培養(yǎng)基為:MS+0.20mg/L氯吡苯脲(CPPU)+0.10mg/L萘乙酸(NAA) +3%蔗糖+0.7%瓊脂，PH為5.8-6.0;啟動(dòng)培養(yǎng)28d以后，休眠的腋芽萌發(fā)，將新萌發(fā)的嫩芽切下來，接種到不定芽分化(增殖)培養(yǎng)基上。不定芽分化培養(yǎng)基為:MS+0.50mg/L氯吡苯脲(CPPU)+0.10mg/L萘乙酸(NAA)+3 %蔗糖+0.7 %瓊脂，pH為5.8-6.0；增殖培養(yǎng)45d以后，腋芽分化產(chǎn)生大量不定芽，不定芽以芽叢的形式存在。將得到的不定芽叢，輕輕撥散成單個(gè)不定芽，將單個(gè)不定芽接種到壯苗生根培養(yǎng)基上。壯苗生根培養(yǎng)條件為:溫度25±2°C，光照時(shí)間為8h/d，光照強(qiáng)度為lOOOLx，濕度為60%-65%。所述的壯苗生根培養(yǎng)基為:MS+0.10mg/L氯吡苯脲(CPPU) +
0.5mg//L吲哚丁酸(IBA)+0.5g/L活性炭+2%蔗糖+0.6%瓊脂，pH為5.8-6.0；壯苗生根培養(yǎng)45d以后，將生根的組培瓶苗轉(zhuǎn)移到煉苗坑道中的苗床上，按照上述
【發(fā)明內(nèi)容】
步驟4)相關(guān)的技術(shù)操作進(jìn)行煉苗移栽。
[0014]本實(shí)施案例獲得的外植體消毒處理污染率為8%，不定芽增殖系數(shù)達(dá)到11.9，瓶?jī)?nèi)生根率達(dá)到95.8%，整個(gè)快繁周期(從增殖培養(yǎng)開始到煉苗移栽結(jié)束)為140d。
[0015]實(shí)施案例2
[0016]2014年5月28日，溫室內(nèi)選取生長(zhǎng)旺盛，無病蟲害，性狀表現(xiàn)優(yōu)良的堇葉紫金牛野生單株，剪取當(dāng)年新發(fā)幼嫩枝條，用剪刀將葉片沿葉柄基部切去，嫩莖切成小段，用清水反復(fù)沖洗3-4次，先用0.5%的新潔爾滅+洗潔精混合溶液攪拌消毒處理lh，倒掉消毒液，在流水下沖洗lh，備用。超凈工作臺(tái)中，處理過備用的小段用無菌水沖洗一下，倒掉無菌水，用70 % -75 %的酒精溶液消毒60s，倒掉酒精后，再用0.1 %的升汞溶液消毒Smin，倒掉消毒液，最后用無菌水反復(fù)沖洗4-5次，備用。無菌水沖洗和消毒處理的過程中，都要不間斷地?fù)u動(dòng)，以保證無菌水和消毒液能夠完全與外植體接觸，提高消毒效率；
[0017]將以上消毒處理過的莖段切成2cm左右的小段(每段上有I個(gè)休眠的腋芽)，用無菌刀片先把莖段最下端切口褐化的部分切去，迅速將腋芽莖段的芽向上接種到啟動(dòng)培養(yǎng)基上。培養(yǎng)條件為:溫度25±2°C，光照時(shí)間為10h/d，光照強(qiáng)度為1500-2000LX，濕度為60%-65 %。啟動(dòng)培養(yǎng)基為:MS+0.25mg/L氯吡苯脲(CPPU)+0.15mg/L萘乙酸(NAA)+3 %蔗糖+0.7 %瓊脂，PH為5.8-6.0;啟動(dòng)培養(yǎng)24d以后，休眠的腋芽萌發(fā)，將新萌發(fā)的嫩芽切下來，接種到不定芽分化(增殖)培養(yǎng)基上。不定芽分化培養(yǎng)基為:MS+0.70mg/L氯吡苯脲(CPPU)+0.15mg/L萘乙酸(NAA)+3 %蔗糖+0.7 %瓊脂，pH為5.8-6.0；增殖培養(yǎng)5 Id以后，腋芽分化產(chǎn)生大量不定芽，不定芽以芽叢的形式存在。將得到的不定芽叢，輕輕撥散成單個(gè)不定芽，將單個(gè)不定芽接種到壯苗生根培養(yǎng)基上。壯苗生根培養(yǎng)條件為:溫度25±2°C，光照時(shí)間為8h/d，光照強(qiáng)度為1000LX，濕度為60%-65%。所述的壯苗生根培養(yǎng)基為:MS+0.10mg/L氯吡苯脲(CPPU) +
0.60mg/L吲哚丁酸(IBA)+0.50g//L活性炭+2 %蔗糖+0.6 %瓊脂，pH為5.8-6.0；壯苗生根培養(yǎng)49d以后，將生根的組培瓶苗轉(zhuǎn)移到煉苗坑道中的苗床上，按照上述
【發(fā)明內(nèi)容】
步驟4)相關(guān)的技術(shù)操作進(jìn)行煉苗移栽。
[0018]本實(shí)施案例獲得的外植體消毒處理污染率為8.6%，不定芽增殖系數(shù)達(dá)到14.1，瓶?jī)?nèi)生根率達(dá)到98.8%，整個(gè)快繁周期(從增殖培養(yǎng)開始到煉苗移栽結(jié)束)為132d。
[0019]實(shí)施案例3
[0020]2014年6月15日，溫室內(nèi)選取生長(zhǎng)旺盛，無病蟲害，性狀表現(xiàn)優(yōu)良的堇葉紫金牛野生單株，剪取當(dāng)年新發(fā)幼嫩枝條，用剪刀將葉片沿葉柄基部切去，嫩莖切成小段，用清水反復(fù)沖洗3-4次，先用0.5%的新潔爾滅+洗潔精混合溶液攪拌消毒處理lh，倒掉消毒液，在流水下沖洗lh，備用。超凈工作臺(tái)中，處理過備用的小段用無菌水沖洗一下，倒掉無菌水，用70 %-75%的酒精溶液消毒90s，倒掉酒精后，再用0.1 %的升汞溶液消毒1min，倒掉消毒液，最后用無菌水反復(fù)沖洗4-5次，備用。無菌水沖洗和消毒處理的過程中，都要不間斷地?fù)u動(dòng)，以保證無菌水和消毒液能夠完全與外植體接觸，提高消毒效率；
[0021 ]將以上消毒處理過的莖段切成2cm左右的小段(每段上有I個(gè)休眠的腋芽)，用無菌刀片先把莖段最下端切口褐化的部分切去，迅速將腋芽莖段的芽向上接種到啟動(dòng)培養(yǎng)基上。培養(yǎng)條件為:溫度25±2°C，光照時(shí)間為10h/d，光照強(qiáng)度為1500-2000LX，濕度為60%-65 %。啟動(dòng)培養(yǎng)基為:MS+0.30mg/L氯吡苯脲(CPPU) +0.20mg/L萘乙酸(NAA) +3 %蔗糖+0.7 %瓊脂，PH為5.8-6.0;啟動(dòng)培養(yǎng)20d以后，休眠的腋芽萌發(fā)，將新萌發(fā)的嫩芽切下來，接種到不定芽分化(增殖)培養(yǎng)基上。不定芽分化培養(yǎng)基為:MS+0.80mg/L氯吡苯脲(CPPU)+0.20mg/L萘乙酸(NAA)+3 %蔗糖+0.7 %瓊脂，pH為5.8-6.0；增殖培養(yǎng)55d以后，腋芽分化產(chǎn)生大量不定芽，不定芽以芽叢的形式存在。將得到的不定芽叢，輕輕撥散成單個(gè)不定芽，將單個(gè)不定芽接種到壯苗生根培養(yǎng)基上。壯苗生根培養(yǎng)條件為:溫度25±2°C，光照時(shí)間為8h/d，光照強(qiáng)度為lOOOLx，濕度為60%-65%。所述的壯苗生根培養(yǎng)基為:MS+0.15mg/L氯吡苯脲(CPPU) +
0.80mg/L吲哚丁酸(IBA)+0.50g//L活性炭+2 %蔗糖+0.6 %瓊脂，pH為5.8-6.0；壯苗生根培養(yǎng)52d以后，將生根的組培瓶苗轉(zhuǎn)移到煉苗坑道中的苗床上，按照上述
【發(fā)明內(nèi)容】
步驟4)相關(guān)的技術(shù)操作進(jìn)行煉苗移栽。
[0022]本實(shí)施案例獲得的外植體消毒處理污染率為9.3%，不定芽增殖系數(shù)達(dá)到13.6，瓶?jī)?nèi)生根率達(dá)到99.2%，整個(gè)快繁周期(從增殖培養(yǎng)開始到煉苗移栽結(jié)束)為137d。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.堇葉紫金?？焖俟S化生產(chǎn)方法，其特征在于包括以下步驟: 1)選取堇葉紫金牛優(yōu)良單株帶腋芽莖段為外植體，先誘導(dǎo)休眠腋芽快速萌發(fā)； 2)誘導(dǎo)腋芽分化不定芽； 3)增殖培養(yǎng)40d以后，腋芽分化產(chǎn)生大量不定芽，不定芽以芽叢的形式存在，將步驟2)得到的不定芽叢，撥散成單個(gè)不定芽，將單個(gè)不定芽接種到壯苗生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)20d以后，不定芽逐漸分化為健壯的再生小苗，同時(shí)基部產(chǎn)生少量愈傷組織，愈傷組織上部分化出少量不定根，所述的壯苗生根培養(yǎng)基為:MS+0.10-0.15mg/L氯吡苯脲CPPU+0.5-0.8mg/L吲哚丁酸IBA+0.5g/L活性炭+2 %蔗糖+0.6 %瓊脂，pH為5.8-6.0; 4)對(duì)生根的組培苗進(jìn)行煉苗移栽。2.如權(quán)利要求1所述的堇葉紫金?？焖俟S化生產(chǎn)方法，其特征在于步驟I)中:選取無病蟲害的堇葉紫金牛性狀優(yōu)良的單株，待新芽抽出后，剪取其中半木質(zhì)化的嫩莖，將葉片沿葉柄基部切去，嫩莖切成小段，進(jìn)行消毒，將消毒處理過的莖段切成2cm的小段，每段上有I個(gè)休眠的腋芽，用無菌刀片先將莖段最下端切口褐化的部分切去，迅速將腋芽莖段的芽向上接種到啟動(dòng)培養(yǎng)基上，啟動(dòng)培養(yǎng)基為:MS+0.15-0.30mg/L氯吡苯脲CPPU+0.10-0.20mg/L萘乙酸NAA+3%蔗糖+0.7%瓊脂，pH為5.8-6.0。3.如權(quán)利要求1所述的堇葉紫金?？焖俟S化生產(chǎn)方法，其特征在于步驟I)中培養(yǎng)條件為:溫度25 ± 2°C，光照時(shí)間為10h/d，光照強(qiáng)度為1500-2000Lx，濕度為60%-65%。4.如權(quán)利要求2所述的堇葉紫金牛快速工廠化生產(chǎn)方法，其特征在于步驟I)中的消毒是將嫩莖切成小段后先用0.5%的新潔爾滅+洗潔精混合溶液攪拌消毒處理lh，倒掉消毒液，在流水下沖洗lh，備用，超凈工作臺(tái)中，處理過備用的小段用無菌水沖洗一下，倒掉無菌水，用70%-75%的酒精溶液消毒60-90s，倒掉酒精后，再用0.1 %的升汞溶液消毒5_10min，倒掉消毒液，最后用無菌水反復(fù)沖洗4-5次。5.如權(quán)利要求1所述的堇葉紫金?？焖俟S化生產(chǎn)方法，其特征在于步驟2)中:啟動(dòng)培養(yǎng)20d以后，休眠的腋芽萌發(fā)，將新萌發(fā)的嫩芽切下來，接種到不定芽分化培養(yǎng)基上，所述的不定芽分化培養(yǎng)基為:MS+0.50-0.80mg/L氯吡苯脲CPPU+0.10-0.20mg/L萘乙酸NAA+3 %蔗糖+0.7% 瓊脂，pH 為 5.8-6.006.如權(quán)利要求1所述的堇葉紫金?？焖俟S化生產(chǎn)方法，其特征在于所述步驟3)中壯苗生根培養(yǎng)條件為:溫度25 土 2°C，光照時(shí)間為8h/d，光照強(qiáng)度為100Lx，濕度為60%-65%。7.如權(quán)利要求1所述的堇葉紫金?？焖俟S化生產(chǎn)方法，其特征在于步驟4)中移栽前3-4d，將組培瓶的瓶蓋松動(dòng)，但不要完全打開，移栽前l(fā)-2d，將組培瓶的瓶蓋完全打開，并往組培瓶?jī)?nèi)灌入少量的無菌水，生根組培苗移栽前，先用鑷子將生根苗輕輕地從培養(yǎng)基內(nèi)夾出來，將根部所帶的培養(yǎng)基用清水完全清洗干凈，將清洗好的生根苗以3-4株為一叢種入煉苗基質(zhì)中，所述煉苗基質(zhì)為松鱗，最后，用0.3 %多菌靈溶液對(duì)移栽的生根苗和基質(zhì)表面進(jìn)行均勻噴施，以松鱗完全浸濕為宜，然后用塑料薄膜做成封閉的小拱棚，進(jìn)行保溫保濕40d左右。8.—種堇葉紫金?？焖俟S化生產(chǎn)方法的壯苗生根培養(yǎng)基，其特征在于由以下成分組成:MS+0.10-0.15mg/L氯吡苯脲CPPU+0.5-0.8mg/L吲哚丁酸IBA+0.5g/L活性炭+2% 蔗糖+.0.6% 瓊脂，pH 為 5.8-6.0。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種堇葉紫金?？焖俟S化生產(chǎn)方法，其特征在于包括以下步驟：1.選取堇葉紫金牛優(yōu)良單株帶腋芽莖段為外植體，先誘導(dǎo)休眠腋芽快速萌發(fā)；2.誘導(dǎo)腋芽分化不定芽；3.增殖培養(yǎng)40d以后，腋芽分化產(chǎn)生大量不定芽，將單個(gè)不定芽接種到壯苗生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)20d以后，不定芽逐漸分化為健壯的再生小苗，同時(shí)基部產(chǎn)生少量愈傷組織，愈傷組織上部分化出少量不定根，所述的壯苗生根培養(yǎng)基為：MS+0.10?0.15mg/L氯吡苯脲CPPU+0.5?0.8mg/L吲哚丁酸IBA+0.5g/L活性炭+2％蔗糖+0.6％瓊脂，pH為5.8?6.0；4.對(duì)生根的組培苗進(jìn)行煉苗移栽。本發(fā)明提高了生產(chǎn)效率和成活率，降低了生產(chǎn)成本，并且獲得的再生苗能夠穩(wěn)定的延續(xù)野生資源的優(yōu)良性狀。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號(hào)】CN105706924
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610068368
【發(fā)明人】孫英坤, 沈柏春, 陳林敬, 樊靖, 胡玉春, 王霽
【申請(qǐng)人】杭州市園林綠化股份有限公司