本發明屬栽培植物良種苗木技術領域。

背景技術：

人類栽培的植物(農作物、果樹、林木、花卉等)在其長期無性繁殖過程中，大多感染并積累了多種病毒。世界各地報道的蘋果病毒有39種，梨病毒23種，葡萄病毒43種、草莓病毒25種、桃病毒39種、李病毒28種、甜櫻桃病毒36種、酸櫻桃病毒21種、杏病毒19種、柑桔病毒20種、還有香蕉病毒、馬鈴薯病毒，郁金香病毒、唐菖蒲病毒、無花果病毒等。這些病毒在植物細胞內干擾了正常的生理代謝活動，引起植物體生長減弱，早衰，植株矮化，葉片變色、卷曲、皺縮、黃化，果實畸形，變小，不著色，含糖量降低，落花、落果，使栽培植物產量減產20％-100％，給人類的農業生產帶來巨大的經濟損失。在現代高效優質農業經濟中，栽培植物病毒病已引起全世界的高度重視。七十年代以前人們發現把栽培植物的枝條放置在高溫條件下進行熱處理，可使部分病毒鈍化，暫時失去生物活性，能降低病毒病對植物體的危害程度。但這種熱處理方法并沒有徹底從植物體內清除病毒，經過一個較長時間后病毒又會在植物體內重新蔓延。特別是對那些多年生植物來說，這種熱處理方法效果不佳。以后人們又發現病毒在植物體內分布是不均勻的。植物的莖尖和根尖的分生組織區和伸長區這一微小區域內沒有病毒。于是人們應用植物組織培養方法，切取0.2-0.5毫米無維管束組織的莖尖進行組織培養，獲得了脫病毒的苗木。但是這種莖尖抗病毒方法切取的莖尖很小需要在顯微解剖鏡下進行工作，具體操作十分困難，莖尖培養成活率、脫毒率也很低。進入九十年代后，人們又將熱處理方法與莖尖培養方法結合起來進行抗病毒。先將要抗毒的植物莖尖(如盆栽苗木或試管苗)放置在35-40℃條件熱處理1個多月，在高溫下病毒被鈍化，使其在植物體內的繁殖傳播速度大減。在這一高溫環境中長出的新植株莖尖很可能抗掉病毒，可切取較長的莖尖1-3毫米進行培養，能獲得抗病毒苗木。目前生產中培育抗病毒良種苗木采用的是上述這種方法。在實際生產操作中切取較大的莖尖(如3毫米長)培養成活率高，但脫毒率很低；切取較小的莖尖(1毫米以內)抗毒率較高，但成活率很低，而且培養成活的抗毒試管苗還有可能發生變異，改變優良品種的性狀。所以，在實際生產中這些問題始終困擾著人們培育抗病毒良種苗木的正常工作。

技術實現要素：

本發明目的就是針對上述情況，采用完全無光黑暗條件對苗木進行熱處理培養，成倍的擴大了莖尖無病毒區域，再切取莖尖進行培養，即能夠完全抗除病毒，提高抗毒率，又能夠切取較長的莖尖，提高莖尖培養成活率，防止發生良種苗木的變異。為實際生產提供了一種新的高效率培育抗病毒良種苗木的方法。

本發明一種培育抗病毒良種苗木的方法是：先將要抗病毒的苗木采用植物組織培養的方法，把它們培養成試管苗，最好是在試管內生根階段的苗或叢生芽狀階段的苗。把這種生長旺盛的試管苗放置在完全無光黑暗的條件下進行熱處理培養45-60天。熱處理溫度為35-40℃。或者將要抗病毒的盆栽苗木(最好是剛經過休眠階段的苗木)放置在完全無光黑暗的條件下進行熱處理培養45-50天，熱處理溫度為35-40℃。苗木經過45-60天的無光黑暗熱處理以后，試管苗莖尖能長出1-4厘米長的淡黃色的幾乎無葉片的新生莖尖；盆栽苗木能長出5-10厘米的淡黃色的頂端幾乎無葉片的新生莖尖。對這些新生莖尖進行縱向石蠟切片觀察發現：試管苗新生莖尖的分生組織區和伸長區，這些無微管束區長度可達5-10毫米以上；盆栽苗木新生莖尖的分生區和伸長區(無微管束區)長度可達10-15毫米以上。病毒在植物體內主要就是通過微管束來傳播的，微管束能將下部成熟植物體內的病毒傳送到微管束區與伸長區交界處，莖尖分生區和伸長區無微管束，所以莖尖分生區和伸長區屬于植物體上無病毒區域。通過無光黑暗熱處理培養，阻止了植物體內正常的光形態建成過程，使莖尖的分生區和伸長區的細胞分化成微管束的過程被減慢，所以分生區和伸長區這一無病毒區域被擴大。再加上35-40℃的長期熱處理，使植物體內的病毒被鈍化，暫時失去植物活性，不能繁殖和快速傳播。所以經過無光黑暗條件下熱處理苗木的新生莖尖，無病毒區域被擴大。本發明的特點在于無光黑暗條件下長期熱處理苗木，能極大地擴大新生莖尖的無病毒區域。

本發明一種培育抗病毒良種苗木的方法是：第一條途徑，按照植物組織培養方法，在無菌條件下切取經過無光黑暗熱處理的新生莖尖長5-8毫米，接種到新配制的莖尖培養基上。在光照強度1500-3000勒克斯，溫度25-28℃條件下進行培養，使莖尖生長，分化。經過幾代反復擴大增殖培養，對每一個莖尖的無性系苗木進行病毒檢測。采用指示植物檢測法、酶聯免疫法，電子顯微鏡檢測法，確定這一無性系苗木完全抗病毒后，應用植物組培快速繁殖方法對抗病毒良種苗木進行繁殖，為生產提供大批量抗病毒良種苗木。第二條途徑，經過無光黑暗熱處理的盆栽苗木，可切取10-12毫米長的莖尖，嫁接到事先準備好的無病毒砧木上，每一個莖尖嫁接一個砧木。當莖尖接穗成活生長后，對每一個莖尖苗木進行病毒檢測，確定這一莖尖苗木無病毒后，以這一抗病毒良種苗木為母體，剪取其新枝條作接穗，進行大量嫁接繁殖抗病毒良種苗木。本發明的特點在于切取5-8毫米長的經過無光黑暗熱處理試管苗的莖尖，通過組培快速繁殖方法大量繁殖抗病毒良種苗木；切取10-12毫米長的經過無光黑暗熱處理的盆栽苗木莖尖，通過嫁接方法大量繁殖抗病毒良種苗木。

采用本發明方法培育抗病毒良種苗木，具有操作方法簡單、易行、抗病毒率和成活率很高等優點，在實際生產中應用效果良好。用本發明方法抗葡萄扇葉病毒、卷葉病毒、莖痘病毒，栓皮病毒，試管苗經過無光黑暗熱處理培養后，可直接切取8毫米長的莖尖，不需要在顯微解剖鏡下操作切取0.3毫米長的莖尖，所以本發明方法操作簡單易行。這樣8毫米長的莖尖接種到培養基上成活率都在100％。用指示植物檢測病毒，結果抗病毒率為100％。因此本發明方法抗病毒率高，成活率高。培育出來的抗病毒葡萄良種苗木在生產中栽培結果后，葡萄果粒增大，甜度明顯提高，結果產量增產70-80％，經濟效益顯著增加。

實施例1：

冬季將經過休眠期的感染有梨石痘病毒的盆栽庫爾勒香梨，放置在完全無光黑暗條件下，在38℃±1℃的環境中熱處理培養60天。要定期給盆栽香梨澆水，防止因缺水造成苗木死亡。同時在溫室中，播種無病毒的杜梨種子，培養杜梨營養缽苗作嫁接砧木。切取無光黑暗熱處理的香梨莖尖10毫米長，操作時要注意刀具器械不要與莖尖下部組織相接觸，以免交叉感染病毒。采用劈接法將香梨莖尖嫁接到杜梨砧木上，2周后香梨莖尖開始萌動、生長，莖尖嫁接成活率為80％，每一個莖尖嫁接一個砧木，并按順序編號。春夏季香梨莖尖嫁接苗長大后進行病毒檢測，可采用血清學快速檢測法，檢測結果脫除梨石痘病毒的苗木為95％。將培育得到的無毒梨良種苗木作為采穗母株，采其枝芽作接穗，大量繁殖抗毒香梨苗木，為生產栽培提供無毒良種苗木。

實施例2：

如大棗感染病毒后，大棗變小，葉片出現明顯缺綠斑塊，落花落果嚴重，產量大幅下降。將感染病毒的大棗，通過植物組織培養方法，培養出試管叢生芽。將這種哈密大棗試管苗放置在完全無光黑暗的條件下，在38℃±0.5℃環境中熱處理培養50天。這時候大棗試管苗重新生長出2-3厘米長的淡黃色無葉片莖尖。在無菌室的凈化工作臺上，直接切取8毫米長的莖尖，操作時刀具器械不要接觸莖尖下部組織，防止病毒交叉感染新莖尖組織。將每一個莖尖分別接種到一個三角瓶中的新培養基中，并對每一個三角瓶中的莖尖進行編號。莖尖培養基為ms培養基+1.0毫克/升的激動素+1.0毫克/升的6-基氨基嘌呤+0.02毫克/升萘乙酸。在光照強度1500-3000勒克斯，溫度25-30℃條件下，培養1周莖尖開始萌動、生長，莖尖培養成活率為100％。經過幾代的誘導增殖培養，每個莖尖可以獲得許多試管叢生芽。采用酶聯免疫法對試管苗進行病毒檢測，結果脫病毒率為100％。然后通過植物組培快速繁殖方法，大批量地生產抗病毒良種棗苗，為生產栽培提供無毒良種苗木。