一種無二甲基亞砜無蛋白-80℃細胞凍存液配方及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種無二甲基亞砜無蛋白-80°c細胞凍存液配方及其制備方法，屬于 組織細胞培養技術領域。
【背景技術】
[0002] 細胞凍存技術是細胞生物學技術中一個非常重要的手段，常規的細胞凍存液中， 往往需要添加10%濃度的二甲基亞砜和人或動物源的血清或蛋白。隨著近年來干細胞治療 技術和免疫細胞治療技術的發展，細胞凍存液在臨床上的使用的需求越來越大，凍存的細 胞復蘇后理論上需要洗滌，去除細胞凍存液中的二甲基亞砜和其它動物源的成分，但該過 程在實驗室操作起來簡便，對于臨床上的使用非常麻煩，往往二甲基亞砜被直接輸入人體。 國內臨床使用的細胞凍存液中的二甲基亞砜往往使用的是國外進口的醫藥級試劑，價格非 常昂貴，即使使用國外進口的高質量二甲基亞砜，在臨床上依然有很多病人會出現嚴重的 副反應。臨床上對更為安全的細胞凍存液的需求非常迫切，我們在前面申報的專利，申請號 為20151074667913,發明名稱為《無蛋白液氮凍存液及其制備方法》基礎上，對凍存液的配 方做進一步的改進，實現在_80°C，使用無二甲基亞砜無蛋白的凍存液，可以達到高效率的 細胞凍存和復蘇。新的配方為凍存液在臨床的使用帶來了便利，可以避免由二甲基亞砜給 病人帶來的副作用，使用更為安全。

【發明內容】

[0003] 本發明主要提供了一種無二甲基亞砜無蛋白-80°C細胞凍存液配方及其制備方 法，該凍存液完全由化學成分組成配制，不含二甲基亞砜，細胞復蘇率高，穩定性好。
[0004] 本發明的技術方案如下：一種無二甲基亞砜無蛋白_80°C細胞凍存液，其每IOOmL 的細胞凍存液中含有6. Og的右旋糖苷、1.0~9. Og的馬來酰化的多聚賴氨酸，余量為RPMI-1640細胞基礎培養基。
[0005] 優選的，所述的馬來酰化的多聚賴氨酸的修飾度為30~90%。
[0006] 優選的，所述每IOOmL細胞凍存液中含有7.Og的60%修飾度的馬來酰化多聚賴氨 酸。
[0007] 本發明的另一技術方案如下：一種無二甲基亞砜無蛋白_80°C細胞凍存液的制備 方法，其特征在于:包括以下步驟：
[0008] (1)稱取配方量的右旋糖苷，溶解于70%量的RPMI-1640細胞基礎培養基中；
[0009 ] (2)在上述溶液中添加配方量的60 %修飾度的馬來酰化多聚賴氨酸；
[0010] (3)最后添加剩余的RPMI-1640細胞基礎培養基；
[0011] (4)在無菌條件下將上述混合液先用0.45μπι濾膜進行澄清過濾，然后在無菌條件 下再用0.22μπι濾膜進行過濾除菌，即得到無二甲基亞砜無蛋白液氮細胞凍存液。
[0012] 有益效果：
[0013] 本發明的無二甲基亞砜無蛋白細胞凍存液，完全由化學成分組成配制，不含二甲 基亞諷和蛋白質，細胞復蘇率尚，能達到90 %以上；因不添加二甲基亞諷，凍存液用于臨床 上細胞的凍存，直接輸入人體，可避免由二甲基亞砜引起的副作用、同時不添加人白蛋白、 動物血清等，減少了細胞感染病原的可能性。將配好的細胞凍存液采用分級過濾的方法進 行制備，避免高溫消毒引起凍存液成分的破壞，被破壞的部分成分會導致細胞毒性。該凍存 液的配方對細胞有極好凍存效果，同時因配方中避免使用價格昂貴的進口二甲基亞砜，生 產成本更低，操作簡化。
[0014] 本發明的配方中一個成分是我們依據細胞凍存的原理，用有機合成的方法獲得的 高分子。然后在我們的無蛋白液氮凍存液配方基礎上做進一步的改進和優化。本發明采用 有機合成的方法，合成特定的酸酐修飾的多聚賴氨酸，然后和其它不同的高分子混合，得到 合適的無二甲基亞砜無蛋白-80 °C細胞凍存液。
[0015] 這種無二甲基亞砜無蛋白-80°c細胞凍存液的使用方法之一，具體的為，取人淋巴 細胞，用細胞洗滌液洗滌后，調整至每管中含有IO 6個細胞，離心去除洗滌液，每管中加入 Iml無二甲基亞砜無蛋白-80 °C細胞凍存液懸浮細胞，于-80 °C在冰箱中直接凍存。
[0016] 右旋糖酐系鹿糖經腸膜狀明串珠菌-1226(Leuconostoc mesenteroides)發酵合 成的一種高分子葡萄糖聚合物，經處理精制而得。由于聚合的葡萄糖分子數目不同，而產生 不同分子量的產品。有高分子右旋糖酐（平均分子量10萬-20萬）、中分子右旋糖酐(平均分 子量6萬-8萬）、低分子右旋糖酐(平均分子量2萬-4萬）小分子右旋糖酐(平均分子量1萬-2 萬）。右旋糖酐在臨床上有著非常廣泛的用途，主要用作血漿代用品：中分子右旋糖酐用于 出血性休克、創傷性休克及燒傷性休克等。低、小分子右旋糖酐，能改善微循環，預防或消除 血管內紅細胞聚集和血栓形成等，亦有擴充血容量作用。中分子右旋糖酐在其它領域也有 著非常廣泛的用途，最常用的是可用做淋巴細胞分離液的主要成分，鑒于其獨特的天然親 水性高分子材料，在申請號為20151074667913，發明名稱為《無蛋白液氮凍存液及其制備方 法》，在液氮凍存液的配方中，右旋糖苷起到了很好的效果。我們把它作為無二甲基亞砜和 無蛋白-80°C細胞凍存液的一個基礎配方，和其它試劑配伍，以期獲得無二甲基亞砜無蛋 白-80°C細胞凍存液配方。
[0017] ε-多聚賴氨酸是目前天然防腐劑中具有優良防腐性能的微生物類食品防腐劑。它 是由25~30賴氨酸殘基聚合而成，具有強烈的抑菌能力，可以作為防腐劑用于食品的保鮮。 ε_多聚賴氨酸抑菌譜廣，在酸性和微酸性環境中對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌、 霉菌均有一定的抑菌效果，ε_多聚賴氨酸對其他天然防腐劑不易抑制的革蘭氏陰性的大腸 桿菌、沙門氏菌抑菌效果非常好，而且其對耐熱性芽孢桿菌和一些病毒也有抑制作用。常被 用做食品和藥物的保護試劑，我們將多聚賴氨酸鏈上的α氨基，用馬來酸酐進行修飾，測定 不通修飾程度的修飾的多聚賴氨酸，和上面的右旋糖苷混合配伍，配制出無二甲基亞砜無 蛋白質的-80 °C細胞凍存液。
[0018] 本發明在現有的RPMI-1640細胞基礎培養基的基礎上添加右旋糖酐、馬來酸酐修 飾的多聚賴氨酸，配制成一種無二甲基亞砜無蛋白的_80°C細胞凍存液。
【具體實施方式】
[0019] 實施例1
[0020] I、修飾多聚賴氨酸的合成
[0021] A，乙酰基修飾的多聚賴氨酸的合成:將20 %的多聚賴氨酸水溶液，控制在10度以 下，用5NNa0H將pH值調節到9，不斷添加乙酸酐，用氫氧化鈉控制反應液的pH值，依據加入的 乙酸酐的量不同，得到不同程度修飾的乙酰化多聚賴氨酸。得到的產物用凝膠過濾的方法， 去掉鹽和副產物，凍干，得到白色固體。
[0022] B，馬來酰化多聚賴氨酸的合成:將20%的多聚賴氨酸水溶液，控制在10度以下，用 5NNa0H將pH值調節到9，不斷添加馬來酸酐，用氫氧化鈉控制反應液的pH值，依據加入的馬 來酸酐的量不同，得到不同程度修飾的馬來酰化多聚賴氨酸。得到的產物用凝膠過濾的方 法，去掉鹽和副產物，凍干，得到白色固體。
[0023] 實施例2
[0024] 1.無二甲基亞砜無蛋白細胞-80 °C細胞凍存液的配制，包括以下步驟：
[0025] (1)稱取6.(^的右旋糖苷，溶解于7〇1111的1?^1-1640細胞基礎培養基中；
[0026] (2)在上述溶液中添加7. Og的60 %修飾度的馬來酰化的多聚賴氨酸；
[0027] (3)最后添加 RPMI-1640細胞基礎培養基定容至100mL;
[0028] 2.先在非無菌條件下將上述混合液先用0.45μπι濾膜進行澄清過濾，然后在無菌條 件下再用〇.22μπι濾膜進行過濾除菌，即得到無二甲基亞砜無蛋白-80°C細胞凍存液。
[0029] 實施例3
[0030] 1.無二甲基亞砜無蛋白_80°C細胞凍存液的配制，包括以下步驟：
[0031] (1)稱取6.(^的右旋糖苷，溶解于7〇1111的1?^1-1640細胞基礎培養基中；
[0032] (2)在上述溶液中添加不同量的60 %修飾度的乙酰化多聚賴氨酸，加入的乙酰化 多聚賴氨酸的量使得終濃度分別為1%，3%，7%，9% ;
[0033] (3)最后添加 RPMI-1640細胞基礎培養基定容至100mL;
[0034] 2.先在非無菌條件下將上述混合液先用0.45μπι濾膜進行澄清過濾，然后在無菌條 件下再用〇. 22μπι濾膜進行過濾除菌，即得到無蛋白細胞凍存液。
[0035] 實施例4
[0036] 1.無二甲基亞砜無蛋白-80 °C細胞凍存液的配制，包括以下步驟：
[0037] (1)稱取6. Og的右旋糖酐，溶解于70ml的RPMI-1640細胞基礎培養基中；
[0038] (2)在上述溶液中添加不同量的60 %修飾度的馬來酰化的多聚賴氨酸，加入的量 是的終濃度分別為1 %，3%，7%，9% ;
[0039] (3)最后添加 RPMI-1640細胞基礎培養基定容至100mL;
[0040] 2.無二甲基亞砜無蛋白-80°c細胞凍存液的配制和制備方法，先在非無菌條件下 將上述混合液先用0.45μπι濾膜進行澄清過濾，然后在無菌條件下再用0.22μπι濾膜進行過濾 除菌，即得到無蛋白-80細胞凍存液。
[0041 ] 實施例5
[0042] 1. 一種無二甲基亞砜無蛋白-80°C細胞凍存液的制備方法，包括以下步驟：
[0043] (1)稱取6. Og的右旋糖酐，溶解于70ml的RPMI-1640細胞基礎培養基中；
[0044] (2)在上述溶液中添加馬來酰化的多聚賴氨酸，加入的量是的終濃度分別為7% ; 共配置三種，其中不同之處在于添加馬來酰化的多聚賴氨酸修飾度分別為30%，60%，90% [0045] (3)最后添加 RPMI-1640細胞基礎培養基定容至100mL;
[0046] 2.無二甲基亞砜無蛋白-80°C細胞凍存液的配制和制備方法，先在非無菌條件下 將上述混合液先用0.45μπι濾膜進行澄清過濾，然后在無菌條件下再用0.22μπι濾膜進行過濾 除菌，即得到無蛋白_80°C細胞凍存液。
[0047]對比細胞凍存液(含蛋白）
[0048] 1.凍存液的配方和配制方法
[0049] 將二甲基亞砜、胎牛血清和RPMI-1640培養基按照體積比為1:1:8的比例配制成 100mL的凍存液，除菌過濾。
[0050] 細胞活率測試
[0051 ] 取實施例2-5及對比細胞凍存液，分別凍存在-80 °C凍存人淋巴細胞，凍存4周后進 行細胞復蘇，進行以下細胞活率分析操作：
[0052] 將凍存的細胞于37°C水浴復蘇，使其在2分鐘內復蘇，用RPMI-1640基礎培養基稀 釋，取1〇〇μ1細胞懸液和1〇〇μ1的臺盼蘭染液混合，染色分析細胞活率，多做幾組，取平均值。 [0053]實施例2的結果：
[0054] 表1細胞活率

[0056]實施例3的結果：
[0057] 表2細胞活率

[0059]實施例4的結果：
[0060] 表3細胞活率

[0062]實施例5的結果：
[0063] 表4細胞活率

[0065] 由表1可知，用本發明制備的無二甲基亞砜無蛋白凍存液-80 °C細胞凍存液，用 60 %修飾度的馬來酰化的多聚賴氨酸，在7 %的濃度，和右旋糖苷配伍，可以配置出比經典 凍存液更好的凍存效果的凍存效果。說明本發明的無 DSMO無蛋白-80 °C細胞凍存液，復蘇效 率高，適于細胞在-80度凍存。
[0066] 本發明中，細胞的凍存只實驗分離的人淋巴細胞，對于其它細胞的凍存，也會取得 類似的效果，也在我們的保護范圍中。對本領域的技術人員來說，可根據以上描述的技術方 案以及構思，做出其它各種相應的改變以及形變，而所有的這些改變以及形變都應該屬于 本發明權利要求的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種無二甲基亞砜無蛋白-80 °C細胞凍存液，其特征在于：每lOOmL的細胞凍存液中 含有6.0g的右旋糖苷、1.0~9.0g的馬來酰化的多聚賴氨酸，余量為RPMI-1640細胞基礎培 養基。2. 根據權利要求1所述的無二甲基亞砜無蛋白-80°C細胞凍存液，其特征在于:所述的 馬來酰化的多聚賴氨酸的修飾度為30~90 %。3. 根據權利要求2所述的無二甲基亞砜無蛋白-80°C細胞凍存液，其特征在于:所述每 1 OOmL細胞凍存液中含有7.0g的60 %修飾度的馬來酰化多聚賴氨酸。4. 一種如權利要求3所述的無二甲基亞砜無蛋白-80°C細胞凍存液的制備方法，其特征 在于:包括以下步驟： (1) 稱取配方量的右旋糖苷，溶解于70 %量的RPMI-1640細胞基礎培養基中； (2) 在上述溶液中添加配方量的60 %修飾度的馬來酰化多聚賴氨酸； (3) 最后添加剩余的RPMI-1640細胞基礎培養基； (4) 在無菌條件下將上述混合液先用0.45μπι濾膜進行澄清過濾，然后在無菌條件下再 用0.22μπι濾膜進行過濾除菌，即得到無二甲基亞砜無蛋白-80°C細胞凍存液。
【專利摘要】本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種無二甲基亞砜無蛋白-80℃細胞凍存液及其制備方法，每100ml無二甲基亞砜無蛋白-80℃細胞凍存液中含有6g的右旋糖酐、1.0-9.0g的60％修飾度的馬來酰化多聚賴氨酸，余量為RPMI-1640細胞基礎培養基。本發明的無二甲基亞砜無蛋白-80℃細胞凍存液由化學成分組成配制，不含二甲基亞砜和蛋白質，細胞復蘇率高，穩定性好。
【IPC分類】A01N1/02
【公開號】CN105707058
【申請號】CN201610261608
【發明人】徐念沁, 郁慶明, 徐煒華
【申請人】南京三生生物技術有限公司