本發明屬于植物組培技術領域，具體涉及一種金絲4號棗的組培快繁方法。
背景技術：
“金絲4號”棗是山東省果樹研究所1990年從金絲2號自然雜交的實生棗樹中選育出的優良單株。具有果大、整齊、含糖高、品質優、抗病、抗裂果、結果早、極豐產、抗逆、適應性強等優點。金絲4號棗果實近長筒形，兩端平，中部略粗。平均果重10～12克，整齊度高。果肩平而略斜，無明顯梗洼，環洼中等深寬，果尖微凹，果面光滑，光亮艷麗，果皮細薄富韌性，白熟期淺綠白色，著色后呈淺棕紅色。果肉白色，質地致密脆嫩，汁液較多，味極甜微酸，無苦辣草辛等雜味，口感極佳。皮薄肌豐，核小肉厚，清香甘甜，既可以鮮食，又可以制干，以其優異的品質和豐富的營養備受消費者歡迎。“金絲4號”棗具有早實、豐產、抗逆性強的特點，是我國南方丘崗山地開發極具發展前途的樹種，已經成為我國南方地區主栽棗品種。
目前，在實際栽培中，“金絲4號”棗大多采用根蘗苗分株、扦插和嫁接等方法進行繁育，利用根孽分苗繁殖，需與嫁接繁殖相結合，不僅費工費時，成苗率較低，且易侵染各種植物病毒，而且采用根蘗苗分株、扦插和嫁接等方法進行繁育繁殖率很低，生長速度慢，弱病苗比例高，不能進行周年生產，遠遠不能滿足市場的大量需求。因而影響了其大面積的推廣。在此形勢下，采用棗樹組織培養技術則成了快速培育良種苗木的有效途徑。組織培養（Tissue Culture）是在無菌條件下，分離并在培養基中培養離體植物組織的技術，用組織培養方法快速繁殖，具有整株的遺傳一致性，生長健壯，根系發達、移栽成活率高，果品品質好，產量高等優點。
棗樹的組織培養研究始于 2O 世紀 70 年代末，迄今為止，已有20多個品種以不同類型外植體建立了無菌離體繁殖體系。對于棗樹的組培方法也有相關文獻報道，如：1、【題名】毛葉棗組培快繁技術研究 【作者】續九如，李春立，孫建設【出處】北京林業大學學報，2003,25（3）【摘要】利用組織培養技術對毛葉棗的組培快繁技術進行了研究。證明3、4月是1年內采集外植體的最佳時期，在此階段對外植體進行培養時，有效萌芽率最高。以MS為基本培養基篩選出適合毛葉棗組培各階段的適宜激素濃度和配比 ，分別為：啟動培養基 MS+6-BA 0.8 mg/L+IBA 0.4mg/L；增殖培養基MS+ 6-BA 1.2 mg/L+IBA 0.5mg/L；生根培養基1/2MS+IBA 3.0mg/L并闡明了繼代次數與增殖系數和生根率的關系，提出毛葉棗繼代次數以8代左右為宜，8 代之后 應進行生根培養。2、【題名】酸棗組培快繁研究【作者】代麗，劉孟軍，王玖瑞，周俊義【出處】河北農業大學學報，2005,28（2）【摘要】:以休眠芽為試材 ，建立了酸棗的組培快繁體系。最適啟動培養基為MS+ BA1.0+ IBA0.1或 MS+BA2.0+NAA0.1，增殖培養基為MS+BA2.0-3.0，萌芽率和壯芽率均超過了70％。增殖培養時，下部莖段的出芽率高于上部莖段 ，但萌發壯芽的比率則以上部莖段相對較高。1/2 MS+IBA0.5-1.0是酸棗快繁生根培養的適宜培養基，生根率最高可達92％。迄今為止，人們在棗樹的組培研究方面已取得了一些成就，運用組培繁殖棗樹優良品種的技術已逐步應用到生產中，但是，棗的組織培養較困難，成本較高，不同品種間的繁殖條件差異較大，不同品種的棗樹的組培方法也不一樣。目前，在“金絲4號”棗的繁育上，由于采用傳統的根蘗苗分株、扦插和嫁接等方法進行繁育，存在著繁育繁殖率很低，生長速度慢，遠遠不能滿足市場的大量需求等問題；因此，開發一種針對“金絲4號”棗的組培快繁方法進行培養繁殖，能夠促進優良遺傳材料的快速繁殖，實現 “金絲4號”棗樹的大量繁殖和快速推廣，是解決市場需求等問題的有效方法。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種操作簡便，生產成本低，生根率高，繁殖率高，可應用于大規模商品化育苗的金絲4號棗的組培快繁方法，采用該方法能有效、方便的在短時間內獲得大量金絲4號棗組培苗，而且所獲得的組培苗成活率高，適合廣西喀斯特地貌山區種植。
為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：
一種金絲4號棗的組培快繁方法，包括以下步驟：
(1)外植體的建立：于3月初，剪取16-18cm長、當年生優質粗壯的根蘗條，用自來水沖洗10分鐘后，于質量濃度為0.4%洗衣粉溶液中浸泡10-13分鐘，再用自來水沖洗干凈，然后將洗凈后的根蘗條置于培養室中水培培養，每22-26小時換一次水，培養溫度為27-28℃，光照時間17-19h/d，光照強度2000～3500lx，培養至長出2～3cm的水培芽后，取出根蘗條，清洗、消毒后剪取水培芽作為外植體；
（2）啟動培養：將水培芽轉入經高溫滅菌的啟動培養基中，誘導不定芽的萌發，培養條件為溫度 25～28 ℃ ,光照強度為2000-2500lx，光照時間16-17h/d，在培養室中無菌培養，新芽萌發之后，將其轉接到分生培養基中培養，在光照強度為2000-2200lx，光照時間14-16h/d，溫度為27℃的條件下，培養40-45天；
（3）繼代培養：將植株莖段轉接入經消毒后的繼代培養基中培養，在培養溫度為25-26℃，光強 2000～25O0lx，光照時間為15h/d的條件下培養32-34d；
（4）生根培養：在無菌條件下，剪取長2-2.5cm繼代培養得到的帶葉莖段，插入生根培養基中進行生根培養；培養溫度 26～28℃，光強1800～20001x，光照時間14-16h/d；
（5）煉苗：當經過生根培養后的生根試管苗根長1.0～2.0 cm時，將組培苗進行室內煉苗，煉苗溫度為：27-28℃，光照強度為4000-6000lx，室內瓶煉4-6天后，敞口煉苗5-7天；
（6）移栽：取出試管苗，洗凈根上的培養基，移栽到用質量濃度為0.2%KMnO4溶液消毒過的椰糠+蛭石+細河沙按照2-3:5:1的比例做基質的營養杯中，澆足水，保持空氣濕度為85％-90%，溫度 25～26℃，避免陽光直射， 35-38 天后，移出溫室進行全光照煉苗5-6d，及時澆水，然后移栽大田。
所述的金絲4號棗的組培快繁方法，步驟（1）中培養至長出2～3cm的水培芽后對根蘗條清洗消毒的具體步驟為：取出根蘗條，用75%的酒精浸泡35s，無菌水沖洗3-4次，瀝干水分，放到質量濃度為0.1%HgCL2溶液中浸泡消毒7分鐘，然后用無菌水沖洗7-8次，用鑷子夾取清洗好的莖段，放置在滅菌的接種碟上，用滅菌過的濾紙吸干表面水分，剪取水培芽作為外植體。
所述的金絲4號棗的組培快繁方法，步驟（2）中的啟動培養基的成分為：MS+ N6芐基腺嘌呤（6-BA) 1.2mg/L +萘乙酸（NAA）0.15～0.25mg/L +3.5%糖蜜+瓊脂6g/L，培養基pH 值為 6.0-6.3。
所述的金絲4號棗的組培快繁方法，步驟（2）中的分生培養基的成分為：MS+ N6芐基腺嘌呤（6-BA) 2.2mg/L+萘乙酸（NAA）0.5mg/L +維生素C 1.6-1.8mg/L+谷氨酸1.7 ～ 2.0mg/L +3.5%糖蜜+瓊脂7g/L，培養基pH 值為6.0。
所述的金絲4號棗的組培快繁方法，步驟（3）中繼代培養基的成分為：MS+ N6芐基腺嘌呤（6-BA) 2.2mg/L+萘乙酸（NAA）0.5-0.6mg/L +維生素C 0.7-0.9mg/L+維生素B2 1.5-1.8mg/L+谷氨酸1.7～2.0mg/L +3.5%糖蜜+瓊脂8g/L, 培養基pH 值為6.1。
所述的金絲4號棗的組培快繁方法，步驟（4）中生根培養基的成分為：1/2MS+ NAA 0.05mg/L+ IAA0.15 mg/L+IBA 0.7～1.0 mg/L+5%糖蜜+瓊脂8g/L, pH=6.0-6.2。
本發明的有益效果為：
1、本發明是一種針對“金絲4號”棗的組培快繁方法，針對“金絲4號”棗品種進行的研究，經過不斷試驗，得到了最適合該棗樹組培快繁所用的各種培養基，本發明的培養基所采用的碳源為糖蜜（糖廠蔗糖生產分離出來的不結晶的含糖液體），代替了常用的蔗糖，不僅降低了培養基的成本，而且糖蜜富含營養成分，含有各種單糖、粗蛋白質和礦物質，更容易被植物利用。本發明分生培養基和繼代培養基中都加入了谷氨酸，谷氨酸不僅能提供有機氮源，同時也對植物體的生長及不定芽，不定胚的分化起促進作用，而且能夠被植物細胞很快吸收；在培養基中加入的維生素C 和維生素B2，能增強培養基的營養，利于外植體的生長發育。
2、本發明的金絲4號棗的組培快繁方法可以解決采用傳統繁育方法存在的繁殖率很低，生長速度慢等問題，采用本發明的金絲4號棗的組培快繁方法能夠極大地提高金絲4號棗的繁殖速度，降低弱苗、病苗的發生比例，加速了新品種的快速推廣和開發利用；采用該方法對金絲4號棗進行進行培養繁殖，能夠促進優良遺傳材料的快速繁殖，實現 “金絲4號”棗樹的大量繁殖和快速推廣，解決市場的需求。
3、本發明的金絲4號棗的組培快繁方法操作難度低、生產成本低，生根率高達88%以上，生產的組培苗成活率高，易于在大范圍內推廣使用，采用本發明的金絲4號棗的組培快繁方法可以獲得大量整齊一致，遺傳性狀穩定的再生植株，試驗結果穩定，重復性良好，可應用于大規模商品化育苗，苗木能夠保持優樹的優良遺傳性狀，適合廣西北部山區大面積區域種植，特別是喀斯特地貌山區種植。
具體實施方式
實施例1
一種金絲4號棗的組培快繁方法，包括以下步驟：
(1)外植體的建立：于3月初，剪取16cm長、當年生優質粗壯的根蘗條，用自來水沖洗10分鐘后，于質量濃度為0.4%洗衣粉溶液中浸泡10分鐘，再用自來水沖洗干凈，然后將洗凈后的根蘗條置于培養室中水培培養，每22小時換一
次水，培養溫度為27-28℃，光照時間17h/d，光照強度3500lx，培養至長出2～3cm的水培芽后，取出根蘗條，用質量濃度為75%的酒精浸泡35s，無菌水沖洗3次，瀝干水分，放到質量濃度為0.1%HgCL2溶液中浸泡消毒7分鐘，然后用無菌水沖洗7次，用鑷子夾取清洗好的莖段，放置在滅菌的接種碟上，用滅菌過的濾紙吸干表面水分，剪取水培芽作為外植體；
（2）啟動培養：將水培芽轉入經高溫滅菌的啟動培養基中（啟動培養基的成分為：MS+ N6芐基腺嘌呤（6-BA) 1.2mg/L +萘乙酸（NAA）0.15mg/L +3.5%糖蜜+瓊脂6g/L，培養基pH 值為6.0-6.3）誘導不定芽的萌發，培養條件為溫度 25℃ ,光照強度為2500lx，光照時間16h/d，在培養室中無菌培養，新芽萌發之后，將其轉接到分生培養基中培養，分生培養基的成分為：MS+ N6芐基腺嘌呤（6-BA) 2.2mg/L+萘乙酸（NAA）0.5mg/L +維生素C 1.6mg/L+谷氨酸2.0mg/L +3.5%糖蜜+瓊脂7g/L，培養基pH 值為6.0；在光照強度為2000lx，光照時間16h/d，溫度為27℃的條件下，培養40天；
（3）繼代培養：將植株莖段轉接入經消毒后的繼代培養基中培養中，繼代培養基的成分為：MS+ N6芐基腺嘌呤（6-BA) 2.2mg/L+萘乙酸（NAA）0.5mg/L +維生素C 0.7mg/L+維生素B2 1.8mg/L+谷氨酸1.8mg/L +3.5%糖蜜+瓊脂8g/L, 培養基pH 值為6.1；在培養溫度為25-26℃，光強 2000lx，光照時間為15h/d的條件下培養34d；
（4）生根培養：在無菌條件下，剪取長2-2.5cm繼代培養得到的帶葉莖段，插入生根培養基中進行生根培養；生根培養基的成分為：1/2MS+ NAA 0.05mg/L+ IAA0.15 mg/L+IBA 0.7mg/L+5%糖蜜+瓊脂8g/L, pH=6.0-6.2；培養溫度 26～28℃，光強18001x，光照時間16h/d；
（5）煉苗：當經過生根培養后的生根試管苗根長1.0～2.0 cm時，將組培苗進行室內煉苗，煉苗溫度為：27-28℃，光照強度為4000lx，室內瓶煉6天后，敞口煉苗5天；
（6）移栽：取出試管苗，洗凈根上的培養基，移栽到用質量濃度為0.2%KMnO4溶液消毒過的椰糠+蛭石+細河沙按照2:5:1的比例做基質的營養杯中，澆足水，保持空氣濕度為85％-90%，溫度 25～26℃，避免陽光直射， 35天后，移出溫室進行全光照煉苗5d，及時澆水，然后移栽大田。
實施例2
一種金絲4號棗的組培快繁方法，包括以下步驟：
(1)外植體的建立：于3月初，剪取17cm長、當年生優質粗壯的根蘗條，用自來水沖洗10分鐘后，于質量濃度為0.4%洗衣粉溶液中浸泡12分鐘，再用自來水沖洗干凈，然后將洗凈后的根蘗條置于培養室中水培培養，每24小時換一
次水，培養溫度為27-28℃，光照時間18h/d，光照強度3000lx，培養至長出2～3cm的水培芽后，取出根蘗條，用75%的酒精浸泡35s，無菌水沖洗4次，瀝干水分，放到質量濃度為0.1%HgCL2溶液中浸泡消毒7分鐘，然后用無菌水沖洗8次，用鑷子夾取清洗好的莖段，放置在滅菌的接種碟上，用滅菌過的濾紙吸干表面水分，剪取水培芽作為外植體；
（2）啟動培養：將水培芽轉入經高溫滅菌的啟動培養基中（啟動培養基的成分為：MS+ N6芐基腺嘌呤（6-BA) 1.2mg/L +萘乙酸（NAA）0.20mg/L +3.5%糖蜜+瓊脂6g/L，培養基pH 值為6.0-6.3）誘導不定芽的萌發，培養條件為溫度25～28℃ ,光照強度為2300lx，光照時間16h/d，在培養室中無菌培養，新芽萌發之后，將其轉接到分生培養基中培養，分生培養基的成分為：MS+ N6芐基腺嘌呤（6-BA) 2.2mg/L+萘乙酸（NAA）0.5mg/L +維生素C 1.7mg/L+谷氨酸1.8mg/L +3.5%糖蜜+瓊脂7g/L，培養基pH 值為6.0；在光照強度為2100lx，光照時間15h/d，溫度為27℃的條件下，培養43天；
（3）繼代培養：將植株莖段轉接入經消毒后的繼代培養基中培養中，繼代培養基的成分為：MS+ N6芐基腺嘌呤（6-BA) 2.2mg/L+萘乙酸（NAA）0.6mg/L +維生素C 0.8mg/L+維生素B2 1.7mg/L+谷氨酸1.9mg/L +3.5%糖蜜+瓊脂8g/L, 培養基pH 值為6.1；在培養溫度為25-26℃，光強 23O0lx，光照時間為15h/d的條件下培養33d；
（4）生根培養：在無菌條件下，剪取長2-2.5cm繼代培養得到的帶葉莖段，插入生根培養基中進行生根培養；生根培養基的成分為：1/2MS+ NAA 0.05mg/L+ IAA0.15 mg/L+IBA 0.8mg/L+5%糖蜜+瓊脂8g/L, pH=6.0-6.2；培養溫度 27℃，光強19001x，光照時間15h/d；
（5）煉苗：當經過生根培養后的生根試管苗根長1.0～2.0cm時，將組培苗進行室內煉苗，煉苗溫度為：27-28℃，光照強度為5000lx，室內瓶煉5天后，敞口煉苗6天；
（6）移栽：取出試管苗，洗凈根上的培養基，移栽到用質量濃度為0.2%KMnO4溶液消毒過的椰糠+蛭石+細河沙按照3:5:1的比例做基質的營養杯中，澆足水，保持空氣濕度為85％-90%，溫度 25～26℃，避免陽光直射， 37天后，移出溫室進行全光照煉苗6d，及時澆水，然后移栽大田。
實施例3
一種金絲4號棗的組培快繁方法，包括以下步驟：
(1)外植體的建立：于3月初，剪取18cm長、當年生優質粗壯的根蘗條，用自來水沖洗10分鐘后，于質量濃度為0.4%洗衣粉溶液中浸泡13分鐘，再用自來水沖洗干凈，然后將洗凈后的根蘗條置于培養室中水培培養，每26小時換一
次水，培養溫度為27-28℃，光照時間19h/d，光照強度2000lx，培養至長出2～3cm的水培芽后，取出根蘗條，用質量濃度為75%的酒精浸泡35s，無菌水沖洗4次，瀝干水分，放到質量濃度為0.1%HgCL2溶液中浸泡消毒7分鐘，然后用無菌水沖洗7次，用鑷子夾取清洗好的莖段，放置在滅菌的接種碟上，用滅菌過的濾紙吸干表面水分，剪取水培芽作為外植體；
（2）啟動培養：將水培芽轉入經高溫滅菌的啟動培養基中（啟動培養基的成分為：MS+ N6芐基腺嘌呤（6-BA) 1.2mg/L +萘乙酸（NAA）0.25mg/L +3.5%糖蜜+瓊脂6g/L，培養基pH 值為6.0-6.3）誘導不定芽的萌發，培養條件為溫度 25～28℃ ,光照強度為2500lx，光照時間16h/d，在培養室中無菌培養，新芽萌發之后，將其轉接到分生培養基中培養，分生培養基的成分為：MS+ N6芐基腺嘌呤（6-BA) 2.2mg/L+萘乙酸（NAA）0.5mg/L +維生素C 1.8mg/L+谷氨酸1.7mg/L +3.5%糖蜜+瓊脂7g/L，培養基pH 值為6.0；在光照強度為2200lx，光照時間14h/d，溫度為27℃的條件下，培養45天；
（3）繼代培養：將植株莖段轉接入經消毒后的繼代培養基中培養中，繼代培養基的成分為：MS+ N6芐基腺嘌呤（6-BA) 2.2mg/L+萘乙酸（NAA）0.5mg/L +維生素C 0.9mg/L+維生素B2 1.5mg/L+谷氨酸2.0mg/L +3.5%糖蜜+瓊脂8g/L, 培養基pH 值為6.1；在培養溫度為25-26℃，光強25O0lx，光照時間為15h/d的條件下培養32d；
（4）生根培養：在無菌條件下，剪取長2-2.5cm繼代培養得到的帶葉莖段，插入生根培養基中進行生根培養；生根培養基的成分為：1/2MS+ NAA 0.05mg/L+ IAA0.15 mg/L+IBA1.0 mg/L+5%糖蜜+瓊脂8g/L, pH=6.0-6.2；培養溫度 26～28℃，光強20001x，光照時間14h/d；
（5）煉苗：當經過生根培養后的生根試管苗根長1.0～2.0 cm時，將組培苗進行室內煉苗，煉苗溫度為：27-28℃，光照強度為6000lx，室內瓶煉4天后，敞口煉苗7天；
（6）移栽：取出試管苗，洗凈根上的培養基，移栽到用質量濃度為0.2%KMnO4溶液消毒過的椰糠+蛭石+細河沙按照3:5:1的比例做基質的營養杯中，澆足水，保持空氣濕度為85％-90%，溫度 25～26℃，避免陽光直射，38天后，移出溫室進行全光照煉苗6d，及時澆水，然后移栽大田。
以下為本發明金絲4號棗的組培快繁方法得到的金絲4號棗組培苗的繁育結果：
種植地點：廣西來賓市象州縣（象州縣位于廣西北部，氣候冬天最低零下2度，夏天32度，丘陵山坡較多，適宜棗樹生長）。
由上表可以看出，本發明金絲4號棗的組培快繁方法，繁殖系數高，生根率達88%以上，營養杯移栽成活率在86%以上，大田移栽成活率在89%以上，組培苗移栽后能迅速適應露天環境，生長迅速，抗外界不良環境能力強。采用本發明的方法對金絲4號棗進行繁育，能有效、方便的在短時間內獲得大量金絲4號棗組培苗，而且苗木能夠保持優樹的優良遺傳性狀，適合大面積區域種植，帶動了當地的果樹生產。