本發(fā)明涉及植物抗逆生理學，具體涉及半野生棉萌發(fā)期對鈉鹽抗性鑒定方法。
背景技術：
：半野生棉(semi-wildcotton)是陸地棉野生種系，共7個：闊葉棉(latifolium)、帕默爾棉(palmeri)、瑪利加郎特棉(marie-galante)、雷奇蒙地棉(richmondi)、尤卡坦棉(yucatanese)、莫利爾棉(morrilli)和尖斑棉(punctatum)。半野生棉原產地主要在墨西哥，少量在巴西，其種類劃分依據(jù)主要是自然分布的地理位置和形態(tài)主體特征，每個種系又包含多個變異類型。半野生棉是陸地棉的原始類型，未經人工馴化過，由于其特殊的地理位置和多變的氣候條件，相較于經過人工和自然雙重選擇壓力的栽培品種，半野生棉具有豐富的遺傳多樣性，含有多種優(yōu)良基因，包括抗病蟲、耐干旱、耐鹽堿、纖維高強等，同時因為陸地棉野生種系與栽培品種在遺傳上具有親和性，容易雜交成功，因此具有極其重要的潛在應用價值。現(xiàn)如今關于棉花抗鹽性的研究大多集中栽培棉(cultivatedcotton)的抗鹽性的研究上，然而我國并不是棉花的起源地，對我國陸地棉栽培種的遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)育種資源多來自岱字棉等少數(shù)幾個陸地棉種質資源材料，從而導致很難擁有遺傳多樣性豐富的群體來進行抗鹽性篩選。同時現(xiàn)在栽培棉NaCl萌發(fā)期抗性的研究上大田中多采用0.5％NaCl溶液、0.4％地下咸水溶液或者直接用海水進行脅迫，實驗室中的栽培棉鑒定時150mMNaCl為適宜鹽脅迫濃度、200mMNaCl為極限濃度，存在有脅迫濃度低、脅迫成分不確切等，不足以鑒定具有抗性多樣性的半野生棉材料，而且進行鹽池鑒定則存在鹽分分布不均勻、受環(huán)境影響大、鑒定周期長(45天左右)等缺點，造成實驗結果重復性差。因此，探索一種適合半野生棉萌發(fā)期抗鹽性的方法以迅速準確的篩選出高抗鹽的半野生棉材料，可以加快栽培棉的抗鹽性遺傳改良，具有實踐利用價值和意義。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供半野生棉萌發(fā)期鈉鹽抗性鑒定方法，用來彌補針對半野生棉材料抗鹽性鑒定時方法的不足，以期能夠快速準確的對棉花半野生種質資源的進行客觀鑒定，為棉花抗鹽性遺傳改良提供依據(jù)。根據(jù)本發(fā)明的半野生棉萌發(fā)期鈉鹽抗性鑒定方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：1)對半野生棉種子進行均一化處理：首先是對選定的半野生棉材料進行濃硫酸脫絨，清水沖洗干凈之后，次氯酸鈉消毒，然后置40烘箱中加熱干燥24h以打破種子休眠，在種子珠孔端切剝一小口，露出種仁即可。由于半野生棉材料的收集與保藏不易，針對不同年份的半野生棉材料，采用此種方法處理之后的半野生棉材料種子可以保持在萌發(fā)前的狀態(tài)是一致的，避免了因為某些材料自身特異性對萌發(fā)狀態(tài)造成的影響，實驗中出現(xiàn)過此類情況如尖斑棉6，在未進行切剝處理時，發(fā)芽率幾乎為零，處理后發(fā)芽率達到了90％以上；2)制備鹽脅迫基質：采用粒徑為0.05-0.80mm的沙子，清水洗凈后高溫滅菌，以100g沙子：16ml鹽液的比例加入鹽濃度250mM的NaCl溶液，混勻后做為發(fā)芽基質。這樣可以固定沙床含水量為恒定16％。此種方法選用的為250mMNaCl濃度，高于栽培棉鑒定鹽濃度，是專門針對半野生棉的抗性多樣性進行的設計，可以準確鑒定出高抗鹽性的半野生棉材料，在之前的實驗中發(fā)現(xiàn)用200mM的鹽作為脅迫濃度，半野生棉材料會出現(xiàn)多個材料鹽害率極低且極為接近的現(xiàn)象；3)播種并培育棉苗：采用12cm*19cm*13cm發(fā)芽盒，把步驟2)基質放入發(fā)芽盒中，把種子均勻放入發(fā)芽盒中后，再覆上一層基質即可，置于溫度28℃，濕度85％，光照12h，黑暗12h的條件下，發(fā)芽并培養(yǎng)14d。此種方法可以保持每個材料在發(fā)芽盒中的狀態(tài)的一致性，杜絕了因為外界環(huán)境變化所引起的鑒定錯誤的發(fā)生；4)統(tǒng)計與結果分析：待生長至14d時，統(tǒng)計發(fā)芽數(shù)，調查每一株棉苗的鹽害情況，并評價每株棉苗的鹽害指數(shù)，評價半野生棉材料的抗性水平。本發(fā)明為半野生棉萌發(fā)期抗鹽性鑒定方法，具有以下優(yōu)點：1、半野生棉材料萌發(fā)狀態(tài)一致：通過均一化處理之后的半野生材料可以達到初始萌發(fā)狀態(tài)的一致性，有利于棉花出苗整齊一致，而且材料和沙子經過前期滅菌處理，避免了細菌的干擾，實驗中對照材料出苗均勻一致，根系發(fā)育完整，萌發(fā)期一致，保證了鑒定的準確性。2、專門為半野生棉材料選定的適合半野生棉抗性多態(tài)性的鹽濃度250mM，相較于大田栽培種鑒定用0.4％的鹽分和溫室栽培種鑒定200mMNaCl高了很多，適合具有抗性多樣性的半野生棉材料鑒定。3、該方法不受季節(jié)控制，鑒定周期短，可短時間鑒定半野生棉材料的抗鹽性。半野生棉萌發(fā)期抗鹽性鑒定方法，鑒定周期為14d，播種后第14d統(tǒng)計發(fā)芽率，統(tǒng)計每株棉苗的生長狀況進行評分。較大田鹽池鑒定(45d左右)縮短30d，可快速進行半野生棉材料萌發(fā)期抗鹽性篩選，為加速抗逆育種提供技術支持。4、投入的人力物力小，省工又經濟。半野生棉萌發(fā)期抗鹽性鑒定方法，可以在溫室之內進行鑒定，使用商品河沙、分析純試劑和種子發(fā)芽盒，而且都是經過高溫消毒，省去大量的人力和物力的投入，可進行大批量材料的鑒定；易于推廣和利用。具體實施方式實施例1采用萌發(fā)期單鹽NaCl脅迫處理，對半野生棉(闊葉棉40、闊葉棉27、尖斑棉25、闊葉棉32、闊葉棉120、瑪麗加朗特棉85)以及栽培棉(中棉所12、中棉所16、鄂荊1號、海7124)的抗鹽水平進行鑒定和評價。1、棉花材料：半野生棉(闊葉棉40、闊葉棉27、尖斑棉25、闊葉棉32、闊葉棉120、瑪麗加朗特棉85)，栽培種鄂荊1號，海7124，栽培棉敏鹽對照材料中棉所12、栽培棉耐鹽對照材料中棉所16。2、半野生棉種子進行均一化處理：對選定的半野生棉材料進行濃硫酸脫絨，洗凈晾干后，再用NaClO消毒處理種子，洗凈晾干后，置40℃烘箱24h打破種子休眠，選擇籽粒飽滿成熟的種子，用單面刀片在種子合點端(鈍端)切小口，大小1mm×1mm，種殼切破露出種仁即可。3、制備鹽脅迫基質：選擇直徑為0.05-0.80mm的沙子，清水洗滌至不渾濁，晾干后180℃，2h高溫滅菌；稱量試驗所需的沙子重量，按照質量比100g沙子：16ml水的比例計算所需水量，按照用水量進行計算所需鹽分，進而用無菌水配制250mM的NaCl鹽溶液，把配制好的鹽溶液加入到稱量好的沙子中，混勻后作為鹽脅迫培養(yǎng)基質；對照基質按照質量比16％(水/干沙子)加入無菌水，混勻作為對照培養(yǎng)基質；4、播種并培育棉苗：首先在發(fā)芽盒下層鋪合適厚度的沙子約10-15mm，種子均勻播在濕沙上，加蓋10-15mm濕沙，每盒播種6行，每行5粒，每兩行一個材料(或重復)，蓋上蓋子，置于溫度28℃，濕度85％，光照12h，黑暗12h的條件下，培養(yǎng)14d；按同樣的方法設置對照組。5、統(tǒng)計與結果分析：播種后14d統(tǒng)計每一個半野生棉材料的出苗率以及針對每一株棉苗進行評分。對每一株棉苗進行客觀分級評分是實驗的關鍵。根據(jù)出苗率和評分結果對半野生棉抗性進行評價。根據(jù)標準進行傷害評分：然后計算材料的相對鹽害率。0分-未萌發(fā)種子；1分-株高為對照的50％以下，種子剛破土、未破殼；2分-株高為對照的50％～70％，子葉邊緣卷曲；3分-株高為對照的70％～100％，子葉卷曲、發(fā)黃；4分-株高與對照處理相當，棉苗正常生長，子葉展開。相對鹽害率計算公式為：得分率＝∑fx/(4n)，f為該級別的株數(shù)，x為相應級別的分值，n為播種數(shù)。結果見表2:表1萌發(fā)期耐鹽性分級標準級別相對鹽害率(％)耐鹽性10.0～20.0高耐220.1～40.0耐340.1～60.0中耐460.1～80.0中敏580.1～100.0敏感表2：半野生棉抗鹽性水平評價結果當前第1頁1 2 3