本發明涉及轉基因作物安全評價領域，具體涉及一種評價物理隔離措施對轉基因棉花基因漂移頻率影響的方法及其所用溫室。

背景技術：

隨著對轉基因生物環境安全評價工作的深入開展，基因漂移所帶來的生物安全問題也研究的愈加深入，尤其是轉基因作物商品化種植以后，相應的農田生態系統也確實由于基因漂移發生了一定的變化。雖然基因漂移對生態環境的影響后果較為嚴重，但是由于基因漂移具有相對保守性，因此其對環境的影響是在可以控制的范圍內的。根據基因漂移發生的途徑，基因漂移的發生受到以下因素的影響：轉基因作物與接受種雜交的親和性、轉基因作物的花粉傳播、轉基因作物雜交后代的可育性及繁殖能力，同時，通過花粉傳播產生基因漂移是自然界基因漂移發生的主要途徑，因此，對基因漂移的防控主要通過控制花粉傳播得以實現。

對花粉傳播的控制主要包括物理隔離、雄性不育等手段。第一，物理隔離。主要包括距離隔離、轉基因作物去雄、調整播種時間實現花期不遇、種植非轉基因植物隔離帶以及應用近緣種雜交不親和的優良品種等防控措施。第二，雄性不育基因工程育種技術。目前，該手段已經在煙草中實現技術水平上的證實，且相關成果已進入商業化生產階段。第三，應用母系遺傳法(又稱細胞質遺傳法)。其原理為：葉綠體或線粒體遺傳轉化是除細胞核轉化外另一種最具潛力的轉化方式，而絕大多數植物葉綠體遺傳方式為母系遺傳，不通過花粉傳遞，因此可以避免外源基因通過花粉擴散到其他作物或雜草中。目前，該方法已經在煙草和西紅柿中得到驗證和應用。第四，種子不育法。主要通過阻止異交或種子落粒引起的外源基因擴散，從而實現對基因漂移的防控。第五，染色體組特異性選擇法。利用染色體不親和法，實現在授粉后阻止DNA重組。第六，轉基因遺傳調控。指利用遺傳工程技術調控轉基因作物對雜草的選擇。

技術實現要素：

針對傳統的研究基因漂移的方法存在的缺點，本發明提供一種評價物理隔離措施對轉基因棉花基因漂移頻率影響的方法及其所用溫室。

一種評價物理隔離措施對轉基因棉花基因漂移頻率影響的方法，包括如下步驟：

1)沿溫室長邊方向順序設置轉基因棉花區，隔離區和常規棉區；隔離區和常規棉區沿溫室短邊方向劃分為N條，將其中一條的隔離區作為空白帶，其余條的隔離區作為隔離帶，隔離帶以待測的物理隔離措施進行隔離；

2)開花期從轉基因棉花區面向常規棉區送風，此外保持常規棉區和轉基因棉區種植密度、植株生長階段、光照、溫度、濕度等環境因素的統一；

3)開花期結束后，沿轉基因棉花區至常規棉區的線性方向，在每條常規棉區中等距離取F₁代樣本檢測是否存在外源基因，確定不同隔離方式對基因漂移頻率、距離的影響。

其中，所述送風，時間為每天6:00am至18:00pm。

一種評價物理隔離措施對轉基因棉花基因漂移頻率影響的方法，還包括開花期保持常規棉區空氣流通。時間為每天6:00am至18:00pm。

其中，所述F₁代樣本指F₁代種子。

其中，所述空白帶為不采用任何物理隔離措施。

其中，所述待測的物理隔離措施為一種或多種；優選多種，在各隔離帶分別設置待測的各種物理隔離措施，便于相互比較。

其中，所述物理隔離措施為設置隔離網和/或設置作物隔離帶。

其中，所述隔離網的規格為90目、80目、60目或40目孔徑。

其中，所述作物隔離帶種植玉米、番茄、高粱或常規棉。

本發明還提供用于評價物理隔離措施對轉基因棉花基因漂移頻率影響效果的溫室，其為沿溫室長邊方向順序設置轉基因棉花區，隔離區和常規棉區；隔離區和常規棉區沿溫室短邊方向劃分為N條，將其中一條的隔離區作為空白帶，其余條的隔離區作為隔離帶，隔離帶以待測的物理隔離措施進行隔離；所述轉基因棉花區，設置有面向常規棉區送風的裝置，N≥2。

其中，所述送風的裝置，優選為落地風扇。

其中，所述常規棉區，上方設置空氣流通裝置，優選為吊扇。

其中，所述轉基因棉花區沿溫室長邊方向的寬度為4-5米，優選4.5米。

其中，所述作為隔離區沿溫室長邊方向的寬度為3-4米，優選3.5米。

其中，所述常規棉區沿溫室長邊方向的寬度為30-40米，優選35米。

使用本發明的溫室，能精確比較幾種物理隔離措施對轉基因作物基因漂移效果的影響，明確物理隔離措施影響基因漂移的評價方法，得出基因漂移的距離。

附圖說明

圖1：本發明的溫室內布局示意圖。

圖2：本發明實施例1、實施例2的部分溫室內布局示意圖。

圖3：本發明實施例1作物隔離帶對基因漂移影響的柱狀圖。

圖4：本發明實施例2作物隔離帶對基因漂移影響的柱狀圖。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。

實施例1不同隔離網對基因漂移的影響

1)棉花的種植

在北京市中國農業大學上莊試驗站(40°08'22.92"N,116°12'16.98"E)溫室(60m×8m)中進行。如圖2所示，溫室內沿長邊方向順序設置轉基因棉花區，隔離區和常規棉區；隔離區和常規棉區沿溫室短邊方向劃分為5條，將其中一條的隔離區作為空白帶(不設置隔離網，也不種植任何作物)，其余4條的隔離區作為隔離帶，4個隔離帶分別設置90目、80目、60目、40目孔徑隔離網(A、B、C、D分別表示90目、80目、60目、40目孔徑隔離網四個處理)；按照株距為0.4m，行距為0.8m對應種植常規棉和轉基因棉，具體見圖2(部分，僅顯示了2個處理)。由于溫室內部封閉無風，不利于實驗開展，為溫室內處理區持久送風，在抗蟲抗除草劑轉基因棉區設置一臺落地風扇(FS40-8A2型，廣東美的環境電器制造公司)，直徑約為0.5m，高度約為1.5m，面向常規棉區送風助轉基因棉花花粉飄散。在常規棉區上方的溫室骨架上設若干送風距離約為5m的吊扇(FB40-1205型，上海華生電器有限公司)，按沿溫室長邊方向每5米一臺的密度設置，吊扇直徑約0.5m，距地面約2m。鑒于棉花只在白天開花散粉，風扇工作時間為每天6:00am至18:00pm。除人工設置風力因素外，保持常規棉區和轉基因棉區種植密度、植株生長階段、光照、溫度、濕度等環境因素的統一。

2)收獲常規棉的種子

常規棉吐絮后，對其F₁代種子進行采集。在常規棉區中等距離取F₁代樣本，方向為沿轉基因棉花區至常規棉區的線性方向，于各常規棉區的第1、2、4、8、16、24、32行(即以常規棉區與隔離區相鄰處記為0m，在0.8m、1.6m、3.2m、6.4m、12.8m、19.2m、25.6m)進行取樣。有研究表明轉基因棉花的異交率與所采種子在其植株上的上、中、下部位置基本不存在相關性(Umbeck et al.,1991)。因此，每個距離分別從常規棉的上、中、下部摘取棉桃取樣，作為三次重復。

3)室內評價

溫室采集的非轉基因F₁代種子放入棉花軋花機中脫去棉絮，用于分子生物學評價和蛋白測定。主要包括種子處理、樣品DNA提取和PCR評價、PCR陽性結果的蛋白評價幾大方面。

4)結果分析

具體結果見圖3，將空白帶作為對照，針對同種孔徑隔離網在不同距離上的基因漂移頻率進行比較可以看出，在常規棉種植區，90目孔徑隔離網只在常規棉第4、32行兩個距離上發生了基因漂移，最遠達到第32行，且漂移高峰出現在第4行，除第4行漂移高峰外其余各行基因漂移頻率之間沒有顯著差異；80目孔徑隔離網只在常規棉第4、8、32行三個距離上發生了基因漂移，最遠達到第32行，且漂移高峰出現在第4行，除第4行漂移高峰和第8行漂移次高峰外其余各行基因漂移頻率之間沒有顯著差異；60目孔徑隔離網在常規棉第2、4、8、16、32行五個距離上發生了基因漂移，最遠達到第32行，除第4行漂移高峰和第16行漂移次高峰外其余各行基因漂移頻率之間沒有顯著差異，且漂移高峰出現在第4行；40目孔徑隔離網在常規棉第1、4、8、16、32行五個距離上發生了基因漂移，最遠達到第32行，漂移高峰出現在第4行，且發生基因漂移的這五個距離中有四個的漂移率較高，其中第16、32行與漂移高峰第4行的基因漂移頻率沒有顯著差異。可見90目、80目、60目、40目孔徑隔離網的基因漂移最遠距離都達到了第32行，且四個處理的漂移高峰都出現在第4行。90、80、60、40目隔離網對應的出現基因漂移的距離數量分別為2、3、5、5個。基因漂移的頻率隨距離增加總體呈下降趨勢。其中90目隔離網隔離效果最好。

實例2作物隔離帶對基因漂移的影響

1)棉花的種植

分別在北京市中國農業大學上莊試驗站(40°08'22.92"N,116°12'16.98"E)兩個溫室(各60m×8m)中，按照圖2，溫室內沿長邊方向順序設置轉基因棉花區，隔離區和常規棉區；隔離區和常規棉區沿溫室短邊方向劃分為5條，將其中一條的隔離區作為空白帶，其余4條的隔離區作為隔離帶，4個隔離帶分別玉米、番茄、高粱、空白四個作物隔離處理；按株距為0.4m，行距為0.8m在對應區域種植常規棉和轉基因棉，隔離作物的株距為0.4m，行距為0.8m，種植寬度為3.5米。由于溫室內部封閉無風，不利于實驗開展，為溫室內處理區持久送風，在抗蟲抗除草劑轉基因棉區設置一臺落地風扇(FS40-8A2型，廣東美的環境電器制造公司)，直徑約為0.5m，高度約為1.5m，面向常規棉區送風助轉基因棉花花粉飄散。在常規棉區上方的溫室骨架上設若干送風距離約為5m的吊扇(FB40-1205型，上海華生電器有限公司)，按沿溫室長邊方向每5米一臺的密度設置，吊扇直徑約0.5m，距地面約2m。鑒于棉花只在白天開花散粉，風扇工作時間為每天6:00am至18:00pm。除人工設置風力因素外，保持常規棉區和轉基因棉區種植密度、植株生長階段、光照、溫度、濕度等環境因素的統一。

2)收獲常規棉的種子

常規棉吐絮后，對其F₁代種子進行采集。在常規棉區中等距離取F₁代樣本，方向為沿轉基因棉花區至常規棉區的線性方向，于各常規棉區的第1、2、4、8、16、24、32行(即以常規棉區與隔離區相鄰處記為0m，在0.8m、1.6m、3.2m、6.4m、12.8m、19.2m、25.6m)進行取樣。有研究表明轉基因棉花的異交率與所采種子在其植株上的上、中、下部位置基本不存在相關性(Umbeck et al.,1991)。因此，每個距離分別從常規棉上、中、下部摘取棉桃取樣，作為三次重復。

3)室內評價

溫室采集的非轉基因F₁代種子放入棉花軋花機中脫去棉絮，用于分子生物學評價和蛋白測定。主要包括種子處理、樣品DNA提取和PCR評價、PCR陽性結果的蛋白評價幾大方面。

4)結果分析

結果見圖4，兩個溫室的結果相同，四個作物隔離帶處理之間在第1、2、8、16、24行的基因漂移頻率存在顯著差異，在第1、2行，空白隔離帶處理的基因漂移頻率顯著高于玉米、高粱隔離帶，番茄隔離帶處理的基因漂移頻率顯著高于高粱隔離帶，玉米隔離帶處理的基因漂移頻率與高粱處理之間沒有顯著差異；在第8行，空白隔離帶和玉米隔離帶處理的基因漂移頻率顯著高于高粱隔離帶，番茄隔離帶處理的基因漂移頻率與其余各處理之間沒有顯著差異；在第16、24行，三種作物隔離帶處理的基因漂移頻率都顯著低于空白隔離帶。在多數距離上，作物隔離帶相較于空白隔離都能使基因漂移頻率顯著下降。其中高粱隔離帶的基因漂移頻率相較于空白有5個距離存在顯著下降，玉米有4個，番茄有2個，且高粱隔離帶的基因漂移頻率不僅相較于空白隔離帶顯著下降位點最多，其基因漂移頻率在各個存在顯著差異的距離上都是最低的，雖然高粱隔離帶在常規棉第4行的基因漂移頻率高于玉米和番茄隔離帶處理但各處理之間在該位點不存在顯著差異。玉米和番茄隔離帶處理都將基因漂移的發生阻止在了第24行，相較于空白隔離帶的32行有所減少，這兩種作物隔離帶在各個距離上的基因漂移頻率都要小于空白隔離帶，并隨距離的增加其漂移頻率呈下降趨勢，可見玉米和番茄隔離帶對防止基因漂移存在一定的作用。所以在三種作物隔離帶中，高粱隔離帶的效果最好且明顯優于玉米和番茄隔離帶，能將基因漂移控制在非常小的范圍內；玉米隔離帶對基因漂移的控制效果有限，番茄隔離帶的效果最差。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。