本發明屬于生物領域，具體涉及一種三七紫色素三七愈傷組織的繼代培養方法。
背景技術：
：三七為五加科人參屬植物，有“金不換”、“南國神草”、“參中之王”等美譽，是云南特有的名貴中藥材，也是我國中醫藥中一顆璀璨的明珠。三七紫色素為一種存在于三七植株莖、葉、花及根的細胞液中的化合物，使植株呈現出紅、紫紅、蘭等不同顏色。三七紫色素的本質為花色苷，花色苷是類黃酮--以黃酮核為基礎的一類物質中能呈現紅色的一族化合物。由于它具有獨特的功能性，而被應用于清除體內自由基、增殖葉黃素、抗腫瘤、抗癌、抗炎、抑制脂質過氧化和血小板凝集、預防糖尿病、減肥、保護視力等。花色苷作為一種天然色素，安全、無毒，且對人體具有許多保健功能，已被應用于食品、保健品、化妝品、醫藥等行業。然而，目前并無關于三七紫色素的利用與開發的相關文獻及報道。技術實現要素：本發明的目的是根據提供一種通過組織培養手段培養出富含紫色素的三七愈傷組織，為大量提取其中的花色苷奠定了基礎。本發明提供的技術方案：一種三七紫色素愈傷組織的繼代培養方法，在無菌環境中將三七愈傷組織進行接種及繼代培養，得到三七紫色素愈傷組織；所述繼代培養的培養基為MS+0.1～2mg/LNAA+0.1～2mg/LBA+0.002～4mg/LTDZ，(即在每一升的MS培養基中添加0.1～2mgNAA、0.1～2mgBA和0.002～1mgTDZ)。所述MS為MS培養基，NAA為萘乙酸，BA為芐氨基腺嘌呤，TDZ為噻苯隆。優選的，所述繼代培養的光照控制為10～15小時光照、10～15小時黑暗，交替進行，優選的，所述繼代培養的光照控制為12小時光照、12小時黑暗，交替進行。優選的，所述的光照控制的光強度為1000—1500lx。優選的，所述的繼代培養的溫度為22℃—25℃；優選的，所述的繼代培養的空氣相對濕度：50—80％。優選的，所述的接種方法為：在無菌環境中將三七愈傷組織分割成0.5mm2的方型小塊，接種于培養基中。優選的，所述三七愈傷組織為生長至直徑1-2cm的愈傷組織。優選的，所述的誘導培養的周期為4～5周。本發明的有益效果：愈傷組織在培養基上生長一段時間以后，由于營養物質枯竭，水分散失，以及代謝產物的積累，必須轉移到新鮮培養基上培養。通過繼代培養，可使愈傷組織無限期地保存持在不分化的增殖狀態。本發明通過對光照時間、培養基、濕度、溫度等條件控制，培養出富含紫色素、增殖率高的愈傷組織。本發明通過光照的控制有效的提高了三七紫色素的含量，并在培養基中加入TDZ及與其他植物激素的搭配，使三七愈傷組織的誘導率明顯提高，并有利于紫色素的形成。本發明利用組織培養繁殖效率高、生長周期短的優點，建立適合三七紫色素愈傷組織生長的組培條件，從而提供大量的優質的富含紫色素的愈傷組織，為從三七愈傷組織中提取紫色素提供物質基礎，有利于自動化、規模化生產,提高生產效率。具體實施方式實施例1一種三七紫色素愈傷組織的繼代培養方法，包括以下步驟：選取生長至直徑1cm的三七愈傷組織，在無菌環境中將三七愈傷組織分割成0.5mm2的方型小塊，在無菌的條件下，在酒精燈火焰附近打開組培瓶，瓶口在火焰上灼燒一下，將切好的愈傷組織接種到繼代培養基上，其中，繼代培養的培養基為MS+0.1mg/LNAA+0.1mg/LBA+0.002mg/LTDZ，培養4周。其中，光照控制為10小時光照、10小時黑暗，交替進行，光照控制的光強度為1000lx。繼代培養的溫度為22℃；空氣相對濕度：50％。實施例2一種三七紫色素愈傷組織的繼代培養方法，包括以下步驟：選取生長至直徑1-2cm的三七愈傷組織，在無菌環境中將三七愈傷組織分割成0.5mm2的方型小塊，在無菌的條件下，在酒精燈火焰附近打開組培瓶，瓶口在火焰上灼燒一下，將切好的愈傷組織接種到繼代培養基上。其中，繼代培養的培養基為MS+2mg/LNAA+2mg/LBA+4mg/LTDZ，培養5周。其中，光照控制為15小時光照、15小時黑暗，交替進行，光照控制的光強度為1500lx。繼代培養的溫度為25℃；空氣相對濕度：80％。實施例3一種三七紫色素愈傷組織的繼代培養方法，包括以下步驟：選取生長至直徑2cm的三七愈傷組織，在無菌環境中將三七愈傷組織分割成0.5mm2方型小塊，在無菌的條件下，在酒精燈火焰附近打開組培瓶，瓶口在火焰上灼燒一下，將切好的愈傷組織接種到繼代培養基上，其中，繼代培養的培養基為MS+1mg/LNAA+1.2mg/LBA+0.08mg/LTDZ，培養4周。其中，光照控制為12小時光照、12小時黑暗，交替進行，光照控制的光強度為1200lx。繼代培養的溫度為23℃；空氣相對濕度：60％。不同植物激素對三七愈傷組織的繼代培養增殖率及紫色素含量的影響試驗：選取3組相同的三七愈傷組織進行繼代培養，在無菌環境中將三七愈傷組織分割成0.5mm2的方型小塊，在無菌的條件下，在酒精燈火焰附近打開組培瓶，瓶口在火焰上灼燒一下，分別將切好的愈傷組織接種到3組不同的繼代培養基上。其中，繼代培養基分別為：(1)MS+0.1mg/LTDZ、(2)MS+0.1mg/LNAA+0.1mg/LBA及(3)MS+0.1mg/LNAA+0.1mg/LBA+0.1mg/LTDZ。在相同的環境下進行培養，其中光照控制為12小時光照條件和12小時黑暗條件交替進行,光照強度為1000lx；溫度：25℃；空氣相對濕度：80％；培養5周后對其增殖率及紫色素的含量進行測試。表1，不同植物激素對三七愈傷組織的繼代培養的增殖率及紫色素含量編號NAABATDZ增殖率紫色素含量1000.112％8％20.10.1042％1％30.10.10.172％19％從表1的結果可以看出，TDZ的添加能明顯有利于三七的愈傷組織的繼代培養，能明顯提高愈傷組織的增殖率及愈傷組織中紫色素的含量，獲得高增殖率及紫色素含量高的愈傷組織。TDZ與NAA和BA的協同作用有利于愈傷組織的增殖與生長，及紫色素的產生。不同光照條件對愈傷組織的繼代培養的增殖率及紫色素含量的影響試驗：選取6組相同的三七愈傷組織進行繼代培養，在無菌環境中將三七愈傷組織分割成0.5mm2的方型小塊，在無菌的條件下，在酒精燈火焰附近打開組培瓶，瓶口在火焰上灼燒一下，將切好的愈傷組織接種到MS+0.1mg/LNAA+0.1mg/LBA+0.1mg/LTDZ的繼代培養基上。對其進行不同的光照處理，分別為(1)5小時光照條件和5小時黑暗條件交替進行,(2)10小時光照條件和10小時黑暗條件交替進行,(3)12小時光照條件和12小時黑暗條件交替進行,(4)15小時光照條件和15小時黑暗條件交替進行,(5)20小時光照條件和20小時黑暗條件交替進行,(6)30小時光照條件和30小時黑暗條件交替進行。6組的光照強度為1000lx；溫度：25℃；空氣相對濕度：80％；培養5周后對其增殖率及紫色素的含量進行測試。表2，不同光照條件對三七愈傷組織的繼代培養的增殖率及紫色素含量光照交替時間51012152030增殖率36％48％70％62％36％30％紫色素含量8％18％19％13％5％3％從表2的結果可以看出，使用光照與黑暗交替的光照條件與三七愈傷組織中紫色素的形成有影響，其中12小時光照條件和12小時黑暗條件最有利于紫色素的形成，紫色素的含量最高，同時還提高了三七愈傷組織繼代培養的增殖率。不同光照強度對愈傷組織的繼代培養的增殖率及紫色素含量的影響試驗：選取5組相同的三七愈傷組織進行繼代培養，在無菌環境中將三七愈傷組織分割成0.5mm2的方型小塊，在無菌的條件下，在酒精燈火焰附近打開組培瓶，瓶口在火焰上灼燒一下，將切好的愈傷組織接種到MS+0.1mg/LNAA+0.1mg/LBA+0.1mg/LTDZ的繼代培養基上。其中，5組的光照強度分別為800lx，1000lx，1500lx，2000lx，2500lx；培養5周后對其增殖率及紫色素的含量進行測試。表3，不同光照強度對三七愈傷組織的繼代培養的增殖率及紫色素含量光照強度80010001500200025003000增殖率52％70％72％42％32％12％紫色素含量3％18％19％5％2％0.5％從表3的結果可以看出，不同光照強度與三七愈傷組織中紫色素的形成有明顯的影響，其中1000lx～1500lx的光照強度最有利于紫色素的形成，紫色素的含量最高，同時還提高了三七愈傷組織繼代培養的增殖率。當前第1頁1 2 3