本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種促進月季種子無菌萌發的方法。
背景技術：
月季(Rosa chinensis)是薔薇科薔薇屬的植物，原產于中國，其用途廣泛，有“花中皇后”、“花中女王”的美譽。月季是我國十大名花之一，是當今世界四大鮮切花之一。種子繁殖是月季進行育種的關鍵環節之一，但薔薇屬植物的種子都具有休眠的特性，萌發困難，自然發芽率極低，常規方法發芽率通常低于10％，且發芽時間長，整齊度差。因此，打破種子休眠是種子萌發的根本前提。月季種子必須經歷一定時間的低溫層積才能解除休眠。
目前，低溫層積的傳統做法是：利用冬季低溫條件，將種子埋藏在沙子中，經過一段時間后，即可使種子萌發。這種打破種子休眠的方法將時間限制在冬天，具有一定的局限性，一定程度上限制了月季育種的工作進程。尤其是在進行月季的遠緣雜交育種中，利用胚挽救技術獲得月季組培植株的方法需要經歷的時間更長。若能夠人為控制層積的溫度，將低溫層積與無菌技術相結合，則可有效快速地獲得月季的無菌組培苗，有利于縮短月季遠緣雜交育種的進程。目前尚未有將低溫層積與無菌相結合的技術方法應用于月季種子的無菌萌發上。
技術實現要素：
針對現有技術的不足之處，本發明提供一種促進月季種子無菌萌發的方法，從而可以達到提高月季種子的發芽率。
為了實現上述發明目的，本發明采用以下技術方案：
一種促進月季種子無菌萌發的方法，包括如下步驟：
(1)河沙的無菌處理：將濕潤的河沙裝入組培瓶中，沙子體積為組培瓶容積的1/2，然后采用高壓蒸汽消毒，在壓力為0.1013Mpa、溫度為121℃的條件下進行消毒，消毒時間為25-30min，滅菌后使其自然冷卻，備用；
(2)無菌水的制備：在組培瓶中裝入70-80mL的自來水，然后采用高壓蒸汽消毒，在壓力為0.1013mPa、溫度為121℃的條件下進行消毒，消毒時間為25-30min，得到無菌水；
(3)種子的無菌處理：滅菌前，先將月季種子倒入盛有清水的容器中，并分攪拌，撈出漂浮在水面的癟種子和雜質，然后在自來水中浸泡24h，浸泡完成后即可進行滅菌處理：先將月季種子先用0.1-0.5％洗衣粉溶液中浸泡30min后，然后在流水下沖洗30min，再轉入超凈工作臺上，用75％乙醇浸泡種子20-30s，無菌水沖洗3次；再用0.1％升汞溶液浸泡種子12-15min，此操作過程中輕輕震蕩月季種子，使升汞溶液很好地接觸種子，最后無菌水沖洗3次，得到無菌月季種子；
(4)種子的預處理：將無菌月季種子用濃度為200-250mg/L的無菌GA3溶液浸泡24h，備用；
(5)無菌低溫層積：在超凈工作臺上，將經過無菌處理的月季種子埋入經高溫滅菌的沙子中，并在沙子中加入無菌水使其保持濕潤，種子播種完畢，將裝有沙子的組培瓶置于冰箱的冷藏室進行冷藏40-60d；待冷藏結束后，將組培瓶移入培養室進行常溫遮光培養10-15d，待遮光培養結束后統計出芽率。
作為優選，步驟(1)中所述的組培瓶規格為240mL，直徑68mm，口徑62mm，高90mm。
作為優選，步驟(5)中冷藏室的溫度設定為4-7℃。
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：
本發明的促進月季種子無菌萌發的方法將低溫層積與無菌相結合的技術方法應用于月季種子的無菌萌發上，可顯著提高月季種子的出芽率，出芽時間短，可有效快速地獲得月季的無菌組培苗，有利于縮短月季遠緣雜交育種的進程。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神和本質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。
實施例1：
一種促進月季種子無菌萌發的方法，包括如下步驟：
(1)河沙的無菌處理：將濕潤的河沙裝入組培瓶中，沙子體積為組培瓶容積的1/2，然后采用高壓蒸汽消毒，在壓力為0.1013Mpa、溫度為121℃的條件下進行消毒，消毒時間為30min，滅菌后使其自然冷卻，備用；所述的組培瓶規格為240mL，直徑68mm，口徑62mm，高90mm；
(2)無菌水的制備：在組培瓶中裝入80mL的自來水，然后采用高壓蒸汽消毒，在壓力為0.1013mPa、溫度為121℃的條件下進行消毒，消毒時間為30min，得到無菌水；
(3)種子的無菌處理：滅菌前，先將月季種子倒入盛有清水的容器中，并分攪拌，撈出漂浮在水面的癟種子和雜質，然后在自來水中浸泡24h，浸泡完成后即可進行滅菌處理：先將月季種子先用0.5％洗衣粉溶液中浸泡30min后，然后在流水下沖洗30min，再轉入超凈工作臺上，用75％乙醇浸泡種子30s，無菌水沖洗3次；再用0.1％升汞溶液浸泡種子15min，此操作過程中輕輕震蕩月季種子，使升汞溶液很好地接觸種子，最后無菌水沖洗3次，得到無菌月季種子；
(4)種子的預處理：將無菌月季種子用濃度為250mg/L的無菌GA3溶液浸泡24h，備用；
(5)無菌低溫層積：在超凈工作臺上，將經過無菌處理的月季種子埋入經高溫滅菌的沙子中，并在沙子中加入無菌水使其保持濕潤，種子播種完畢，將裝有沙子的組培瓶置于冰箱的冷藏室進行冷藏60d；待冷藏結束后，將組培瓶移入培養室進行常溫遮光培養15d，待遮光培養結束后統計出芽率；冷藏室的溫度設定為7℃。
實施例2：
一種促進月季種子無菌萌發的方法，包括如下步驟：
(1)河沙的無菌處理：將濕潤的河沙裝入組培瓶中，沙子體積為組培瓶容積的1/2，然后采用高壓蒸汽消毒，在壓力為0.1013Mpa、溫度為121℃的條件下進行消毒，消毒時間為25min，滅菌后使其自然冷卻，備用；所述的組培瓶規格為240mL，直徑68mm，口徑62mm，高90mm；
(2)無菌水的制備：在組培瓶中裝入70mL的自來水，然后采用高壓蒸汽消毒，在壓力為0.1013mPa、溫度為121℃的條件下進行消毒，消毒時間為25-30min，得到無菌水；
(3)種子的無菌處理：滅菌前，先將月季種子倒入盛有清水的容器中，并分攪拌，撈出漂浮在水面的癟種子和雜質，然后在自來水中浸泡24h，浸泡完成后即可進行滅菌處理：先將月季種子先用0.1％洗衣粉溶液中浸泡30min后，然后在流水下沖洗30min，再轉入超凈工作臺上，用75％乙醇浸泡種子20s，無菌水沖洗3次；再用0.1％升汞溶液浸泡種子12min，此操作過程中輕輕震蕩月季種子，使升汞溶液很好地接觸種子，最后無菌水沖洗3次，得到無菌月季種子；
(4)種子的預處理：將無菌月季種子用濃度為200mg/L的無菌GA3溶液浸泡24h，備用；
(5)無菌低溫層積：在超凈工作臺上，將經過無菌處理的月季種子埋入經高溫滅菌的沙子中，并在沙子中加入無菌水使其保持濕潤，種子播種完畢，將裝有沙子的組培瓶置于冰箱的冷藏室進行冷藏40d；待冷藏結束后，將組培瓶移入培養室進行常溫遮光培養10d，待遮光培養結束后統計出芽率；冷藏室的溫度設定為4℃。
實施例3：
一種促進月季種子無菌萌發的方法，包括如下步驟：
(1)河沙的無菌處理：將濕潤的河沙裝入組培瓶中，沙子體積為組培瓶容積的1/2，然后采用高壓蒸汽消毒，在壓力為0.1013Mpa、溫度為121℃的條件下進行消毒，消毒時間為28min，滅菌后使其自然冷卻，備用；所述的組培瓶規格為240mL，直徑68mm，口徑62mm，高90mm；
(2)無菌水的制備：在組培瓶中裝入75mL的自來水，然后采用高壓蒸汽消毒，在壓力為0.1013mPa、溫度為121℃的條件下進行消毒，消毒時間為28min，得到無菌水；
(3)種子的無菌處理：滅菌前，先將月季種子倒入盛有清水的容器中，并分攪拌，撈出漂浮在水面的癟種子和雜質，然后在自來水中浸泡24h，浸泡完成后即可進行滅菌處理：先將月季種子先用0.2％洗衣粉溶液中浸泡30min后，然后在流水下沖洗30min，再轉入超凈工作臺上，用75％乙醇浸泡種子25s，無菌水沖洗3次；再用0.1％升汞溶液浸泡種子14min，此操作過程中輕輕震蕩月季種子，使升汞溶液很好地接觸種子，最后無菌水沖洗3次，得到無菌月季種子；
(4)種子的預處理：將無菌月季種子用濃度為220mg/L的無菌GA3溶液浸泡24h，備用；
(5)無菌低溫層積：在超凈工作臺上，將經過無菌處理的月季種子埋入經高溫滅菌的沙子中，并在沙子中加入無菌水使其保持濕潤，種子播種完畢，將裝有沙子的組培瓶置于冰箱的冷藏室進行冷藏50d；待冷藏結束后，將組培瓶移入培養室進行常溫遮光培養13d，待遮光培養結束后統計出芽率；冷藏室的溫度設定為5℃。
將上述實施例1-3得到的促進月季種子無菌萌發的方法得到月季種子出芽率進行調查統計，結果見表1。
表1本發明的促進月季種子無菌萌發的方法對月季種子出芽率的測定
注：對照為采用常規方法對月季種子進行處理。
由表1可知，本發明的實施例1-3中月季種子的出芽率分別為52％、48％和49％，遠高于對照。可見，本發明的方法具有明顯的技術優勢，值得進一步推廣和應用。
前述對本發明的具體示例性實施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述并非想將本發明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據上述教導，可以進行很多改變和變化。對示例性實施例進行選擇和描述的目的在于解釋本發明的特定原理及其實際應用，從而使得本領域的技術人員能夠實現并利用本發明的各種不同的示例性實施方案以及各種不同的選擇和改變。本發明的范圍意在由權利要求書及其等同形式所限定。