1.一種抗番茄斑萎病毒煙草植株的篩選方法,其特征在于,包括如下步驟:
步驟(1),本氏煙育苗:將本氏煙種子播于帶煙草漂浮育苗基質的漂浮育苗盤中育苗30-40天,剔除弱苗,挑選出長勢整齊一致的幼苗,并保證漂浮盤中每孔有一株生長健壯的本氏煙幼苗;
步驟(2),抗病性待檢煙苗育苗:在本氏煙播種15天后,將擬進行抗病性鑒定的煙草種子播于帶煙草漂浮育苗基質的漂浮育苗盤中育苗30-40天,剔除弱苗,挑選出長勢整齊一致的幼苗,并保證漂浮盤中每孔有一株生長健壯的抗病性待檢煙苗;
步驟(3),接種緩沖液的配制:配制0.1M pH7.0的磷酸緩沖液,121℃滅菌20分鐘;在接種前半個小時內,每100 mL磷酸緩沖液加入0.2 g亞硫酸鈉,10 uL beta-巰基乙醇,配成TSWV接種緩沖液,放置冰上,備用;
步驟(4),本氏煙煙苗接種:將田間獲得經過TSWV試紙條檢測的TSWV毒源接種于步驟(1)獲得的本氏煙幼苗,具體步驟如下:
取TSWV毒源1-2g,放于研缽中,加入5-10mL步驟(3)獲得的TSWV接種緩沖液和2-3g 200-400目金剛砂,充分研磨至混合均勻,得到TSWV毒源汁液;
接種前洗凈雙手或者戴一次性乳膠手套操作;
接種時,首先將粒徑為200-400目金剛砂按照每片葉0.1-0.2g的用量均勻的撒至本氏煙幼苗的葉表面,之后取TSWV毒源汁液,用一只手托住待接種本氏煙幼苗葉片,另一只手從待接種本氏煙幼苗葉片的葉基到葉尖的方向輕輕地、均勻地涂擦TSWV毒源汁液;TSWV毒源汁液的用量為每片葉50-100ul;
涂擦后用清水沖洗接種過的葉片,接著將植株于溫度22-25℃、濕度為60-80%條件下暗培養一天,之后將植株移至溫度22-25℃、光周期是晝/夜為14h/10h、濕度為60-80%條件下繼續培養;
15天后,采集本氏煙苗上表現番茄斑萎病毒癥狀的葉片和/或莖干作為本氏煙TSWV毒源直接進行步驟(5)操作或保存于-80℃冰箱備用;
步驟(5),抗病性鑒定:取步驟(4)獲得的本氏煙TSWV毒源1-2g放于研缽中,加入5-10mL步驟(3)獲得的TSWV接種緩沖液和2-3g 200-400目金剛砂,充分研磨至混合均勻,得到本氏煙TSWV毒源汁液;
接種前洗凈雙手或者戴一次性乳膠手套操作;
接種時,首先將粒徑為200-400目金剛砂按照每片葉0.1-0.2g的用量均勻的撒至步驟(2)得到的抗病性待檢煙苗的葉表面,之后取本氏煙TSWV毒源汁液,用一只手托住待接種抗病性待檢煙苗葉片,另一只手從待接種抗病性待檢煙苗葉片的葉基到葉尖的方向輕輕地、均勻地涂擦本氏煙TSWV毒源汁液;本氏煙TSWV毒源汁液的用量為每片葉50-100 ul;
涂擦后用清水沖洗接種過的葉片,接著將植株于溫度22-25℃、濕度為60-80%條件下暗培養一天,之后將植株移至溫度22-25℃、光周期是晝/夜為14h/10h、濕度為60-80%條件下繼續培養;
每7天調查一次抗病性待檢煙苗的病害,并計算煙苗番茄斑萎病毒的發病率a,共調查3-4次,分抗、感性植株,以最高一次發病率調查結果作為該品種煙苗的病情進行統計;發病率a=(該品種感病植株數量/該品種總植株數量)×100%。
2.根據權利要求1所述的抗番茄斑萎病毒煙草植株的篩選方法,其特征在于,步驟(4)中,接種于步驟(1)獲得的本氏煙幼苗所采用的TSWV毒源為帶TSWV病毒的煙草葉片。
3.根據權利要求1所述的抗番茄斑萎病毒煙草植株的篩選方法,其特征在于,步驟(4)中,TSWV毒源接種于步驟(1)獲得的本氏煙幼苗時,選擇長成且還未衰老的葉片進行接種;
步驟(5)中,本氏煙TSWV毒源汁液接種于步驟(2)獲得的抗病性待檢煙苗時,選擇長成且還未衰老的葉片進行接種。
4.根據權利要求1所述的抗番茄斑萎病毒煙草植株的篩選方法,其特征在于,步驟(4)和步驟(5)涂擦后,均采用普通噴壺噴水沖洗接種過的葉片1-2次。
5.根據權利要求1所述的抗番茄斑萎病毒煙草植株的篩選方法,其特征在于,將粒徑為200-400目金剛砂均勻的撒至本氏煙幼苗或抗病性待檢煙苗的葉表面時,采用噴粉器噴撒。
6.根據權利要求1所述的抗番茄斑萎病毒煙草植株的篩選方法,其特征在于,步驟(4)和步驟(5)中接種取毒源汁液時,采用手指、棉球或者一次性的棉簽蘸取。
7.根據權利要求1所述的抗番茄斑萎病毒煙草植株的篩選方法,其特征在于,步驟(4)采集本氏煙苗上表現番茄斑萎病毒癥狀的葉片和莖干作為本氏煙TSWV毒源,本氏煙TSWV毒源的癥狀為葉片皺縮,輕微黃化褪綠,莖干彎曲。
8.根據權利要求1所述的抗番茄斑萎病毒煙草植株的篩選方法,其特征在于,步驟(5)中病害調查采用的方法為血清學檢測或分子生物學檢測;
血清學檢測時,采集抗病性待檢煙苗植株的葉片利用番茄斑萎病毒試紙條或者番茄斑萎病毒抗體進行ELISA檢測,呈陽性則表示為感病植株,反之則為抗病植株;
分子生物學檢測時,提取植株總RNA,利用番茄斑萎病毒特異性引物進行RT-PCR檢測,呈陽性則表示為感病植株,反之則為抗病植株。
9.根據權利要求8所述的抗番茄斑萎病毒煙草植株的篩選方法,其特征在于,步驟(5)中病害調查采用的方法還包括癥狀觀察;
癥狀觀察時,感病植株癥狀包括:系統葉出現壞死斑、皺縮、黃化,植株矮小,發病后期整株壞死。
10.根據權利要求1所述的抗番茄斑萎病毒煙草植株的篩選方法,其特征在于,發病率a=0為免疫品種,發病率0<a≤25%為抗病品種,發病率25%<a≤100%為感病品種。