本發明屬于生物農藥技術領域，尤其是涉及一種利用蝦蟹殼制備的植物免疫誘抗劑及其制備方法。

背景技術：

植物免疫誘抗劑也叫植物疫苗，是一類新型生物農藥，具有顯著防病、防凍、增產、改善品質的效果，對人畜無害、不污染環境。是繼人用疫苗、動物疫苗后，疫苗工程技術出現的新領域，也是國際上生物農藥創制較為熱門的研究方向。

植物免疫誘抗劑對農作物病蟲害沒有直接的殺滅作用，而是由外源生物或分子通過誘導或激活植物所產生的抗性物質，對某些病原物產生抗性或抑制病菌的生長。當其施用在農作物上后，通過誘導農作物產生抵御或防控農作物病蟲害的物質，從而達到防治病蟲害的目的。據不完全統計，目前，國內已經在農業部農藥檢定所獲得正式登記的植物免疫誘抗劑主要有康壯素(蛋白質激發子)、益微菌(枯草芽孢桿菌)、殼寡糖和脫落酸等藥物品種。有關植物免疫誘抗劑的研究與利用，目前也已經得到了政府有關管理和推廣部門及廣大農民的認可，其在保護植物健康生長、保障食品和生態安全方面發揮著越來越重要的作用。未來，植物免疫誘抗劑農藥將有望成為具有巨大發展前景的新型戰略產業。

幾丁質是已被確定的具有激發子活性的寡糖之一。幾丁質有大量的來源，最為主要的來源為蝦蟹殼，其含量為20％～40％，充分利用蝦蟹殼來源，開發更為高效的幾丁質植物免疫誘抗劑具有一定的市場前景。目前，利用幾丁質制備植物免疫誘抗劑已有少量研究。中國專利CN105746591A公開了一種利用蟹殼制備植物免疫誘抗劑的方法，該專利對蟹殼中的幾丁質進行酯化并以此作為植物免疫誘抗劑的主體。然而，從蟹殼中直接提取幾丁質的水溶性較差，而且幾丁質酯化會使水溶性的進一步降低，使其移動性受到限制，難以涉足長距離信號的傳導過程，使具有激發子活性的幾丁質片段難以更好發揮其有效作用，對植物誘導抗病性大幅降低。

技術實現要素：

針對幾丁質難以涉足長距離信號的傳導、誘導植物抗病性不足的問題，本發明提供了一種利用蝦蟹殼制備的植物免疫誘抗劑及其制備方法。

本發明是通過以下技術實現的：

一種利用蝦蟹殼制備的植物免疫誘抗劑，所述植物免疫誘抗劑包括如下重量配比的原料：改性幾丁質3～8份、中藥提取物0.5～1份、磷酸鹽0.1～0.5份、有機酸0.1～0.5份、水50～150份。

優選地，所述中藥提取物包括如下重量配比的原料：黃連3～8份、板藍根5～8份、黃芩5～10份、黃柏10～15份、大黃3～5份、魚腥草3～5份、大青葉3～5份、穿心蓮1～5份、五味子3～8份，其制備方法如下：將黃連、板藍根、黃芩、黃柏、大黃、魚腥草、大青葉、穿心蓮、五味子混合并以固液重量比1：30～40浸入40wt％～60wt％乙醇水溶液中，于70～80℃條件下保溫3～4小時后過濾，對過濾液進行噴霧干燥，收集干燥物，即為中藥提取物。

優選地，所述噴霧干燥為離心噴霧干燥，出口溫度為80～90℃，入口溫度為300～320℃，離心噴霧頭轉速為8000～12000轉/分。

優選地，所述磷酸鹽為磷酸氫鋁、磷酸銅、磷酸鈣、磷酸鐵和磷酸鎂中的一種或幾種。

優選地，所述有機酸為水楊酸和茉莉酸中的一種或兩種。

優選地，所述改性幾丁質的制備步驟如下：

1)取蝦蟹殼、去其殘肉，洗凈，于80～90℃條件下烘干后，粉碎至100～150目，得蝦蟹殼粉末；

2)取蝦蟹殼粉末按固液重量比1：30～40浸入0.5～1.5mol/L的鹽酸溶液中，升溫至60～80℃并保溫4～6小時后過濾，以水將蝦蟹殼粉末洗至中性；

3)將洗至中性的蝦蟹殼粉末以固液重量比1：20～30浸入5～10g/L的氫氧化鈉溶液中，升溫至40～60℃并保溫4～6小時后過濾，以水將蝦蟹殼粉末洗至中性；

4)將洗至中性的蝦蟹殼粉末以固液重量比1：20～30浸入10wt％～15wt％的雙氧水溶液中，升溫至80～100℃并保溫2～4小時后過濾，以水沖洗并于80～90℃條件下烘干，即得蝦蟹幾丁質；

5)將蝦蟹幾丁質以固液重量比1：4～6浸入40wt％～50wt％的氫氧化鈉溶液中，將混合溶液裝入不銹鋼容器中，通入氮氣，升溫至70～80℃，保溫72～96小時，過濾，除去堿液，以水將蝦蟹幾丁質洗至中性，于80～90℃條件下烘干后，即得脫乙酰幾丁質；

6)取脫乙酰幾丁質以固液重量比1：30～50溶于飽和碳酸氫銨溶液中，于室溫下靜置50～100h后，升溫至60～70℃，保溫1～2小時，真空濃縮該反應液并進行真空冷凍干燥，即得銨基化脫乙酰幾丁質；

7)稱取銨基化脫乙酰幾丁質加入等重量的二氯乙酸酐，于30～40℃下反應6～8小時后，加入銨基化脫乙酰幾丁質重量5～8倍的水，于70～90℃下反應6～8小時后，真空濃縮該反應液并進行真空冷凍干燥，即得改性幾丁質。

幾丁質是許多真菌細胞壁多糖的主要成分，植物幾丁質酶的釋放的可溶性幾丁質片段起到激發子的作用。然而幾丁質水溶性較差，整體移動性受到限制，不能涉足長距離信號傳導過程，在本發明中，發明人通過結構修飾制得具有良好生物活性的改性幾丁質(I)，提高了幾丁質的移動性，使較長距離信號傳導成為可能。

在本發明的植物免疫誘抗劑中，除了改性幾丁質外，更引入了磷酸鹽、有機酸和中藥提取物。磷酸鹽的金屬離子可使離子通道發生變化，離子通道在原生質膜去極化和激發子信號傳統過程中起到積極的作用；本發明所使用的有機酸為水楊酸和茉莉酸，水楊酸與茉莉酸為植物的內源激發子，將這兩種有機酸作為外源激發子施用于植物之上，同樣可誘導植物提高抗病能力；此外，為了實現對已遭受病原菌侵染的植物治愈，本發明添加了具有抗菌、殺菌活性的中藥提取物，結果顯示，中藥提取物的輔助作用進一步提高了植物免疫誘抗劑的使用效果。

優選地，步驟6)或步驟7)的真空濃縮的條件為：溫度為70～80℃，真空度為-0.08～-0.06MPa，時間為1～2小時；步驟6)或步驟7)的真空冷凍干燥的條件為：溫度-60～-40℃，真空度為-0.08～-0.06MPa，時間為96～120小時。

一種利用蝦蟹殼制備的植物免疫誘抗劑的制備方法，所述植物免疫誘抗劑的制備方法為：按重量配比將改性幾丁質、中藥提取物、磷酸鹽、有機酸、水混合，均質后，對混合溶液進行噴霧干燥，收集干燥物，即為植物免疫誘抗劑。

優選地，所述噴霧干燥為離心噴霧干燥，出口溫度為80～90℃，入口溫度為300～320℃，離心噴霧頭轉速為8000～12000轉/分。

本發明公開的一種利用蝦蟹殼制備的植物免疫誘抗劑及其制備方法，其有益效果為：1)對源于蝦蟹殼的幾丁質進行結構修飾，制得一種具有長距離傳導信號能力、高誘導植物抗性的改性幾丁質，以此為主要成份的植物免疫誘抗劑對多種病原菌侵染具有積極的免疫效果，尤其是對番茄的根腐菌、甲疫病菌效果顯著，其病害發生率小于5％；2)本發明所制得的植物免疫誘抗劑免疫作用時間長，與植物有較好的相容性，可被植物吸收或自行降解，對環境無污染。

具體實施方式

下面結合具體的實施例，對本發明申請所述的一種利用蝦蟹殼制備的植物免疫誘抗劑及其制備方法。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。

實施例1

本實施例一種利用蝦蟹殼制備的植物免疫誘抗劑，包括如下重量配比的原料：改性幾丁質3Kg、中藥提取物0.5Kg、磷酸鈣0.1Kg、水楊酸0.1Kg、水50Kg，其制備方法為：按原料的重量稱取改性幾丁質、中藥提取物、磷酸鈣、水楊酸、水混合，均質后，對混合溶液進行噴霧干燥，收集干燥物，即為植物免疫誘抗劑。其中，噴霧干燥為離心噴霧干燥，出口溫度為80℃，入口溫度為300℃，離心噴霧頭轉速為8000轉/分。

在本實施例所制備的植物免疫誘抗劑的原料中，改性幾丁質的制備步驟如下：

1)取蝦蟹殼、去其殘肉，洗凈，于80℃條件下烘干后，粉碎至100目，得蝦蟹殼粉末；

2)取20Kg蝦蟹殼粉末按固液重量比1：30浸入600Kg的0.5mol/L鹽酸溶液中，升溫至60℃并保溫4小時后過濾，以水將蝦蟹殼粉末洗至中性；

3)將洗至中性的蝦蟹殼粉末以固液重量比1：20浸入5g/L的氫氧化鈉溶液中，升溫至40℃并保溫4小時后過濾，以水將蝦蟹殼粉末洗至中性；

4)將洗至中性的蝦蟹殼粉末以固液重量比1：20浸入10wt％的雙氧水溶液中，升溫至80℃并保溫2小時后過濾，以水沖洗并于80℃條件下烘干，即得蝦蟹幾丁質；

5)將蝦蟹幾丁質以固液重量比1：4浸入40wt％的氫氧化鈉溶液中，將混合溶液裝入不銹鋼容器中，通入氮氣，升溫至70℃，保溫72小時，過濾，除去堿液，以水將蝦蟹幾丁質洗至中性，于80℃條件下烘干后，即得脫乙酰幾丁質；

6)取脫乙酰幾丁質以固液重量比1：30溶于飽和碳酸氫銨溶液中，于室溫下靜置50h后，升溫至60℃，升溫1小時，真空濃縮該反應液并進行真空冷凍干燥，即得銨基化脫乙酰幾丁質；真空濃縮的條件為：溫度為70℃，真空度為-0.08MPa，時間為1小時；真空冷凍干燥的條件為：溫度-60℃，真空度為-0.08MPa，時間為96小時；

7)稱取銨基化脫乙酰幾丁質加入等重量的二氯乙酸酐，于30℃下反應6小時后，加入銨基化脫乙酰幾丁質重量5倍的水，于70℃下反應6小時后，真空濃縮該反應液并進行真空冷凍干燥，即得改性幾丁質6.3Kg。真空濃縮的條件為：溫度為70℃，真空度為-0.08MPa，時間為1小時；真空冷凍干燥的條件為：溫度-60℃，真空度為-0.08MPa，時間為96小時。

在本實施例所制備的植物免疫誘抗劑的原料中，中藥提取物包括如下重量的原料：黃連3Kg、板藍根5Kg、黃芩5Kg、黃柏10Kg、大黃3Kg、魚腥草3Kg、大青葉3Kg、穿心蓮1Kg、五味子3Kg，其制備方法如下：將黃連、板藍根、黃芩、黃柏、大黃、魚腥草、大青葉、穿心蓮、五味子混合并以固液重量比1：30浸入40wt％乙醇水溶液中，于70℃條件下保溫3小時后過濾，對過濾液進行噴霧干燥，收集干燥物，即為中藥提取物0.57Kg。其中，噴霧干燥為離心噴霧干燥，出口溫度為80℃，入口溫度為300℃，離心噴霧頭轉速為8000轉/分。

實施例2

本實施例一種利用蝦蟹殼制備的植物免疫誘抗劑，包括如下重量配比的原料：改性幾丁質8Kg、中藥提取物1Kg、磷酸氫鋁0.5Kg、茉莉酸0.5Kg、水150Kg，其制備方法為：按原料的重量稱取改性幾丁質、中藥提取物、磷酸氫鋁、茉莉酸、水混合，均質后，對混合溶液進行噴霧干燥，收集干燥物，即為植物免疫誘抗劑。其中，噴霧干燥為離心噴霧干燥，出口溫度為90℃，入口溫度為320℃，離心噴霧頭轉速為12000轉/分。

在本實施例所制備的植物免疫誘抗劑的原料中，改性幾丁質的制備步驟如下：

1)取蝦蟹殼、去其殘肉，洗凈，于90℃條件下烘干后，粉碎至150目，得蝦蟹殼粉末；

2)取20Kg蝦蟹殼粉末按固液重量比1：40浸入800Kg的1.5mol/L鹽酸溶液中，升溫至80℃并保溫6小時后過濾，以水將蝦蟹殼粉末洗至中性；

3)將洗至中性的蝦蟹殼粉末以固液重量比1：30浸入10g/L的氫氧化鈉溶液中，升溫至60℃并保溫6小時后過濾，以水將蝦蟹殼粉末洗至中性；

4)將洗至中性的蝦蟹殼粉末以固液重量比1：30浸入15wt％的雙氧水溶液中，升溫至100℃并保溫4小時后過濾，以水沖洗并于90℃條件下烘干，即得蝦蟹幾丁質；

5)將蝦蟹幾丁質以固液重量比1：6浸入50wt％的氫氧化鈉溶液中，將混合溶液裝入不銹鋼容器中，通入氮氣，升溫至80℃，保溫96小時，過濾，除去堿液，以水將蝦蟹幾丁質洗至中性，于90℃條件下烘干后，即得脫乙酰幾丁質；

6)取脫乙酰幾丁質以固液重量比1：50溶于飽和碳酸氫銨溶液中，于室溫下靜置100h后，升溫至70℃，保溫2小時，真空濃縮該反應液并進行真空冷凍干燥，即得銨基化脫乙酰幾丁質；真空濃縮的條件為：溫度為80℃，真空度為-0.06MPa，時間為2小時；真空冷凍干燥的條件為：溫度-40℃，真空度為-0.06MPa，時間為120小時；

7)稱取銨基化脫乙酰幾丁質加入等重量的二氯乙酸酐，于40℃下反應8小時后，加入銨基化脫乙酰幾丁質重量8倍的水，于90℃下反應8小時后，真空濃縮該反應液并進行真空冷凍干燥，即得改性幾丁質6.3Kg。真空濃縮的條件為：溫度為80℃，真空度為-0.06MPa，時間為2小時；真空冷凍干燥的條件為：溫度-40℃，真空度為-0.06MPa，時間為120小時。

在本實施例所制備的植物免疫誘抗劑的原料中，中藥提取物包括如下重量的原料：黃連8Kg、板藍根8Kg、黃芩10Kg、黃柏15Kg、大黃5Kg、魚腥草5Kg、大青葉5Kg、穿心蓮5Kg、五味子8Kg，其制備方法如下：將黃連、板藍根、黃芩、黃柏、大黃、魚腥草、大青葉、穿心蓮、五味子混合并以固液重量比1：40浸入60wt％乙醇水溶液中，于80℃條件下保溫4小時后過濾，對過濾液進行噴霧干燥，收集干燥物，即為中藥提取物1.3Kg。其中，噴霧干燥為離心噴霧干燥，出口溫度為90℃，入口溫度為320℃，離心噴霧頭轉速為12000轉/分。

實施例3

本實施例一種利用蝦蟹殼制備的植物免疫誘抗劑，包括如下重量配比的原料：改性幾丁質6Kg、中藥提取物0.8Kg、磷酸鎂0.2Kg、磷酸鈣0.2Kg、水楊酸0.2Kg、茉莉酸0.2Kg、水100Kg，其制備方法為：按原料的重量稱取改性幾丁質、中藥提取物、磷酸鎂、磷酸鈣、水楊酸、茉莉酸、水混合，均質后，對混合溶液進行噴霧干燥，收集干燥物，即為植物免疫誘抗劑。其中，噴霧干燥為離心噴霧干燥，出口溫度為85℃，入口溫度為310℃，離心噴霧頭轉速為10000轉/分。

在本實施例所制備的植物免疫誘抗劑的原料中，改性幾丁質的制備步驟如下：

1)取蝦蟹殼、去其殘肉，洗凈，于85℃條件下烘干后，粉碎至130目，得蝦蟹殼粉末；

2)取20Kg蝦蟹殼粉末按固液重量比1：35浸入700Kg的1.0mol/L鹽酸溶液中，升溫至70℃并保溫5小時后過濾，以水將蝦蟹殼粉末洗至中性；

3)將洗至中性的蝦蟹殼粉末以固液重量比1：25浸入8g/L的氫氧化鈉溶液中，升溫至50℃并保溫5小時后過濾，以水將蝦蟹殼粉末洗至中性；

4)將洗至中性的蝦蟹殼粉末以固液重量比1：25浸入12wt％的雙氧水溶液中，升溫至90℃并保溫3小時后過濾，以水沖洗并于85℃條件下烘干，即得蝦蟹幾丁質；

5)將蝦蟹幾丁質以固液重量比1：5浸入45wt％的氫氧化鈉溶液中，將混合溶液裝入不銹鋼容器中，通入氮氣，升溫至75℃，保溫84小時，過濾，除去堿液，以水將蝦蟹幾丁質洗至中性，于85℃條件下烘干后，即得脫乙酰幾丁質；

6)取脫乙酰幾丁質以固液重量比1：40溶于飽和碳酸氫銨溶液中，于室溫下靜置75h后，升溫至65℃，并保持1.5小時，真空濃縮該反應液并進行真空冷凍干燥，即得銨基化脫乙酰幾丁質；真空濃縮的條件為：溫度為75℃，真空度為-0.07MPa，時間為1.5小時；真空冷凍干燥的條件為：溫度-50℃，真空度為-0.07MPa，時間為108小時；

7)稱取銨基化脫乙酰幾丁質加入等重量的二氯乙酸酐，于35℃下反應7小時后，加入銨基化脫乙酰幾丁質重量7倍的水，于80℃下反應7小時后，真空濃縮該反應液并進行真空冷凍干燥，即得改性幾丁質6.1Kg。真空濃縮的條件為：溫度為75℃，真空度為-0.07MPa，時間為1.5小時；真空冷凍干燥的條件為：溫度-50℃，真空度為-0.07MPa，時間為108小時。

在本實施例所制備的植物免疫誘抗劑的原料中，中藥提取物包括如下重量的原料：黃連6Kg、板藍根7Kg、黃芩8Kg、黃柏12Kg、大黃4Kg、魚腥草4Kg、大青葉4Kg、穿心蓮3Kg、五味子5Kg，其制備方法如下：將黃連、板藍根、黃芩、黃柏、大黃、魚腥草、大青葉、穿心蓮、五味子混合并以固液重量比1：35浸入50wt％乙醇水溶液中，于75℃條件下保溫3.5小時后過濾，對過濾液進行噴霧干燥，收集干燥物，即為中藥提取物0.9Kg。其中，噴霧干燥為離心噴霧干燥，出口溫度為85℃，入口溫度為310℃，離心噴霧頭轉速為10000轉/分。

為了進一步驗證實施例所制備的植物免疫誘抗劑的使用效果，請參見如下應用實例：1、番茄品種“浙粉702”(浙江省農業科學院)

2、植物免疫誘抗劑的施用方式

2015年5月25日開始，對兩組(實驗組與對照組)番茄進行噴施，每組50株。實驗組噴施由實施例1～3所制備的植物免疫誘抗劑水溶液(濃度為2g/L)，對照組噴施清水，每月噴施兩次，每株噴施30mL，其它肥料相同。2015年7月25日對實驗組與對照組的每株番茄進行檢查。結果如表1所示。

表1植物免疫誘抗劑對病害發生率的影響

由表1可知，與對照組(噴施清水)相比，所有實驗組(噴施植物免疫誘抗劑)的番茄根浙粉702的根腐菌、甲疫病菌均有顯著下降，病害發生率為5％以下。