本發明涉及牡丹組培技術領域，具體為一種牡丹離體再生組培方法。

背景技術：

芍藥科芍藥屬植物牡丹，作為我國的傳統名花，集觀賞、藥用于一身，近年來又發現‘鳳丹白’等牡丹品種種子含油量高，且品質優，被定位為高端食用油，在洛陽、河南、乃至全國，如西藏等地大量種植。牡丹的大面積種植不僅帶動一方的旅游事業，同時也帶動了地方經濟的快速發展。因此，對其進行品質育種的研究，提高其質量，發展我們的優勢產業就顯得尤為重要。

但是，牡丹因童期長、遺傳背景復雜等原因，使得傳統育種耗時長、目的性差、選擇效率低、更新慢，造成牡丹育種現狀不能滿足人民群眾對牡丹特色市場的日益增長的需求。因此，在繼續重視傳統育種的同時，創新并應用迅速發展的組織培養技術和轉基因技術進行其品質改良已經迫在眉睫。目前國內牡丹快繁的研究，多采用的是鱗芽，也有采用子葉和下胚軸及葉片快繁的，這些研究往往經過愈傷組織再生植株，而牡丹組培中，誘導產生愈傷組織比較容易，而由愈傷組織分化不定芽卻比較困難，不定芽分化率一般比較低。李玉龍等人誘導牡丹嫩葉和葉柄產生愈傷組織，并分化成不定芽，實現了少量的植株再生；他得出葉柄的愈傷誘導率及愈傷分化率都顯著高于嫩葉。李艷敏誘導紫瑤臺葉片愈傷組織的不定芽分化率最高僅為10.0%?？梢?，牡丹組織培養中，由愈傷組織再生植株的途徑還需要深入研究。2009年賈文慶曾采用牡丹胚早熟萌發的方式再生叢生芽，植株再生效果也一般。

技術實現要素：

為了解決上述牡丹離體再生速度慢、效果一般的問題，本發明通過成熟胚再生形成下胚軸，并使下胚軸在植物生長調節劑6-BA和IBA刺激及PEG6000滲透脅迫突然解除的情況下，不經過愈傷組織直接產生不定芽，且生根時改良MS培養基還額外附加了脯氨酸、核黃素，實現牡丹快繁，生根率達到了70%，為牡丹快速繁殖和遺傳育種、轉基因等遺傳操作誘導新品種奠定基礎。

本發明為了解決上述問題所采取的技術方案為：一種牡丹離體再生組培方法，包括以下步驟：

步驟一、將牡丹種子滅菌后取其成熟胚，接種在1/2MS培養基上培養；

步驟二、待成熟胚萌發后取其幼嫩的下胚軸，剪切成0.4-0.6cm長，接種在含有4%(W/V)的PEG6000并附加了1.5 - 2.5 mg/L 6-BA、0.2 - 0.5 mg/L IBA和3%(W/V)蔗糖的改良MS培養基上培養15-25天，至下胚軸切口處膨大；

步驟三、將切口處膨大的下胚軸繼代在附加了1.5 - 2.5 mg/L 6-BA和0.2 - 0.5 mg/L IBA的改良MS培養基上接種14-30天，至下胚軸膨大的切口處直接分化出牡丹不定芽；

步驟四、待牡丹不定芽長至3-4cm時，將牡丹不定芽從根部切下，并接種在附加了0.2 mg/LNAA、0.2 mg/L IBA、50-100mg/L脯氨酸和0.1-3mg/L核黃素的改良MS培養基上生根，即完成牡丹離體再生。

作為一種優選方案，其中，步驟四中的改良MS培養基替換為1/2改良MS培養基。

作為一種優選方案，步驟二、步驟三和步驟四中采用的改良MS培養基的配方為：Ca²⁺濃度是MS培養基中Ca²⁺濃度的兩倍， Mn²⁺、Zn²⁺、Mo⁶⁺和Cu ²⁺的濃度分別為MS培養基中Mn²⁺、Zn²⁺、Mo⁶⁺和Cu ²⁺濃度的1-12倍。

作為一種優選方案，步驟三中改良MS培養基的培養溫度為22±2℃，牡丹不定芽的分化頻率為35%。

作為一種優選方案，步驟四培養過程采用16小時光照和8小時黑暗處理，光照強度為2000lx，生根培養溫度為25±2℃。

作為一種優選方案，步驟四所述改良MS培養基中總蔗糖為2.5%(W/V)。

研究表明，隨著PEG濃度的增加，脅迫時間的延長，下胚軸相對含水量降低，細胞膜相對透性增大,脯氨酸和丙二醛（MDA）積累增加，可溶性糖先升后降，可溶性蛋白含量先降后升，高濃度的PEG引起各項指標變幅大于低濃度PEG。因此適宜的PEG濃度能促進胚根和胚芽的生長，較高PEG濃度顯著抑制其胚根和胚芽生長。

而經過若干次實驗，得出在PEG6000濃度為4%(W/V)時最適宜促進牡丹下胚軸的生長。

與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：

第一，本發明先將下胚軸在含有4%(W/V)的PEG6000的改良MS培養基上培養，PEG6000的添加可使下胚軸發生滲透脅迫，極大的促進了下胚軸的生長，在滲透脅迫的作用下培養15-25天后，轉換培養基，取消PEG6000的添加，將其繼代在不含PEG6000的改良MS培養基上接種14-30天，在PEG6000滲透脅迫突然解除的情況下，下胚軸可不經過愈傷組織而直接產生不定芽，略過了愈傷組織這一過程，解決了愈傷組織分化不定芽卻比較困難、不定芽分化率一般比較低的問題；

第二，本發明將分化出的不定芽在含有IBA及脯氨酸、核黃素的改良MS培養基上生根，改良MS培養基中Ca²⁺以及微量元素Mn²⁺、Zn²⁺、Mo⁶⁺和Cu ²⁺的含量顯著提高，在脯氨酸、核黃素的作用下實現高效快速生根，生根率達到了69.8%，實現了牡丹離體組織的快速繁殖，為牡丹快速繁殖和遺傳育種、轉基因等遺傳操作誘導新品種奠定基礎。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明作詳細說明，本實施例以本發明技術方案為前提，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程。

一種牡丹離體再生組培方法，包括以下步驟：

步驟一、將牡丹種子滅菌后取其成熟胚，接種在1/2MS培養基上培養；本發明所述MS培養基為現有技術，在此不做贅述；

步驟二、待成熟胚萌發后取其幼嫩的下胚軸，剪切成0.4-0.6cm長，接種在含有4%(W/V)的PEG6000并附加了1.5 - 2.5 mg/L 6-BA、0.2 - 0.5 mg/L IBA和3%(W/V)蔗糖的改良MS培養基上培養15-25天，至下胚軸切口處膨大；

步驟三、將切口處膨大的下胚軸繼代在附加了1.5 - 2.5 mg/L 6-BA和0.2 - 0.5 mg/L IBA的改良MS培養基上接種14-30天，至下胚軸膨大的切口處直接分化出牡丹不定芽；

步驟四、待牡丹不定芽長至3-4cm時，將牡丹不定芽從根部切下，并接種在附加了0.2 mg/LNAA、0.2 mg/L IBA、50-100mg/L脯氨酸和0.1-3mg/L核黃素的改良MS培養基上生根，即完成牡丹離體再生。

作為一種優選方案，其中，步驟四中的改良MS培養基替換為1/2改良MS培養基。

作為一種優選方案，步驟二、步驟三和步驟四中采用的改良MS培養基的配方為：Ca²⁺濃度是MS培養基中Ca²⁺濃度的兩倍， Mn²⁺、Zn²⁺、Mo⁶⁺和Cu ²⁺的濃度分別為MS培養基中Mn²⁺、Zn²⁺、Mo⁶⁺和Cu ²⁺濃度的1-12倍。

作為一種優選方案，步驟三中改良MS培養基的培養溫度為22±2℃，牡丹不定芽的分化頻率為35%。

作為一種優選方案，步驟四培養過程采用16小時光照和8小時黑暗處理，光照強度為2000lx，生根培養溫度為25±2℃。

作為一種優選方案，步驟四所述改良MS培養基中總蔗糖為2.5%(W/V)。

實施例1

步驟一、將牡丹種子滅菌后取其成熟胚，接種在1/2MS培養基上培養；

步驟二、待成熟胚萌發后取其幼嫩的下胚軸，剪切成0.4cm長，接種在含有4%(W/V)的PEG6000并附加了1.5 mg/L 6-BA、0.2mg/L IBA和3%(W/V)蔗糖的改良MS培養基上培養15天，至下胚軸切口處膨大；

步驟三、將切口處膨大的下胚軸繼代在附加了1.5 mg/L 6-BA和0.2 mg/L IBA的改良MS培養基上接種14天，至下胚軸膨大的切口處直接分化出牡丹不定芽；

步驟四、待牡丹不定芽長至3cm時，將牡丹不定芽從根部切下，并接種在附加了0.2 mg/LNAA、0.2 mg/L IBA、50mg/L脯氨酸和0.1mg/L核黃素的改良MS培養基上生根，即完成牡丹離體再生。

作為一種優選方案，步驟二、步驟三和步驟四中采用的改良MS培養基的配方為：Ca²⁺濃度是MS培養基中Ca²⁺濃度的兩倍， Mn²⁺濃度增加為原來的3倍，Zn²⁺、Mo⁶⁺和Cu ²⁺的濃度分別為MS培養基中Zn²⁺、Mo⁶⁺和Cu ²⁺濃度的1.2倍。

作為一種優選方案，步驟三中改良MS培養基的培養溫度為20℃，牡丹不定芽的分化頻率為35%。

作為一種優選方案，步驟四培養過程采用16小時光照和8小時黑暗處理，光照強度為2000lx，生根培養溫度為23℃。

實施例2

步驟一、將牡丹種子滅菌后取其成熟胚，接種在1/2MS培養基上培養；

步驟二、待成熟胚萌發后取其幼嫩的下胚軸，剪切成0.6cm長，接種在含有4%(W/V)的PEG6000并附加了2.5 mg/L 6-BA、0.5 mg/L IBA和3%(W/V)蔗糖的改良MS培養基上培養25天，至下胚軸切口處膨大；

步驟三、將切口處膨大的下胚軸繼代在附加了2.5 mg/L 6-BA和0.5 mg/L IBA的改良MS培養基上接種30天，至下胚軸膨大的切口處直接分化出牡丹不定芽；

步驟四、待牡丹不定芽長至4cm時，將牡丹不定芽從根部切下，并接種在附加了0.2 mg/LNAA、0.2 mg/L IBA、100mg/L脯氨酸和3mg/L核黃素的1/2改良MS培養基上生根，即完成牡丹離體再生。

作為一種優選方案，步驟二、步驟三和步驟四中采用的改良MS培養基的配方為：Ca²⁺濃度是MS培養基中Ca²⁺濃度的兩倍， Mn²⁺、Zn²⁺和Cu ²⁺的濃度分別為MS培養基中Mn²⁺、Zn²⁺和Cu ²⁺濃度的1.5倍， Mo⁶⁺濃度為MS培養基中Mo⁶⁺濃度的8倍。

作為一種優選方案，步驟三中改良MS培養基的培養溫度為24℃，牡丹不定芽的分化頻率為35%。

作為一種優選方案，步驟四培養過程采用16小時光照和8小時黑暗處理，光照強度為2000lx，生根培養溫度為27℃。

實施例3

步驟一、將牡丹種子滅菌后取其成熟胚，接種在1/2MS培養基上培養；

步驟二、待成熟胚萌發后取其幼嫩的下胚軸，剪切成0.5cm長，接種在含有4%(W/V)的PEG6000并附加了2 mg/L 6-BA、0.35mg/L IBA和3%(W/V)蔗糖的改良MS培養基上培養20天，至下胚軸切口處膨大；

步驟三、將切口處膨大的下胚軸繼代在附加了2 mg/L 6-BA和0.35 mg/L IBA的改良MS培養基上接種22天，至下胚軸膨大的切口處直接分化出牡丹不定芽；

步驟四、待牡丹不定芽長至3.5cm時，將牡丹不定芽從根部切下，并接種在附加了0.2 mg/LNAA、0.2 mg/L IBA、75mg/L脯氨酸和1.4mg/L核黃素的改良MS培養基上生根，即完成牡丹離體再生。

作為一種優選方案，步驟二、步驟三和步驟四中采用的改良MS培養基的配方為：Ca²⁺濃度是MS培養基中Ca²⁺濃度的兩倍，Zn²⁺和Cu ²⁺的濃度分別為MS培養基中Zn²⁺和Cu ²⁺濃度的2.5倍，Mn²⁺和Mo⁶⁺的濃度分別為MS培養基中Mn²⁺和Mo⁶⁺濃度的6倍。

作為一種優選方案，步驟三中改良MS培養基的培養溫度為22℃，牡丹不定芽的分化頻率為35%。

作為一種優選方案，步驟四培養過程采用16小時光照和8小時黑暗處理，光照強度為2000lx，生根培養溫度為25℃。

以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，并非對本發明作任何形式上的限制，雖然本發明已以較佳實施例描述如上，然而并非用以限定本發明，任何熟悉本專業的技術人員，在不脫離本發明技術方案范圍內，當可利用上述所述技術內容作出的些許更動或修飾均為等同變化的等效實施例，但凡是未脫離本發明技術方案內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發明技術方案的范圍內。