本發明屬于植物組織培養技術領域，具體涉及沉水植物篦齒眼子菜的組培和快速繁殖方法，該方法是采取完全無菌和嚴格的控溫措施，實現了沉水植物篦齒眼子菜在實驗室大量生產，并可以推廣到生態環境修復領域。

背景技術：

篦齒眼子菜屬于眼子菜屬，是一種分布于全世界的沉水植物。篦齒眼子菜生于河溝、水渠、池塘等各類水體，水體多呈微酸性或中性，在中國西北地區亦見于少數微堿性水體及咸水中。全球分布，尤以兩半球溫帶水域較為習見，對水體中的氮磷有突出的凈化效果。

近幾十年來，因為環境污染和棲息地改變等因素，篦齒眼子菜從其先前生長的環境中退化或者消失。可惜的是，目前尚缺乏成熟技術，可以大規模擴繁篦齒眼子菜優質工程苗，同時克服該物種在自然環境中種源退化且污染嚴重的問題。

技術實現要素：

本發明提供了一種篦齒眼子菜組織培養與快速繁殖方法，該方法是在無菌條件下，采取控溫措施，給予固定光照，建立植物無菌苗體系，可常年提供大量無菌幼苗。方法易行，操作方便，產量高。

為了達到上述目的，本發明采用以下技術措施：

一種篦齒眼子菜組織培養與快速繁殖方法，包括以下步驟：

a、外植體選擇與預處理：選擇顏色鮮綠，生長健壯的可萌發腋芽的篦齒眼子菜莖段作為外植體，用堿性洗滌劑浸泡10min，再用自來水沖洗1小時，用蒸餾水反復沖洗4-5次，用無菌水再反復清洗4-5次，置于無菌操作臺；

b、無菌外植體的制備：在無菌操作臺上首先用75%乙醇浸泡15秒，用無菌水沖洗3-4次，進行表面消毒5分鐘，無菌水沖洗4-5次，在無菌濾紙上將水吸干，待用；

c、叢生芽誘導：選擇0.10mg/lkt（激動素）和0.01mg/lnaa（萘乙酸）的ms固體培養基，蔗糖質量濃度為3%，ph調至5.8-6.0，固體培養基裝于組培瓶；培養基經過120℃滅菌處理20min，冷卻后，接入滅菌處理后的1.0-2.0cm的篦齒眼子菜外植體，于光照培養箱中靜置培養，待幼芽長至5.0-6.0cm進行增殖培養；

d、增殖培養：選擇蔗糖質量濃度1.5%的1/2ms液體培養基，添加0.05-2.00mg/l6-ba（6-芐氨基嘌呤）和0.01-0.50mg/lnaa的激素；液體培養基分裝于500毫升組培瓶中，每瓶100毫升，滅菌后，接入5.0-6.0cm的幼芽置于光照培養箱中，進行增殖培養；

e、生根培養：選擇蔗糖質量濃度1.5%的1/2ms液體培養基，添加0.01-1.00mg/lnaa的激素；液體培養基分裝于500毫升組培瓶中，每瓶100毫升，滅菌后，接入長6.0-8.0cm的幼苗置于光照培養箱中靜置，進行生根培養；

f、擴大培養：選擇長度為17.0-20.0cm的無菌幼苗，置于增殖培養基中，進行工業化生產；

g、煉苗和移栽：待篦齒眼子菜無菌幼苗長至25.0cm即可煉苗，打開瓶蓋，室溫下煉苗1-2d后洗凈培養基，取出試管苗，移栽至自然水體中；

所述的步驟c、d、e、f均采用無菌環境，光照60-70μe/（m²·s），光照周期為12h/d，室內溫度（25±2）℃。

優選的，步驟b中，所述的表面消毒采用0.1%氯化汞。

優選的，步驟c中，kt的濃度為0.10mg/l，naa的濃度為0.01mg/l。

本發明具有以下有益效果：

篦齒眼子菜是修復受損水生態環境的先鋒種類，但目前關于篦齒眼子菜組織培養的技術未見報道。本發明對篦齒眼子菜進行無菌繁殖體系建立，對以后對篦齒眼子菜進行系統的研究、濕地的保護與修復以及生態環境的修復具有重要意義。利用本發明可以不受季節、溫度、地域影響，生產大量的篦齒眼子菜無菌苗。一個長為17-20cm的無菌幼苗經過一個月的培養可以繁殖出29-47cm長的幼苗，濕重可增加24倍，30d的增殖系數最高可達到15倍，優越于自然水體植物的繁殖速度。

附圖說明

圖1是實施例1中篦齒眼子菜30d增殖情況；

圖2是實施例2中篦齒眼子菜30d增殖情況。

具體實施方式

本發明實施例所使用的試劑，如未特別說明，市售的均可實現本發明，涉及的技術方案，如未特別說明，均可采用本領域的常規技術。

實施例中采用的ms培養基配方如下：單位mg/l，

kno31900

nh4no31650

mgso4?7h2o370

kh2po4170

cacl2?2h2o440

mnso4?4h2o22.3

znso4?7h2o8.6

h3bo36.2

ki0.83

na2moo4?7h2o0.25

cuso4.5h2o0.025

cocl2.6h2o0.025

na2-edta37.3

feso4?7h2o27.8

甘氨酸2.0

鹽酸吡哆醇0.5

鹽酸硫銨素0.1

煙酸0.5

肌酸100

ms固體培養基為上述培養配方中加入6g/l瓊脂。

實施例1

a、外植體選擇與預處理：選擇顏色鮮綠，生長健壯的可萌發腋芽的篦齒眼子菜莖段作為外植體，用堿性洗滌劑浸泡10min，再用自來水沖洗1小時，用蒸餾水反復沖洗4-5次，用無菌水再反復清洗4-5次，置于無菌操作臺；

b、無菌外植體的制備：在無菌操作臺上首先用75%乙醇浸泡15秒，用無菌水沖洗3-4次，再用0.1%氯化汞（加入幾滴吐溫80）進行表面消毒5分鐘，無菌水沖洗4-5次，在無菌濾紙上將水吸干，待用；

c、叢生芽誘導：選擇0.10mg/lkt和0.01mg/lnaa的ms固體培養基，蔗糖質量濃度為3%，ph調至5.8-6.0，固體培養基裝于組培瓶；培養基經過120℃滅菌處理20min，冷卻后，接入滅菌處理后的1.0-2.0cm的篦齒眼子菜外植體，于光照培養箱中靜置培養，待幼芽長至5.0-6.0cm進行增殖培養；

d、增殖培養：選擇蔗糖質量濃度1.5%的1/2ms液體培養基，添加2.00mg/l6-ba和0.50mg/lnaa的激素；液體培養基分裝于500毫升組培瓶中，每瓶100毫升，滅菌方式與芽誘導相同，接入5.0-6.0cm的幼芽置于光照培養箱中，進行增殖培養；

e、生根培養：選擇蔗糖質量濃度1.5%的1/2ms液體培養基，添加0.01mg/lnaa的激素；液體培養基分裝于500毫升組培瓶中，每瓶100毫升，滅菌方式與芽誘導相同，接入長6.0-8.0cm的幼苗置于光照培養箱中靜置，進行生根培養；

f、擴大培養：后期進行擴大傳代培養，生產大量無菌植物時，選擇長度為17.0cm的無菌幼苗，置于增殖培養基中，進行工業化生產；

g、煉苗和移栽：待篦齒眼子菜無菌苗長至25.00cm即可煉苗，打開瓶蓋，室溫下煉苗1-2d后洗凈培養基，取出試管苗，移栽至自然水體中；

所述的步驟c、d、e、f均采用無菌環境，光照60-70μe/（m²·s），光照周期為12h/d，室內溫度（25±2）℃。

本方法可以由一個外植體直接誘導出幼芽，再不斷繁殖得到更多的叢芽，30d的增殖系數達到15，植物重量增加23.9倍，長度增加1.6倍，且獲得幼苗和自然環境中的篦齒眼子菜沒有差別。存活率大于95%。實施例1中篦齒眼子菜30d增殖情況如圖1所示。

實施例2

a、外植體選擇與預處理：選擇顏色鮮綠，生長健壯的可萌發腋芽的篦齒眼子菜莖段作為外植體，用堿性洗滌劑浸泡10min，再用自來水沖洗1小時，用蒸餾水反復沖洗4-5次，用無菌水再反復清洗4-5次，置于無菌操作臺；

b、無菌外植體的制備：在無菌操作臺上首先用75%乙醇浸泡15秒，用無菌水沖洗3-4次，再用0.1%氯化汞（加入幾滴吐溫80）進行表面消毒5分鐘，無菌水沖洗4-5次，在無菌濾紙上將水吸干，待用；

c、叢生芽誘導：選擇0.10mg/lkt和0.01mg/lnaa的ms固體培養基，蔗糖質量濃度為3%，ph調至5.8-6.0，固體培養基裝于組培瓶；培養基經過120℃滅菌處理20min，冷卻后，接入滅菌處理后的1.0-2.0cm的篦齒眼子菜外植體，于光照培養箱中靜置培養，待幼芽長至5.0-6.0cm進行增殖培養；

d、增殖培養：選擇蔗糖質量濃度1.5%的1/2ms液體培養基，添加0.05mg/l6-ba和0.01mg/lnaa的激素；液體培養基分裝于500毫升組培瓶中，每瓶100毫升，滅菌方式與芽誘導相同，接入5.0-6.0cm的幼芽置于光照培養箱中，進行增殖培養；

e、生根培養：選擇蔗糖質量濃度1.5%的1/2ms液體培養基，添加1.00mg/lnaa的激素；液體培養基分裝于500毫升組培瓶中，每瓶100毫升，滅菌方式與芽誘導相同，接入長6.0-8.0cm的幼苗置于光照培養箱中靜置，進行生根培養；

f、擴大培養：后期進行擴大傳代培養，生產大量無菌植物時，選擇長度為20.0cm的無菌幼苗，置于增殖培養基中，進行工業化生產；

g、煉苗和移栽：待篦齒眼子菜無菌苗長至25.00cm即可煉苗，打開瓶蓋，室溫下煉苗1-2d后洗凈培養基，取出試管苗，移栽至自然水體中；

所述的步驟c、d、e、f均采用無菌環境，光照60-70μe/（m²·s），光照周期為12h/d，室內溫度（25±2）℃。

本方法由一個外植體直接誘導出幼苗，30d的增殖系數達到10，植物重量增加24.8倍，長度增加2.6倍，獲得的幼苗和自然環境中的篦齒眼子菜沒有差別。存活率大于90%。實施例2中篦齒眼子菜30d增殖情況如圖2所示。

表1所示為兩個實施例中篦齒眼子菜的生長情況。