本發明涉及一種香鱗毛蕨的工廠化育苗與人工栽培方法，屬于香鱗毛蕨栽培技術領域。

背景技術：

香鱗毛蕨(dryopterisfragrans(l.)schott)是一種野生多年生蕨類植物，系鱗毛蕨科鱗毛蕨屬，新鮮葉片揉碎具有香味，也稱香葉鱗毛蕨。與絕大部分喜濕與高溫環境下生長的蕨類植物截然不同，香鱗毛蕨的生長環境極其特殊，生于火山噴發后形成的滑石坡、熔巖縫隙和火山巖漿縫中。在世界范圍內，香鱗毛蕨分布于中國、日本、朝鮮、蒙古、俄羅斯和北美，海拔約為1000～1700m的高寒地帶。在中國，香鱗毛蕨主要分布于黑龍江省的五大連池地區。

香鱗毛蕨可耐低溫，在-20℃條件下仍能存活，但是香鱗毛蕨生長緩慢，通常具有較長的生長期，需要經過多年培養才能形成成熟孢子體。近年來，香鱗毛蕨對牛皮癬、青少年痤瘡、銀屑病等皮膚病的治療有很好的療效而受到廣泛的關注，具有良好的發展前景。但是由于生態環境遭到破壞和人類對其藥用價值的發掘，野生香鱗毛蕨資源受到嚴重的影響。通過普通的組織培養和土壤培養誘導孢子體的過程周期較長，且野生的香鱗毛蕨在誘導過程中容易死亡，因此，如何利用人工栽培技術高產栽培香鱗毛蕨成為現有技術中的技術難題，現有技術中也未有相關報道。

技術實現要素：

為了實現香鱗毛蕨的人工土壤栽培，獲得大量的成熟香鱗毛蕨孢子體植株,本發明提供了一種香鱗毛蕨的工廠化育苗與人工栽培方法，采用的技術方案如下：

本發明的目的在于提供一種香鱗毛蕨的工廠化育苗與人工栽培方法，該方法為組培方法，包括以下步驟：

步驟一：將香鱗毛蕨的成熟孢子制備成無菌孢子懸浮液，將無菌孢子懸浮液接種于培養基中先黑暗處理同步萌發后進行培養，待長至配子體階段將其接種于固體培養基中繼續進行培養，獲得生長狀況良好的香鱗毛蕨配子體；

步驟二：將步驟一獲得的香鱗毛蕨配子體移出洗凈后移入到栽培有水蕨配子體的土壤基質中進行培養，獲得成熟的香鱗毛蕨孢子體。

本發明步驟一所述液體培養基為改良的knop′s液體培養基，該培養基中含有0.25gnah2po4，0.25gkno3，0.25gmgso4，1.0gca(no3)2和蒸餾水1000ml，ph為5.7-5.8。

本發明步驟一所述固體培養基為1/2ms+蔗糖+瓊脂固體培養基，該培養基中含有1/2ms、3.0％蔗糖(質量)、0.7％～0.8％瓊脂(質量)，ph為5.7-5.8。

本發明步驟一和步驟二所述的培養的條件為22℃±5℃，光照12h-16h，黑暗8h-12h，光強150μmol·m-2·s-1-180μmol·m-2·s-1。

作為本發明進一步優選方案，步驟一和步驟二所述的培養的條件為25℃，光照16h，黑暗8h，光強150μmol·m-2·s-1-180μmol·m-2·s-1。

本發明步驟二所述土壤基質是由草炭土和蛭石按照體積比為3：1配置而成的。

本發明步驟二所述水蕨配子體的數目為1株～5株。優選方案為1株～3株。

優選地，步驟二所述洗凈使用22℃±5℃的清水洗凈。

本發明的另一目的是提供另外一種香鱗毛蕨的工廠化育苗與人工栽培方法，該方法為土培方法，包括以下步驟：

步驟一：將香鱗毛蕨的成熟孢子制備成無菌孢子懸浮液，將無菌孢子懸浮液接種于盛裝有土壤基質的容器中，向土壤基質中澆水后用塑料薄膜覆蓋整個容器保濕，于22℃±5℃進行培養，獲得生長狀況良好的香鱗毛蕨配子體；

步驟二：將步驟一獲得的香鱗毛蕨配子體移入到栽培有水蕨配子體的土壤基質中進行培養，獲得成熟的香鱗毛蕨孢子體。

作為本發明優選方案步驟一所述土壤基質和步驟二所述的土壤基質均是由草炭土和蛭石按照體積比3：1配置而成的。

本發明步驟二所述水蕨配子體的數目為1株～5株。優選方案為1株～3株。

本發明步驟一和步驟二所述的培養的條件為22℃±5℃，光照12h-16h，黑暗8h-12h，光強150μmol·m-2·s-1-180μmol·m-2·s-1。

作為本發明進一步優選方案，步驟一和步驟二所述的培養的條件為25℃，光照16h，黑暗8h，光強150μmol·m-2·s-1-180μmol·m-2·s-1。

本發明利用生態學原理，通過主栽植物與一年生水生粗梗水蕨(ceratopteristhalictroides)共同播種聯生，水蕨根系與香鱗毛蕨根系共同生長。水蕨根系固定土壤中的水分，使得土壤保持潮濕，水分得到充分地吸收利用。另外，土壤水分也有利于精子和卵細胞的結合形成孢子體，能夠提高香鱗毛蕨孢子體的成活率。地上部分增加塑料薄膜覆蓋，將土壤中的無效蒸騰轉變為植物的有效利用，提高香鱗毛蕨的生長速率，形成一種快速獲得大量成熟香鱗毛蕨孢子體的植株生長模式，以達到實現香鱗毛蕨工廠化育苗的目的。

本發明有益效果：

1、本發明通過對香鱗毛蕨孢子體的誘導和培養模式進行研究，首次建立了香鱗毛蕨的高產人工栽培方法，本發明在保持正常土壤條件的情況下，植入能夠充分固定并利用水分的一年生水生粗梗水蕨，通過將香鱗毛蕨與一年生水生粗梗水蕨(ceratopteristhalictroides)共同播種聯生，使水蕨根系與香鱗毛蕨根系共同生長。其中水蕨能夠增加通氣量，充分固定水分，使得土壤保持潮濕，水分得到充分的吸收利用，減少土壤無效蒸騰的作用，能夠加速香鱗毛蕨孢子體的形成，并提高了香鱗毛蕨孢子體的誘導率，同時，地上部分增加塑料薄膜覆蓋，將土壤中的無效蒸騰轉變為植物的有效利用，進一步提高香鱗毛蕨的生長速率，最終形成一種快速獲得大量成熟香鱗毛蕨孢子體的植株生長模式，以達到實現香鱗毛蕨孢子體工廠化生產的目的，為實現香鱗毛蕨孢子體的大規模生產提供了有力的技術支持，同時為香鱗毛蕨植物資源的可持續利用奠定了基礎。

2、本發明方法克服了通過組織培養和土壤培養誘導孢子體的過程周期較長，且野生的香鱗毛蕨在誘導過程中容易死亡的問題，本發明的方法大大縮短了香鱗毛蕨的生長周期，而利用本發明的方法培養香鱗毛蕨成熟的孢子形成孢子體，培養周期僅需90天。通常在自然條件下形成香鱗毛蕨成熟孢子到形成孢子體非常困難，孢子萌發率約為0％～7％，本發明的方法還大大提高了香鱗毛蕨孢子體的誘導率，組培法香鱗毛蕨孢子體誘導率高達66.67％，土培法香鱗毛蕨孢子體誘導率高達86.67％。

3、本發明將香鱗毛蕨和水蕨科植物間作，二者產生了伴生作用，本發明首次提供了一條生物措施促進香鱗毛蕨孢子體的成熟，并為實現香鱗毛蕨孢子體的大規模生產提供了有力的技術支持。同時生產成本低、栽培管理難度低和成本，易于實現香鱗毛蕨孢子體的工廠化生產。

附圖說明

圖1為通過香鱗毛蕨配子體誘導的香鱗毛蕨幼苗。

圖2為組培香鱗毛蕨配子體誘導的香鱗毛蕨幼苗。

圖3為土培香鱗毛蕨配子體誘導的香鱗毛蕨幼苗。

圖4為大量培養香鱗毛蕨孢子體。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明做進一步說明，但本發明不受實施例的限制。

以下實施例中的材料方法如下：

1試驗材料

蕨類植物香鱗毛蕨采自黑龍江省五大連池市火山熔巖的巖縫間。

2培養條件

基本培養基為改良的knop′s配方(nah2po40.25g、kno30.25g、mgso40.25g、ca(no3)21.0g、蒸餾水1000ml)。配子體生長培養基為1/2ms+蔗糖+瓊脂的固體培養基，其中包含ms(含有大量元素、微量元素及有機成分)，再添加3.0％的蔗糖和0.7-0.8％的瓊脂。

培養基在高壓滅菌前用氫氧化鈉或鹽酸調整ph值為5.7-5.8；

培養溫度22℃±5℃(優選為25℃)，光照12h-16h(優選為16h)，黑暗8h-12h(優選為8h)，光強約為150μmol·m-2·s-1-180μmol·m-2·s-1，培養過程中始終保持潮濕。

實施例1：

本實施例提供了一種香鱗毛蕨的工廠化育苗與人工栽培方法(組培法)，具體驗方法如下：1、配子體的生長

取成熟的香鱗毛蕨的孢子置于1.5ml離心管內，滴入無菌水，充分振蕩使成懸浮液，4000r/min離心1min，使孢子全部沉淀，棄去上清液。離心管內再滴入約1.0ml的0.1％hgcl2溶液，滅菌1min，無菌水沖洗4～5次，用上述離心方法獲得無菌的孢子懸浮液。

固體培養基采用1/2ms，蔗糖濃度為3.0％，瓊脂濃度為0.7％-0.8％。培養基分裝三角瓶中，高壓滅菌(121℃、20min)后備用。

液體培養基培養是將改良knop′s液體培養基直接分裝在三角瓶中，高壓滅菌(121℃、20min)后備用。

土壤基質是已高壓滅菌(121℃、20min)的草炭土和蛭石以體積比3：1的比例配制而成，分裝在塑料缽中備用。

將獲得的無菌孢子懸浮液接種于改良的knop′s培養基中先黑暗處理同步萌發后進行培養，待配子體階段將其接種于1/2ms+3.0％蔗糖+0.8％瓊脂的培養基中進行培養15d。

2、孢子體的誘導

將獲得的組培香鱗毛蕨配子體用鑷子小心地從瓶中移出,并將附著的培養基用22℃±5℃的清水洗凈,移入到盛有土壤基質的塑料缽(編號為a0-a6)中培養60d。土壤基質為草炭土和蛭石以3：1的比例配制而成。實驗采用單因素隨機區組設計,設6個處理：a0塑料缽中栽有3株組培香鱗毛蕨配子體，無水蕨配子體。a1塑料缽中栽有3株組培香鱗毛蕨配子體和1株水蕨配子體。a2塑料缽中栽有3株組培香鱗毛蕨配子體和2株水蕨配子體。a3塑料缽中栽有3株組培香鱗毛蕨配子體和3株水蕨配子體。a4塑料缽中栽有3株組培香鱗毛蕨配子體和4株水蕨配子體。a5塑料缽中栽有3株組培香鱗毛蕨配子體和5株水蕨配子體。每個處理做3次重復，用蒸餾水澆透基質,塑料薄膜罩住保濕,于22℃±5℃內培養。統計香鱗毛蕨孢子體誘導率，如表1所示。通過香鱗毛蕨配子體誘導的香鱗毛蕨幼苗如圖1所示，組培香鱗毛蕨配子體誘導的香鱗毛蕨幼苗如圖2所示，大量培養香鱗毛蕨孢子體如圖4所示。

表1組培苗長成孢子體的對比

從表1可以看出，本發明方法采用不同數量的水蕨配子體同香鱗毛蕨組培配子體伴生，均長出孢子體。發現1-3株水蕨配子體對香鱗毛蕨孢子體的形成效果顯著，誘導率高達66.67％。其中2株水蕨配子體與香鱗毛蕨組培配子體伴生時，孢子體生長數量最多，沒有水蕨配子體伴生的孢子體生長數量最少，實驗組與對照組結果對比明顯，表明水蕨對香鱗毛蕨孢子體的生長起到一定的促進作用。香鱗毛蕨與水蕨共同培養的實驗組和對照組相比，誘導時間縮短了30d，誘導數目增加1倍，生長速率提高25.00％。

實施例2

本實施例提供了一種香鱗毛蕨的工廠化育苗與人工栽培方法(土培法)，具體驗方法如下：1、配子體的生長

取成熟的香鱗毛蕨的孢子置于1.5ml離心管內，滴入無菌水，充分振蕩使成懸浮液，4000r/min離心1min，使孢子全部沉淀，棄去上清液。離心管內再滴入約1.0ml的0.1％hgcl2溶液，滅菌1min，無菌水沖洗4～5次，用上述離心方法獲得無菌的孢子懸浮液。

土壤基質是已高壓滅菌(121℃、20min)的草炭土和蛭石以體積比3：1的比例配制而成，分裝在塑料缽中備用。

將獲得的孢子懸浮液接種于盛有土壤基質的塑料缽中進行培養，向土壤基質中澆水至土壤潮濕，塑料薄膜蓋住整個容器保濕，于22℃±5℃培養45d。獲得成熟的香鱗毛蕨配子體。3、孢子體的誘導

將獲得的香鱗毛蕨配子體移入盛有移栽基質的軟塑料缽中，采用單因素隨機區組設計，同樣也設計6個處理：b0塑料缽中栽有3株土培香鱗毛蕨配子體，無水蕨配子體。b1塑料缽中栽有3株土培香鱗毛蕨配子體和1株水蕨配子體。b2塑料缽中栽有3株土培香鱗毛蕨配子體和2株水蕨配子體。b3塑料缽中栽有3株土培香鱗毛蕨配子體和3株水蕨配子體。b4塑料缽中栽有3株土培香鱗毛蕨配子體和4株水蕨配子體。b5塑料缽中栽有3株土培香鱗毛蕨配子體和5株水蕨配子體。每個處理做3次重復，用蒸餾水澆透基質,塑料薄膜罩住保濕,于22℃±5℃培養。統計香鱗毛蕨孢子體誘導率。結果如表2所示。通過香鱗毛蕨配子體誘導的香鱗毛蕨幼苗如圖1所示，土培香鱗毛蕨配子體誘導的香鱗毛蕨幼苗如圖3所示，大量培養香鱗毛蕨孢子體如圖4所示。

表2土培苗長成孢子體的對比

從表2可以看出，本發明方法采用不同數量的水蕨配子體同香鱗毛蕨土培配子體伴生，均長出孢子體。發現1-3株水蕨配子體對香鱗毛蕨孢子體的形成效果顯著，誘導率高達86.67％。其中3株水蕨配子體與香鱗毛蕨組培配子體伴生時，孢子體生長數量最多，5株水蕨配子體伴生的孢子體生長數量最少，表明過多的水蕨會影響香鱗毛蕨孢子體的形成，優選1-3株水蕨與香鱗毛蕨伴生。實驗組與對照組結果對比明顯，表明水蕨對香鱗毛蕨孢子體的生長起到一定的促進作用。香鱗毛蕨與水蕨共同培養的實驗組和對照組相比，誘導時間縮短了30d，誘導數目增加1倍，生長速率提高25.00％。

本發明方法克服了通過組織培養和土壤培養誘導孢子體的過程周期較長，且野生的香鱗毛蕨在誘導過程中容易死亡的問題，實現香鱗毛蕨孢子體的工廠化生產，并為實現香鱗毛蕨孢子體的大規模生產提供了有力的技術支持。

雖然本發明已以較佳的實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可以做各種改動和修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。