本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中植物組織培養(yǎng)的方法，具體地說，涉及一種嶺南藥食同源植物三叉苦的快速繁殖方法。

背景技術(shù)：

三叉苦(melicopepteleifolia(championexbentham)hartley)，又名三椏苦、三丫苦、三叉虎、斑鳩花、三支槍、三腳鱉等，為蕓香科蜜茱萸屬藥用植物，最早記載于《嶺南采藥錄》，是嶺南地區(qū)常用的中草藥，常用來治療跌打損傷、膿瘡、濕疹等疾病。三叉苦具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、消腫止痛等功效，常用于咽喉腫痛、瘧疾、黃疸型肝炎、風(fēng)濕骨痛、濕疹、皮炎、瘡瘍等疾病的治療，目前己被廣泛應(yīng)用于中成藥品中，如三九感冒靈顆粒、三九胃泰、三金片等。同時，三叉苦又是一種常用的藥食同源植物，具有較高的食用價值，作為廣東涼茶的重要原料約有100余年的歷史。三叉苦作為一種應(yīng)用比較廣泛的民族藥，具有一定的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)，有著廣泛的應(yīng)用前景和開發(fā)利用價值。

三叉苦在我國主要分布于廣東、廣西、海南、福建、臺灣、貴州和云南等省區(qū)，四川和重慶等地區(qū)有少量分布，常見于丘陵、平原、溪邊和林緣的灌木叢。目前，三叉苦基本上處于野生狀態(tài)，野生三叉苦質(zhì)量較好，價格不斷上揚(yáng)，致其野生資源被過度采割，為了防止三叉苦資源的匱乏和滿足未來對其開發(fā)利用的需要，人工大面積栽培勢在必行。三叉苦主要采用種子和扦插繁殖，但由于三叉苦種子硬實(shí)，發(fā)芽率低，而扦插繁殖存在周期長、繁殖系數(shù)低等缺點(diǎn)，建立三叉苦的組培快繁技術(shù)已成為大面積規(guī)模化種植首要解決的技術(shù)。因此，本發(fā)明選擇野生三叉苦新生營養(yǎng)芽為外植體，經(jīng)誘導(dǎo)、增殖、生根以及移栽等步驟，實(shí)現(xiàn)了三叉苦的快速繁殖。本發(fā)明具工藝簡便、易操作、繁殖系數(shù)高、成苗快等特點(diǎn)，可直接用于三叉苦的產(chǎn)業(yè)化繁育，對于三叉苦的遺傳改良、種質(zhì)資源保護(hù)、促進(jìn)資源的可待續(xù)利用具有重要意義。

目前，國內(nèi)外尚未有三叉苦組織培養(yǎng)技術(shù)的報(bào)道，也未有三叉苦組培快繁專利的申請。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種嶺南藥食同源植物三叉苦的快速繁殖方法，本發(fā)明選擇野生三叉苦新生營養(yǎng)芽為外植體，經(jīng)誘導(dǎo)、增殖、生根以及移栽等步驟，實(shí)現(xiàn)了三叉苦的快速繁殖，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：一種嶺南藥食同源植物三叉苦的快速繁殖方法，其特征在于：包括依次進(jìn)行的如下步驟：獲取三叉苦植株的外植體、不定芽誘導(dǎo)、不定芽的增殖培養(yǎng)、不定芽的生根培養(yǎng)、試管苗移栽；

所述的不定芽誘導(dǎo)的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括：nitsch培養(yǎng)基、1.0～3.0mg/l6-ba、0.5～1.0mg/lnaa、0.01～0.05mg/ltdz、25～30g/l蔗糖、3.5～6.0g/l瓊脂、0.1～0.3g/l活性炭，ph為5.4～5.8。

在上述的嶺南藥食同源植物三叉苦的快速繁殖方法中，所述的不定芽誘導(dǎo)的方法為：將三叉苦的外植體清洗消毒后剪切成1.0～1.5cm左右的帶節(jié)莖段并接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中在25～28℃進(jìn)行全暗培養(yǎng)45～60天即可誘導(dǎo)形成不定芽。

在上述的嶺南藥食同源植物三叉苦的快速繁殖方法中，不定芽的增殖培養(yǎng)所用的不定芽增殖培養(yǎng)基包括：nitsch培養(yǎng)基、1.0～1.5mg/l6-ba、0.5～1.0mg/lnaa、15～30g/l蔗糖、3.5～6.0g/l瓊脂、0.2～0.5g/l活性炭，ph為5.4～5.8。

在上述的嶺南藥食同源植物三叉苦的快速繁殖方法中，所述的不定芽的增殖培養(yǎng)的方法為：將經(jīng)過不定芽誘導(dǎo)得到的不定芽切成長約1～2cm的莖段并接種到不定芽增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)35～40天即可實(shí)現(xiàn)不定芽的增殖培養(yǎng)。

在上述的嶺南藥食同源植物三叉苦的快速繁殖方法中，不定芽的生根培養(yǎng)所用的生根培養(yǎng)基包括：nitsch培養(yǎng)基、0.5～1.0mg/liba、1.0～2.0mg/lnaa、15～30g/l蔗糖、3.5～6.0g/l瓊脂、0.1～0.2g/l活性炭，ph為5.4～5.8。

在上述的嶺南藥食同源植物三叉苦的快速繁殖方法中，所述的不定芽的生根培養(yǎng)的方法為：將切取經(jīng)過增殖培養(yǎng)得到的長約2～3cm的不定芽并接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)25～30天即能實(shí)現(xiàn)試管苗的生根。

在上述的嶺南藥食同源植物三叉苦的快速繁殖方法中，所述的試管苗移栽的方法為：將健壯的試管苗在溫室的自然光下煉苗1～3天，洗凈根部的培養(yǎng)基移栽于體積比為1:1:1:1的泥炭土、腐殖土、紅泥土、河沙的混合基質(zhì)中栽培成苗即得種苗。

在上述的嶺南藥食同源植物三叉苦的快速繁殖方法中，所述的不定芽誘導(dǎo)、不定芽的增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)條件均為：培養(yǎng)溫度為25～28℃，光照強(qiáng)度為2000～3000lx，光照時間為10～12小時/天。

在上述的嶺南藥食同源植物三叉苦的快速繁殖方法中，獲取三叉苦植株的外植體的具體方法為：秋季時節(jié)，在野外選取生長健壯的三叉苦植株，于根部離地面約5～10cm處進(jìn)行環(huán)割以便來年春季生成新生營養(yǎng)芽；

春季，當(dāng)三叉苦植株環(huán)割處營養(yǎng)芽生成時，用無菌解剖刀從基部切取營養(yǎng)芽并進(jìn)行簡單保濕保水處理。

有益效果：

本發(fā)明利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了嶺南藥食同源植物三叉苦的快速繁殖，本發(fā)明具工藝簡便、易操作、繁殖系數(shù)高、成苗快等特點(diǎn)，可直接用于三叉苦的產(chǎn)業(yè)化繁育，通過本發(fā)明育成的三叉苦試管苗移栽成活率達(dá)到95％以上，可解決三叉苦的大面積規(guī)?；N植中存在種苗缺乏的問題。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。

實(shí)施例一

(1)外植體準(zhǔn)備：2014年秋季時節(jié)，在野外選取生長健壯的三叉苦植株，于根部離地面約5cm處進(jìn)行環(huán)割處理，2015年春季環(huán)割處生成了6～9個新生營養(yǎng)芽。

(2)外植體采集：春季，當(dāng)步驟(1)處理的三叉苦植株環(huán)割處營養(yǎng)芽生成時，用無菌解剖刀從基部切取營養(yǎng)芽并進(jìn)行簡單保濕保水處理后及時帶回實(shí)驗(yàn)室。

(3)不定芽誘導(dǎo)：將采取回實(shí)驗(yàn)室的外植體先在自來水沖洗過夜后于超凈工作臺中于75％的乙醇溶液中消毒15秒，無菌水沖洗2次后用無菌濾紙吸干水分后，再置于0.1％的升汞溶液中消毒10分鐘，無菌水沖洗3次后用無菌濾紙吸干水分后剪切成1.0～1.5cm左右的帶節(jié)莖段并接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中在25℃進(jìn)行全暗培養(yǎng)45天即可誘導(dǎo)形成不定芽，誘導(dǎo)率為87.3％，污染率低于15％。所述的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：nitsch培養(yǎng)基+3.0mg/l6-ba+1.0mg/lnaa+0.05mg/ltdz(n-苯基-n’-1,2,3-噻二唑-5-脲)+25g/l蔗糖+3.5g/l瓊脂+0.1g/l活性炭，ph為5.4。

(4)增殖培養(yǎng)：將步驟(3)所得的不定芽切成長約1～2cm的莖段并接種到不定芽增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)35天即可實(shí)現(xiàn)不定芽的增殖培養(yǎng)，增殖系數(shù)達(dá)10倍。所述的不定芽增殖培養(yǎng)基為：nitsch培養(yǎng)基+1.5mg/l6-ba+1.0mg/lnaa+15g/l蔗糖+3.5g/l瓊脂+0.2g/l活性炭，ph為5.4。

(5)生根培養(yǎng)：切取步驟(4)增殖得到的長約2～3cm的不定芽并接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)25天即能實(shí)現(xiàn)試管苗的生根，生根率達(dá)到94.8％。所述的生根培養(yǎng)基為：nitsch培養(yǎng)基+1.0mg/liba+2.0mg/lnaa+15g/l蔗糖+3.5g/l瓊脂+0.1g/l活性炭，ph為5.4。

(6)移栽：將步驟(5)得到的健壯的試管苗在溫室的自然光下煉苗1天，洗凈根部的培養(yǎng)基移栽于體積比為1:1:1:1的泥炭土、腐殖土、紅泥土、河沙的混合基質(zhì)中栽培成苗即得種苗，移栽30天后成活率達(dá)到98.1％。

上述步驟(3)～(4)的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為25℃，光照強(qiáng)度為2000lx，光照時間為10小時/天。

實(shí)施例二

(1)外植體準(zhǔn)備：2015年秋季時節(jié)，在野外選取生長健壯的三叉苦植株，于根部離地面約8cm處進(jìn)行環(huán)割處理，2016年春季在環(huán)割處理處生成了6～7個新生營養(yǎng)芽。

(2)外植體采集：2016年春季，當(dāng)步驟(1)處理的三叉苦植株環(huán)割處營養(yǎng)芽生成時，用無菌解剖刀從基部切取營養(yǎng)芽并進(jìn)行簡單保濕保水處理后及時帶回實(shí)驗(yàn)室。

(3)不定芽誘導(dǎo)：將采取回實(shí)驗(yàn)室的外植體先在自來水沖洗過夜后于超凈工作臺中于75％的乙醇溶液中消毒23秒，無菌水沖洗3次后用無菌濾紙吸干水分后，再置于0.1％的升汞溶液中消毒13分鐘，無菌水沖洗4次后用無菌濾紙吸干水分后剪切成1.0～1.5cm左右的帶節(jié)莖段并接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中在26℃進(jìn)行全暗培養(yǎng)52天即可誘導(dǎo)形成不定芽，誘導(dǎo)率達(dá)到90.5％，污染率低于10％。所述的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：nitsch培養(yǎng)基+2.0mg/l6-ba+0.8mg/lnaa+0.03mg/ltdz(n-苯基-n’-1,2,3-噻二唑-5-脲)+27g/l蔗糖+4.0g/l瓊脂+0.2g/l活性炭，ph為5.6。

(4)增殖培養(yǎng)：將步驟(3)所得的不定芽切成長約1～2cm的莖段并接種到不定芽增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)37天即可實(shí)現(xiàn)不定芽的增殖培養(yǎng)，增殖系數(shù)達(dá)到7.9倍。所述的不定芽增殖培養(yǎng)基為：nitsch培養(yǎng)基+1.3mg/l6-ba+0.7mg/lnaa+23g/l蔗糖+4.0g/l瓊脂+0.3g/l活性炭，ph為5.6。

(5)生根培養(yǎng)：切取步驟(4)增殖得到的長約2～3cm的不定芽并接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)28天即能實(shí)現(xiàn)試管苗的生根，生根率達(dá)到93.8％。所述的生根培養(yǎng)基為：nitsch培養(yǎng)基+0.7mg/liba+1.5mg/lnaa+23g/l蔗糖+4.0g/l瓊脂+0.15g/l活性炭，ph為5.6。

(6)移栽：將步驟(5)得到的健壯的試管苗在溫室的自然光下煉苗2天，洗凈根部的培養(yǎng)基移栽于體積比為1:1:1:1的泥炭土、腐殖土、紅泥土、河沙的混合基質(zhì)中栽培成苗即得種苗,移栽30天后成活率達(dá)到97.8％。

上述步驟(3)～(4)的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為26℃，光照強(qiáng)度為2500lx，光照時間為11小時/天。

實(shí)施例三

(1)外植體準(zhǔn)備：2015年秋季時節(jié)，在野外選取生長健壯的三叉苦植株，于根部離地面約10cm處進(jìn)行環(huán)割，2016年春季在環(huán)割處理處生成了5～6個新生營養(yǎng)芽。

(2)外植體采集：2016年春季，當(dāng)步驟(1)處理的三叉苦植株環(huán)割處營養(yǎng)芽生成時，用無菌解剖刀從基部切取營養(yǎng)芽并進(jìn)行簡單保濕保水處理后及時帶回實(shí)驗(yàn)室。

(3)不定芽誘導(dǎo)：將采取回實(shí)驗(yàn)室的外植體先在自來水沖洗過夜后于超凈工作臺中于75％的乙醇溶液中消毒30秒，無菌水沖洗3次后用無菌濾紙吸干水分后，再置于0.1％的升汞溶液中消毒15分鐘，無菌水沖洗5次后用無菌濾紙吸干水分后剪切成1.0～1.5cm左右的帶節(jié)莖段并接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中在28℃進(jìn)行全暗培養(yǎng)60天即可誘導(dǎo)形成不定芽，誘導(dǎo)率為83.6％，污染率低5％。所述的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：nitsch培養(yǎng)基+1.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+0.01mg/ltdz(n-苯基-n’-1,2,3-噻二唑-5-脲)+30g/l蔗糖+6.0g/l瓊脂+0.3g/l活性炭，ph為5.8。

(4)增殖培養(yǎng)：將步驟(3)所得的不定芽切成長約1～2cm的莖段并接種到不定芽增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)40天即可實(shí)現(xiàn)不定芽的增殖培養(yǎng)，增殖系數(shù)達(dá)到8.2倍。所述的不定芽增殖培養(yǎng)基為：nitsch培養(yǎng)基+1.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+6.0g/l瓊脂+0.5g/l活性炭，ph為5.8。

(5)生根培養(yǎng)：切取步驟(4)增殖得到的長約2～3cm的不定芽并接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天即能實(shí)現(xiàn)試管苗的生根,生根率為90.5％。所述的生根培養(yǎng)基為：nitsch培養(yǎng)基+0.5mg/liba+1.0mg/lnaa+30g/l蔗糖+6.0g/l瓊脂+0.2g/l活性炭，ph為5.8。

(6)移栽：將步驟(5)得到的健壯的試管苗在溫室的自然光下煉苗3天，洗凈根部的培養(yǎng)基移栽于體積比為1:1:1:1的泥炭土、腐殖土、紅泥土、河沙的混合基質(zhì)中栽培成苗即得種苗，移栽30天成活率為95.7％。

上述步驟(3)～(4)的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為28℃，光照強(qiáng)度為3000lx，光照時間為12小時/天。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其它的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。