本發明涉及細胞生物學領域，具體地說，涉及在常溫條件下將能聚集成團的細胞包括干細胞保存，運輸和使用，并保證其存活率和生物活性的方法。

背景技術：

細胞是生命的基本單位，人體即是由200多種細胞組成的，例如心肌細胞，血細胞和干細胞。干細胞是擁有自我更新和分化能力的細胞。例如間充質干細胞是一種來自中胚層的細胞，廣泛存在于骨髓，脂肪，結締組織，臍帶和胎盤等成體和胎兒組織中。間充質干細胞具有自我更新功能并且能夠在特定條件下分化成為骨，軟骨，肌肉，脂肪，甚至神經和肝細胞等。另外，間充質干細胞還有低免疫原性，可以調節免疫和滋養其它細胞。間充質干細胞目前已被廣泛應用于臨床實驗治療自身免疫性疾病（如紅斑狼瘡，多發性硬化和類風濕性關節炎等），移植物抗宿主病，肝病和神經退行性疾病（如帕金森氏病和阿爾斯海默病）等，并取得顯著療效。間充質干細胞可以從骨髓，臍帶，脂肪和牙髓等組織中提取，也可以由多能干細胞直接分化而來。這兩種方法都依賴高標準實驗室的特定設備（如萬級超凈臺，恒溫恒濕培養箱和各種高純氣體及培養箱）來制備，維持和質量控制。而這些條件并不是普通醫療機構所能滿足的。所以，用于治療的干細胞產品常常需要在生產機構和醫療機構之間跨越一定的地理范圍進行長時間的運輸。

來自哺乳類包括人類的細胞必須培養在保證37oc恒溫以及適宜的濕度，氧氣和二氧化碳濃度的培養箱中。若長時間（比如超過24小時）暴露在大氣溫度和濕度以及不適宜的氧氣和二氧化碳濃度，這些細胞會逐漸失去功能和活性，最終死亡。故此，對于超過24小時的長度運輸，往往需要將細胞鋪滿在培養瓶中并充滿培養基，將該培養瓶置于37oc恒溫手提箱或者常溫下貼身運輸。但是這種方式有多重問題：

1.運輸的細胞量有限。

2.容易造成細胞的活性降低和逐漸死亡。

3.消耗大量昂貴的培養基，例如充滿一個25毫升的培養瓶約需要35毫升培養基。

故此，上述方法常常只用于短途運輸小量細胞。細胞的長途運輸通常需要冷凍遞送，即先將細胞凍存于冷凍管中，將該冷凍管置于干冰盒或液氮制冷后的冷凍罐中輸送至目的地后，再解凍復蘇數天，在細胞恢復活力后才能使用。運輸途中每隔限定時間還需要添加干冰，費用十分昂貴。并且冷凍設備也很難搭乘飛機和高鐵等交通工具，過海關需要繁雜的手續和證明材料。一旦在路途中干冰消耗殆盡或冷凍罐升溫細胞將會凍融而迅速死亡。因此，開發一種可以將細胞在常溫下儲存和運輸的方法將極大地簡化細胞運輸，促進細胞的科研和臨床應用。

近來，有研究者將脂肪來源的干細胞包裹在海藻糖中運輸，這種方法可以在72小時內保證干細胞的活力在70%左右。但是這種方法的不便之處在于，首先需要制備天然來源的海藻糖，并將其按照特定的比例混合，在一定的條件下制備成型。在運輸結束使用該細胞時，還需要經過數個步驟的處理，將海藻糖這種異類添加劑去除并純化干細胞和恢復其活性。故此，該方法繁瑣，耗時，而且細胞活力低，維持時間段。

本發明提供一種在常溫下將細胞進行保存及運輸的方法。本發明方法不同于以往的任何方法，利用細胞自身聚集成團的特性，降低其增殖和代謝速率，可以在常溫條件下保存7-10天之久而維持細胞的活力和生物活性不變。整個儲存和運輸過程無需維持特定的溫度，濕度和氣體濃度。無后續分離和純化細胞的必要。滿足不同密度和不同規模的細胞的儲存和運輸。本發明可以直接應用于細胞尤其是干細胞的科學研究和應用，具有可觀的科學和社會經濟效益。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種在常溫條件下對干細胞進行保存和運輸并可以高效保證其存活率和生物活性地方法。

為了實現本發明目的，具體包括以下四個步驟：

步驟一，干細胞團塊形成步驟，首先制備懸浮培養液，利用干細胞具有形成球狀體的性能，在懸浮培養條件下，使干細胞自發聚集，形成團塊，團塊形成后，由于細胞接觸抑制原理，在細胞高密度的團塊中干細胞自然的降低其增殖和新陳代謝速率，達到了降低耗氧量和消耗營養物質的目的；

步驟二，干細胞團塊培養步驟，制備活性能量液體培養基質，將已形成的干細胞團塊懸浮于所述的活性能量液體培養基質中形成干細胞團塊制品，所說的活性能量培養基可以保證干細胞團塊的最基本的能量，營養維持需要和適宜的酸堿度，并可以減少在運輸途中應對顛簸造成的應力損傷；

步驟三，干細胞團塊制品封裝運輸步驟，為使干細胞在常溫條件下滿足長途運輸的需要，所述的干細胞團塊制品被封裝至塑料容器以實現高密度大規模的運輸，經過封裝后的干細胞制品在整個運輸過程無需特定的溫度和氣體維持設備，在常溫條件下即可實現運輸；

步驟四：干細胞團塊基質去除步驟，在細胞運輸到目的地（如醫院，科研院所等）后，通過離心裝置可以除去基質，實現干細胞和所述培養基質的分離，收集到的干細胞在7天內具有超過90%的存活率和完全的生物功能，可以直接運用。

優選地，在所述的干細胞團塊化形成步驟，所述的干細胞團塊形成可以采用u/v型超低吸附培養板或者懸滴法，根據不同的干細胞數目制備不同大小規格的細胞團塊，形成干細胞均勻球體；

優選的，干細胞團塊的球體大小的直徑介于50微米－500微米。

優選的，干細胞團塊形成方法采用超低吸附培養板或者玻璃培養瓶時，直接將干細胞以高密度的條件下直接鋪于板中或培養皿中低速攪拌，使其自發形成大小不一的團塊。干細胞團塊化通常需要在37度培養箱（5%二氧化碳和大于80%的濕度）中培養24小時完成。

優選地，在所述干細胞團塊培養步驟，所述的干細胞活性能量液體培養基質為液體基質和增粘劑混和制成。。液體基質為任何種類細胞培養基，含有基礎的養分和酸堿平衡系統，優選為干細胞培養基，成分包括dmem低糖培養基，20%血清替代物（knockoutofserumreplement），1%非必需氨基酸，5%l－谷氨酰胺。所述增粘劑為食用級添加劑，可以提高液體的粘稠度，優選為甲基纖維素（methylcellulose），優選使用濃度為0.2%－0.5%.食用級增粘劑，不會產生生物毒性，可代謝，無殘留，安全性高，使用方便，可以使干細胞團塊在運輸途中減少顛簸造成的應力損傷。

優選地，在所述的干細胞封裝運輸步驟中，所述的將干細胞團塊制品封裝保存的塑料密封容器為聚乙烯、聚丙烯或密胺等原料制成塑料容器，所述的干細胞的封裝密度為100萬－1000萬細胞每毫升的保存基質。封裝時避免混入氣體產生氣泡。在運輸途中，只需將細胞容器置于常溫下即可，溫度范圍為10度－35度，避免強光照射。

優選地，在所述的干細胞團塊基質去除步驟，當采用本方法運輸的干細胞團塊制品被運輸到目的地后，可以將干細胞團塊應用0.25%胰蛋白酶消化成單細胞重新置于37度培養箱中恢復增殖；或不消化，直接鋪板，間充質干細胞團塊可以自我解散，貼壁生長；或將其離心，去除保存基質，直接應用于組織再生移植或者免疫治療。

本發明的另一目的是提供一種在常溫條件下對干細胞進行保存和運輸并可以高效保證其存活率和生物活性地的活性能量基質，所述的活性能量基質，基質為液體基質和增粘劑混和制成。液體基質為任何種類細胞培養基，含有基礎的養分和酸堿平衡系統，優選為干細胞培養基，成分包括dmem低糖培養基，20%血清替代物（knockoutofserumreplement），1%非必需氨基酸，5%l－谷氨酰胺。所述增粘劑為食用級添加劑，可以提高液體的粘稠度，優選為甲基纖維素（methylcellulose），優選使用濃度為0.2%－0.5%.食用級增粘劑，不會產生生物毒性，可代謝，無殘留，安全性高，使用方便，可以使干細胞團塊在運輸途中減少顛簸造成的應力損傷。

本發明的有益效果是依本方法常溫存儲7天的間充質干細胞在恢復常規培養條件后仍具有一下特征和活性：

1.和普通培養的間充質干細胞相比，有相似的生長速率，更低的老化程度和相似的生物功能，包括定向分化為各種組織（骨，軟骨和脂肪）的能力和免疫調節功能。

2.在體外實驗中與普通培養的間充質干細胞一樣具有抑制淋巴細胞增殖的能力。

3.在由化學物質導致的兩種小鼠腸炎實驗模型中，能有效保護腸道損傷和體重削減；病檢顯示移植細胞可以遷移到受損的腸道組織中，抑制炎性反應并促進受損腸壁的組織再生。

本發明提供的方法不僅可以應用在間充質干細胞（骨髓來源和多能干細胞分化來源）上，也可以直接應用在多能干細胞和其他干細胞種類上，例如脂肪干細胞，肌肉干細胞和神經干細胞等，但依不同細胞其儲存培養基各異，儲存時間也可能長短不一。本發明提供的方法和基質可以保證干細胞在常溫條件下7-10天后的存活率高達90%，在恢復常規培養條件后，其仍具有和正常對照細胞相似的生長速率，更低的老化程度和相似的生物功能，包括定向分化為各種組織（骨，軟骨和脂肪）的能力和免疫調節功能，在體外實驗中與對照細胞具有相似的抑制淋巴細胞增殖的能力，并且在由化學物質導致的兩種小鼠腸炎實驗模型中，有效的保護了腸道損傷和體重削減。病理切片證明，直接應用本發明方法在常溫下保存7天的間充質干細胞可以遷移到受損的腸道組織中，抑制炎性反應并促進受損腸壁的組織再生。本發明方法不僅可以應用在間充質干細胞（骨髓來源和多能干細胞分化來源）上，也可以直接應用在多能干細胞和神經前體細胞上。多能干細胞運用本發明方法在常溫下保存4天后仍具有85%的存活率，正常的染色體組，正常的細胞周期，表觀遺傳特征和多向分化潛能，恢復正常培養后其細胞周期和多向分化潛能與普通培養的人多能干細胞沒有差別。神經前體細胞多能干細胞運用本發明方法在常溫下保存6天后仍具有與對照組相似的形態，功能和表觀遺傳特征。本發明方法簡單可靠，價格低廉，穩定高效，安全性高，可以直接用于干細胞生物和醫療科學研究，免疫性疾病和退行性疾病的細胞治療，組織器官損傷的細胞移植以及藥物篩選的應用需求，推廣使用后具有可觀的社會經濟效益。

1．

附圖說明

圖1為實施例一的間充質干細胞聚集成球后在常溫條件（ac）下可維持高存活率的圖示,其中，

附圖1a所示為來自人胚干細胞的間充質干細胞（emsc）ac耐受實驗流程。單層培養的emsc和emsc球均在ac下放置7天，分別命名為(emscml-ac/d7和emscsp-ac/d7)。細胞球離散后利用ao/pi測定細胞存活率或者直接鋪回平面培養(emscsp-ac/d7-ml)。ac下單層培養的emscml-ac/d7作為陰性對照。標尺:400微米。

附圖1b的圖示為經過或沒有經過ac的干細胞球切片及h&e染色。標尺:200微米.

附圖1c所示為干細胞球和離散的干細胞懸液（emscdissoc）在ac下放置7天和9天的存活率。**p<0.01為顯著性差異。

附圖1d的圖示為利用細胞表面凋亡標記物（annexinv+）和核標記物（pi+）檢測干細胞球和單層培養干細胞在ac下的凋亡情況。

圖2在常溫條件（ac）下保存7天的間充質干細胞球對大腸炎小鼠仍有療效的圖示，其中，

附圖2a-2c所示為在ac下以細胞球形式保存7天后重新恢復單層培養的骨髓間充質干細胞（bmsc）（bmscsp-ac/d7-ml）與正常培養的同株骨髓間充質干細胞（bmscsibling）均能抑制由dss誘導的c57bl/6大腸炎。附圖2a為大腸炎小鼠的體重變化。*p<0.05。

附圖2b和附圖2c病患小鼠的直腸長度與病理組織學評分。p<0.05在(b)標為a,b,和c，在附圖2c標為*。

附圖2d-2f所示為bmscsp-ac/d7-ml與bmscsibling均能抑制由三硝基苯磺酸（tnbs）誘導的balb/c小鼠大腸炎。附圖2d為大腸炎小鼠的體重變化。*p<0.05,**p<0.01。

附圖2e和2f病患小鼠的直腸長度與病理組織學評分。p<0.05在(e)標為a,b,和c，在附圖2f標為*。

附圖2g所示為在ac下保存7天后的emsc球直接注入balb/c小鼠腹腔內，可以顯著減輕由tnbs誘導的大腸炎導致的體重減輕。單層培養的同株干細胞emscsibling和pbs作為對照。

附圖2h在ac下保存7天后的emsc球釋放單個細胞(見綠色螢光蛋白gfp陽性細胞)遷移到腸上皮并促進局部細胞增殖（見紅色的ki-67陽性細胞）。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例來解釋本發明的發明內容，本發明所采用的實施例僅用于解釋本發明的

內容，并不用于限制本發明。

實施例一

本發明提供了一種在常溫條件下的干細胞保存和運輸方法，其特征在于所述的方法包括以下四個步驟；步驟一，干細胞團塊形成步驟，制備懸浮培養液，在懸浮培養條件下，使干細胞自發聚集，形成團塊；步驟二，干細胞團塊培養步驟，制備活性能量液體培養基質，將步驟一形成的干細胞團塊置于所述活性能量液體培養基質中形成干細胞團塊制品；步驟三，干細胞團塊制品封裝運輸步驟，在常溫條件將所述的干細胞團塊制品封裝塑料容器中以實現高密度大規模的運輸；步驟四,干細胞團塊基質去除步驟，在細胞運輸到目的地后，通過消化法、自然法或離心法去除基質，實現干細胞所述培養基質的分離。具體的，將結合附圖1將對間充質干細胞聚集成球狀后在室溫下保存7天仍具有高活率進行說明。

實驗采用間充質干細胞兩株（一株由人胚干細胞株ct3細胞分化而來，另一株由捐贈的人骨髓分離而來）用于驗證實驗。兩株細胞均生長于正常的細胞培養環境（37攝氏度，5%二氧化碳，90%濕度）至大約80%融合度即可進行實驗，具體的實驗步驟如下：

步驟一：在間充質干細胞團塊形成步驟，制備干細胞懸浮培養液，在懸浮培養條件下，使干細胞自發聚集，形成團塊；

步驟二：干細胞團塊培養步驟，制備活性能量液體培養基質，將步驟一形成的干細胞團塊置于所述活性能量液體培養基質中形成干細胞團塊制品，包括以下子步驟：

1.將細胞取出，去除培養基，用生理鹽水（pbs）清洗2遍；

2.用0.05%胰蛋白酶消化3分鐘；

3.制備活性能量培養基質做為間充質干細胞培養基質，本實驗中的活性能量培養基質的百分比構成為：低糖dmem，20%血清，1%非必需氨基酸，5%l-谷氨酰胺，混勻后離心收集細胞；

4.再混勻于新鮮培養基中，調整細胞濃度至每毫升8×105個細胞；

5.利用懸滴法制備干細胞球，每滴25微升按陣列均勻滴于10cm培養皿中；

6.將蓋好的培養皿放入培養箱，在正常細胞培養環境下培養48小時；

7.加入10毫升培養基混勻所有懸滴并收集懸液，于1000rpm離心3分鐘，去除上清；

8.將細胞球混懸在新鮮培養基中，調整細胞密度為每毫升500萬細胞。

然后進入步驟三：干細胞團塊制品封裝運輸步驟：

將細胞球懸液加入1.5毫升塑料離心管中，加入新鮮培養基至管口，石蠟膜封口，避光保存，

記為第0天，室溫下（18-25度）保存7天；之后，進入步驟四：干細胞團塊基質去除步驟，并對干細胞活性進行檢測，包括以下子步驟：

1.在封裝后的第7天，收集細胞球懸液于15毫升塑料離心管中，于1000rpm離心3分鐘去除上清，即對干細胞團塊進行去除基質，pbs清洗2遍；

2.用0.05%胰蛋白酶消化3分鐘；

3.用間充質干細胞培養基重懸細胞，鋪板于培養皿后返回培養箱正常培養環境下單層培養；

4.收集的細胞球也可重懸后繼續培養，用于實驗檢測，動物實驗或臨床應用。

如附圖1所示，間充質干細胞聚集成球后在常溫條件（ac）下可維持高存活率的圖示，其中：

附圖1a所示為來自人胚干細胞的間充質干細胞（emsc）ac耐受實驗流程。單層培養的emsc和emsc球均在ac下放置7天，分別命名為(emscml-ac/d7和emscsp-ac/d7)。細胞球離散后利用ao/pi測定細胞存活率或者直接鋪回平面培養(emscsp-ac/d7-ml)。ac下單層培養的emscml-ac/d7作為陰性對照。標尺:400微米。

附圖1b的圖示為經過或沒有經過ac的干細胞球切片及h&e染色。標尺:200微米.

附圖1c所示為干細胞球和離散的干細胞懸液（emscdissoc）在ac下放置7天和9天的存活率。**p<0.01為顯著性差異。

附圖1d的圖示為利用細胞表面凋亡標記物（annexinv+）和核標記物（pi+）檢測干細胞球和單層培養干細胞在ac下的凋亡情況。

實驗結果表明兩株間充質干細胞利用此方法室溫保存均可維持90%以上的存活率和正常的細胞形態。整個過程如附圖1所示。

實施例二

本實施例將對應用本發明的方法對間充質干細胞球在室溫下保存7天后對結腸炎小鼠仍有療效進行說明。

將例1中的間充質干細胞球在室溫下保存7日后對6-8周齡小鼠進行實驗。利用硫酸葡聚糖鈉（dss）誘導的結腸炎模型在雌性c57bl/6小鼠上進行實驗。實驗步驟如下：

1.在飲用水中摻入2％（w/v）dss（分子量36,000-50,000，mpbiomedical）7天讓小鼠飲用。

2.將間充質干細胞球重懸在pbs中，獲得相當于1×106個細胞／100微升的濃度。

3.在dss處理開始后的第1和2天，使用帶有21號針頭的注射器給每只小鼠腹腔（i.p.）注射100微升的間充質干細胞球懸液（無球體解離）或pbs（作為陰性對照）。

4.每天監測動物癥狀和體征包括體重減輕，直腸出血和糞便稠度等。

5.所有小鼠在實驗開始后第14天co2麻醉后斷頸處死。從每只小鼠切下結腸，測量其長度。

6.用pbs沖洗結腸，然后將其浸泡在4％多聚甲醛中于4℃固定24小時。

7.將結腸的遠端部分包埋在石蠟中并切成5微米厚度。將切片安裝到載玻片上，用蘇木精和曙紅（h＆e）染色，并在olympusckx41顯微鏡上拍照。

8.基於所涉及的面積的百分比和隱窩損失，上皮的侵蝕以及其它參數計算結腸切片的組織學評分。

如附圖2中各在常溫條件（ac）下保存7天的間充質干細胞球對大腸炎小鼠仍有療效。氣質，附圖2a-2c所示為在ac下以細胞球形式保存7天后重新恢復單層培養的骨髓間充質干細胞（bmsc）（bmscsp-ac/d7-ml）與正常培養的同株骨髓間充質干細胞（bmscsibling）均能抑制由dss誘導的c57bl/6大腸炎。(a)大腸炎小鼠的體重變化。*p<0.05。(bandc)病患小鼠的直腸長度與病理組織學評分。p<0.05在(b)標為a,b,和c，在(c)標為*。

附圖2d-2f所示為bmscsp-ac/d7-ml與bmscsibling均能抑制由三硝基苯磺酸（tnbs）誘導的balb/c小鼠大腸炎。(d)大腸炎小鼠的體重變化。*p<0.05,**p<0.01。(e和f)病患小鼠的直腸長度與病理組織學評分。p<0.05在(e)標為a,b,和c，在(f)標為*。

附圖2g所示為在ac下保存7天后的emsc球直接注入balb/c小鼠腹腔內，可以顯著減輕由tnbs誘導的大腸炎導致的體重減輕。單層培養的同株干細胞emscsibling和pbs作為對照。

附圖2h在ac下保存7天后的emsc球釋放單個細胞(見綠色螢光蛋白gfp陽性細胞)遷移到腸上皮并促進局部細胞增殖（見紅色的ki-67陽性細胞）。

實驗結果表明，具體結果如圖2所示，經過室溫保存過的間充質干細胞球腹腔注射后能有效保護結腸炎小鼠的腸道損傷和體重削減。病理切片證明，注射后的間充質干細胞可以遷移到受損的腸道組織中，抑制炎性反應并促進受損腸壁的組織再生。