本發明屬植物組織培養技術領域，更具體地說，本發明涉及一種冬櫻離體快繁方法。

背景技術：

冬櫻(cerasus×parvifolia‘fuyu-zakura’)為豆櫻與大島櫻的雜交品種，成葉小，又稱小葉櫻；小喬木，寬卵狀樹形。每年開花兩次，冬花期為11月上旬至次年1月，因此而得名；春花期為3月下旬，花葉同放，花量比冬花大。傘房花序，1～4朵一束；花徑約3cm；春花的先端缺刻深，冬花的先端缺刻淺，逆突形，花梗無毛，萼筒鐘狀，紫綠色，無毛，萼片長橢圓形，全緣，無毛；花瓣5枚，白色至淡紅色。雌蕊無毛，柱頭花柱與花柱同等高度的位置。果實直徑1厘米，果黑熟有甜味。“三波川的冬櫻”被指定為“天然紀念物”。我國武漢東湖等公園有少量引種栽培，生長表現良好。一年冬春兩次，跟其他品種搭配，極大地延長了櫻花園的觀花期，開發前景廣闊。

目前，由于冬櫻的母株材料少，嫁接繁殖數量有限，遠遠滿足不了市場推廣需求，迫切需要通過組培快繁技術進行擴繁，以冬櫻成年優株為母株進行組培快繁技術研究，通過離體快繁促進冬櫻產業化開發，意義現實而重大。

經過文獻檢索，尚未見關于冬櫻組培快繁的報道。試驗表明，現發表的櫻屬植物相關種組織培養所用的配方并不適合冬櫻的離體繁殖，容易出現初代培養的褐化、繼代中玻璃苗大量產生、芽伸長生長慢、有效芽少、頂芽枯死等問題，導致增殖系數小，成苗質量差，繁殖速度慢，生產成本高。

技術實現要素：

本發明的目的在于：克服現有技術中關于冬櫻離體快繁方法匱乏、相關培養基對冬櫻離體快繁效果差的問題，提供一種冬櫻的離體快繁方法。

為了實現上述發明目的，本發明提供了一種冬櫻離體快繁方法，其包括如下步驟：

(1)外植體預處理及采集：剪取外植體前，每隔3～4天用多菌靈或百菌清溶液800倍交替噴灑冬櫻樹體2～3次，剪取冬櫻的上半木質化枝條作為外植體(天氣晴朗的上午為宜)，保濕帶回實驗室后，氯氣熏蒸20min，除葉，用洗潔精溶液浸泡5min后，用軟毛筆蘸洗潔精溶液仔細地輕輕刷洗枝條各部(切勿刷掉托葉)，然后用純凈水洗凈，低溫保濕備用；

(2)外植體消毒和腋芽誘導：枝條用無菌水清洗兩遍后，使用次氯酸鈉和升汞對外植體進行消毒，然后接種到誘導培養基上培養得到腋芽，誘導培養基以1/2yd為基本培養基，每升添加6-ba(6-芐氨基腺嘌呤)0.5～1.0mg、kt(激動素)0.1～0.5mg、iba(吲哚丁酸)0～0.1mg、naa(萘乙酸)0.05～0.1mg、蔗糖20～40g、瓊脂6g，ph為5.8～6.0；

(3)增殖培養：將腋芽切下接種到增殖培養基上培養得到增殖苗，增殖培養基以yd為基本培養基，每升添加6-ba0.4～0.8mg、kt0.1～0.5mg、iba0～0.1mg、naa0～0.1mg、ga3(赤霉素)1～5mg、蔗糖20～40g、瓊脂5.6g，ph為5.8～6.0；

(4)生根培養：將增殖苗的嫩芽切取并接種到生根培養基中培養得到生根苗，生根培養基以1/2yd培養基為基本培養基，每升添加naa0.1～0.5mg、iba0.1～0.5mg、蔗糖15～20g，瓊脂5.6g，ph為5.8～6.0；

(5)煉苗與移栽：將生根苗移到溫室進行煉苗移栽，得到冬櫻種苗。

作為本發明冬櫻離體快繁方法的一種改進，步驟(1)中，所述氯氣熏蒸是將外植體盛入玻璃器皿中，放入直徑400mm的干燥皿內，用1g/片藥片的1/4(0.25g二氧化氯片作用量)與水反應釋放的氯氣密閉熏蒸干燥皿內的外植體20min。

作為本發明冬櫻離體快繁方法的一種改進，步驟(2)和(3)中，所述培養條件為24±2℃，光照強度2000lx，光照時間12h/天。

作為本發明冬櫻離體快繁方法的一種改進，步驟(4)中，所述培養條件為25±2℃，光照強度2000lx，光照時間12h/天。

作為本發明冬櫻離體快繁方法的一種改進，所述yd培養基含有以下成分：1100mg/lnh4no3、1350mg/lkno3、330mg/lcacl2·2h2o、100mg/lca(no3)2·4h2o、370mg/lmgso4·7h2o、170mg/lkh2po4、100mg/lk2so4、22.3mg/lmnso4·4h2o、8.6mg/lznso4·7h2o、6.2mg/lh3bo3、0.83mg/lki、0.25mg/lna2moo4·2h2o、0.25mg/lcuso4·5h2o、0.025mg/lcocl2、33.4mg/lfeso4·7h2o、44.8mg/lna2·edta·h2o、100mg/l肌醇、2.0mg/l甘氨酸、0.1mg/l鹽酸硫胺素、0.5mg/l煙酸、0.5mg/l鹽酸吡哆醇，ph5.8，溶劑為水；所述1/2yd培養基為將yd培養基中nh4no3、kno3、ca(no3)2·4h2o、cacl2·2h2o、mgso4·7h2o、kh2po4、k2so4的用量減半，其余成分不變。

作為本發明冬櫻離體快繁方法的一種改進，步驟(2)中所述消毒是使用10～20wt％的次氯酸鈉溶液浸泡2～5min后，倒掉次氯酸鈉溶液，用無菌水沖洗4～5次，再加入0.1wt％升汞溶液中浸泡1～3min，期間不斷搖動，然后倒掉升汞溶液，用無菌水沖洗5～6次。

作為本發明冬櫻離體快繁方法的一種改進，步驟(2)中所述接種到誘導培養基上是將外植體用無菌刀片切除托葉、葉柄、莖段兩端的受傷部位后，再接種到誘導培養基上，一瓶接種一個外植體。

作為本發明冬櫻離體快繁方法的一種改進，步驟(3)中，將腋芽切下接種到增殖培養基后，腋芽分化形成新芽叢，將新芽叢中的芽高大于等于3cm的切割成1.0～1.5cm的莖段，再轉入新的增殖培養基中培養，得到增殖苗。

作為本發明冬櫻離體快繁方法的一種改進，步驟(5)中，將生根苗移到溫室中適應環境5～7天，光照強度為5000～10000lx，移栽前1～2天將組培瓶蓋從半開到全開煉苗，然后將組培苗取出洗凈培養基，移栽到體積比為泥炭：珍珠巖：礱糠灰＝3:1:1的混合基質上，移栽后前4～5天采用蓋膜保濕，然后解開蓋膜按照常規幼苗管理。

本發明通過基本培養基(yd培養基，專門針對冬櫻生理狀態設定的基本培養基)設置、不同激素成份及濃度水平配比優化，以成年優株半木質化枝條為外植體，經腋芽誘導、腋芽增殖和生根培養，形成完整植株，移栽到基質后，得到生長整齊、表型一致的健壯苗木。本發明具有外植體的腋芽誘導速度快，誘導率高達100％、繁殖系數高達9.5、增殖芽伸長生長快，培養20d芽高達3～5cm；生根培養10d，生根率達100％，根數達5條/株以上；組培生根苗健壯、移栽成活率高達95％以上；在實際生產應用中可進行周年規模化快速育苗，生產出健壯、整齊一致的冬櫻組培苗。

相對于現有技術，本發明具有如下優點：

本發明方法具有誘導速度快、誘導率高，增殖系數大、叢芽粗壯、伸長生長快、芽長，生根率高、根系發達，生根苗粗壯、移栽成活率高，苗木生長健壯整齊，生產成本低的優點。此外，通過適當降低冬櫻增殖培養基中激素水平，可確保增殖芽的質量和增殖系數>5(繼代周期20d)，同時，繼代周期延長至3個月。本發明為冬櫻種苗的規模化苗木生產提供了有效途徑，通過規模化育苗，可以大規模的獲得冬櫻種苗，將為冬櫻的無性化推廣提供技術支持，為我國園林綠化及生態文明建設提供新優櫻花品種及優質種苗，意義重大，應用前景廣闊。

附圖說明

下面結合附圖和具體實施方式，對本發明冬櫻離體快繁方法以及有益效果進行詳細說明。

圖1為本發明腋芽誘導圖。

圖2為本發明增殖培養基中的增殖瓶苗。

圖3為本發明生根培養基中的生根苗根系。

圖4為本發明組培生根苗。

圖5為本發明組培生根苗移栽后的生長情況。

圖6為本發明可出圃的組培容器苗。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案和有益技術效果更加清晰，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解的是，本說明書中描述的實施例僅僅是為了解釋本發明，并非為了限定本發明，實施例的參數、比例等可因地制宜做出選擇而對結果并無實質性影響。

以下實施例中的yd培養基，其含有以下成分：1100mg/lnh4no3、1350mg/lkno3、330mg/lcacl2·2h2o、100mg/lca(no3)2·4h2o、370mg/lmgso4·7h2o、170mg/lkh2po4、100mg/lk2so4、22.3mg/lmnso4·4h2o、8.6mg/lznso4·7h2o、6.2mg/lh3bo3、0.83mg/lki、0.25mg/lna2moo4·2h2o、0.25mg/lcuso4·5h2o、0.025mg/lcocl2、33.4mg/lfeso4·7h2o、44.8mg/lna2·edta·h2o、100mg/l肌醇、2.0mg/l甘氨酸、0.1mg/l鹽酸硫胺素、0.5mg/l煙酸、0.5mg/l鹽酸吡哆醇，溶劑為水。按照上述配方的成分和含量，將上述成分混合均勻，調ph5.8、121℃滅菌18～20min，得到yd培養基，備用。所述的1/2yd培養基為將yd培養中所含大量元素(nh4no3、kno3、ca(no3)2·4h2o、cacl2·2h2o、mgso4·7h2o、kh2po4、k2so4)的用量減半，其余成分不變。

實施例1

一種冬櫻離體快速繁殖方法，包括如下步驟：

(1)外植體采集：4～5月份天氣晴朗的上午10時左右，從冬櫻母株上剪取生長健壯、無病蟲害的半木質化枝條，保濕處理后帶回實驗室，將采集后嫩枝氯氣熏蒸20min(400mm干燥皿內0.25g二氧化氯片作用量)。除葉，用純凈水清洗干凈后作為外植體置4℃冰箱保存備用。采集外植體前，每隔3～4d用800倍多菌靈、百菌清交替噴灑萌枝2～3次。

(2)外植體表面消毒：將枝條(外植體)剪成4cm左右長的帶葉腋莖段，在超凈工作臺上先用無菌水擦洗干凈，再用質量分數10％～20％次氯酸鈉溶液，浸泡時間2～5min，倒掉次氯酸鈉溶液后，用無菌水沖洗4～5次，然后加入質量分數0.1％升汞溶液，根據外植體幼嫩程度浸泡1～3min，其間不斷搖動，倒掉升汞溶液后，再用無菌水沖洗5～6次。無菌濾紙吸干無菌材料表面水珠，用無菌刀片切除托葉、葉柄、莖段兩端受傷部位后，再將莖段切成1.5～2cm帶葉腋莖段備用，得到消毒好的帶葉腋切斷。

(3)腋芽誘導：將消毒好的帶葉腋莖段(外植體)接種到誘導培養基上培養，培養條件為：24±2℃，光照強度2000lx，光照時間12h/d，每瓶接種一個外植體，腋芽第2～3d開始萌動，腋芽伸長快，第20d可長至2.5cm左右(圖1)，誘導率為100％，所述的誘導培養基以1/2yd為基本培養基，每升添加6-ba0.8mg、kt0.2mg、naa0.05mg、蔗糖30g、瓊脂6g(激素購自sigma-aldrich公司)，ph為5.8(其配制方法為：將上述成分混合均勻后，調ph值，滅菌備用)，由此得到腋芽。

(4)增殖培養：將誘導出的腋芽截成1.0～1.5cm的莖段轉接入增殖培養基上培養，培養條件為：24±2℃，光照強度2000lx，光照時間12h/d，所述的增殖培養基以yd為基本培養基，每升添加6-ba0.5mg、kt0.2、iba0.1mg、naa0.05mg、ga35mg、蔗糖30g、瓊脂5.6g，ph為5.8(其配制方法為：將上述成分混合均勻后，調ph值，滅菌備用)，腋芽接入增殖培養基后，芽伸長生長快，單芽形成芽叢，20d增殖系數最高達9.5，苗高達5cm(圖2)，由此得到增殖苗。

(5)生根培養：從增殖苗選取健壯的有效芽(芽高>1.5cm)切取轉接到生根培養基中培養，培養條件為：25±2℃，光照強度2500lx，光照時間12h/d，所述的生根培養基以1/2yd為基本培養基，每升添加naa0.2mg、iba0.2mg、蔗糖15g、瓊脂5.6g，ph為5.8(其配制方法為：將上述成分混合均勻后，調ph值，滅菌備用)，10d生根率達100％，每株平均生根數達5條以上(圖3、圖4)。

(6)煉苗與移栽：將生根瓶苗移到溫室中適應外界環境5～7d，光照強度為5000～10000lx，出瓶移植前1～2d將組培瓶蓋從半開到全開煉苗，使瓶苗逐步適應適度小的自然環境，煉苗后將瓶中的幼苗小心取出，洗凈黏在苗上的培養基，移植到填滿泥炭:珍珠巖:礱糠灰＝3:1:1(體積比)混合基質的育苗杯中，每一杯種植一株苗，移植覆土深度剛好蓋住根系，壓緊基質，使苗根和基質緊密接觸，移植完成后淋透定根水。

(7)幼苗培育：移植后，對幼苗進行水分、肥及防病菌的管理：

①水分管理：瓶苗在移植后基質保持濕潤，空氣相對濕度在80％～90％為宜，前4～5d可通過蓋膜保濕，之后通過噴霧補水，控制培養溫度25±2℃，蔭棚用70％的遮陽網遮光；

②肥及防病菌的管理：在移植后第三天用質量分數0.1％百菌清或多菌靈溶液噴霧消毒滅菌，之后每隔10d噴霧一次，百菌清和多菌靈交替使用；當有新芽萌發、新根長出時，噴施0.2％復合肥+0.04％尿素混合液，每隔15d噴施一次；

③待生長穩定，長出新芽和新根后，逐步增加光照強度，直到進行全光照常規管理，移栽后一個月成活率達97％(圖5)，待幼苗長至10～15cm高時(圖6)，可移至大田培育大苗。

實施例2

一種冬櫻離體快速繁殖方法，包括如下步驟：

(1)外植體采集：4～5月份天氣晴朗的上午10時左右，從冬櫻母株上剪取生長健壯、無病蟲害的半木質化枝條，保濕處理后帶回實驗室，將采集后嫩枝氯氣熏蒸20min(400mm干燥皿內0.25g二氧化氯片作用量)。除葉，用純凈水清洗干凈后作為外植體置4℃冰箱保存備用。采集外植體前，每隔3～4d用800倍多菌靈、百菌清交替噴灑萌枝2～3次。

(2)外植體表面消毒：將枝條(外植體)剪成4cm左右長的帶葉腋莖段，在超凈工作臺上先用無菌水摖洗干凈，再用質量分數10％～20％次氯酸鈉溶液，浸泡時間2～5min，倒掉次氯酸鈉溶液后，用無菌水沖洗4～5次，然后加入質量分數0.1％升汞溶液，根據外植體幼嫩程度浸泡1～3min，其間不斷搖動，倒掉升汞溶液后，再用無菌水沖洗5～6次。無菌濾紙吸干無菌材料表面水珠，用無菌刀片切除托葉、葉柄、莖段兩端受傷部位后，再將莖段切成1.5～2cm帶葉腋莖段備用，得到消毒好的帶葉腋切斷。

(3)腋芽誘導：將消毒好的帶葉腋莖段(外植體)接種到誘導培養基上培養，培養條件為：24±2℃，光照強度2000lx，光照時間12h/d，每瓶接種一個外植體，腋芽第6～7d開始萌動，誘導率為76.7％，所述的誘導培養基以1/2yd為基本培養基，每升添加6-ba0.5mg、kt0.5mg、naa0.1mg、蔗糖30g、瓊脂6g(激素購自sigma-aldrich公司)，ph為5.8(其配制方法為：將上述成分混合均勻后，調ph值，滅菌備用)，由此得到腋芽。

(4)增殖培養：將誘導出的腋芽截成1.0～1.5cm的莖段轉接入增殖培養基上培養，培養條件為：24±2℃，光照強度2000lx，光照時間12h/d，所述的增殖培養基以yd為基本培養基，每升添加6-ba0.8mg、kt0.1、iba0.05mg、naa0.1mg、ga33mg、蔗糖40g、瓊脂5.6g，ph為5.8(其配制方法為：將上述成分混合均勻后，調ph值，滅菌備用)，腋芽接入增殖培養基后，芽伸長生長快，單芽形成芽叢，20d增殖系數最達5.4，苗高達2.5cm左右，由此得到增殖苗。

(5)生根培養：從增殖苗選取健壯的有效芽(芽高>1.5cm)切取轉接到生根培養基中培養，培養條件為：25±2℃，光照強度2500lx，光照時間12h/d，所述的生根培養基以1/2yd為基本培養基，每升添加naa0.2mg、iba0.5mg、蔗糖15g、瓊脂5.6g，ph為5.8(其配制方法為：將上述成分混合均勻后，調ph值，滅菌備用)，10d生根率達78％。

(6)煉苗與移栽：將生根瓶苗移到溫室中適應外界環境5～7d，光照強度為5000～10000lx，出瓶移植前1～2d將組培瓶蓋從半開到全開煉苗，使瓶苗逐步適應適度小的自然環境，煉苗后將瓶中的幼苗小心取出，洗凈黏在苗上的培養基，移植到填滿泥炭:珍珠巖:礱糠灰＝3:1:1(體積比)混合基質的育苗杯中，每一杯種植一株苗，移植覆土深度剛好蓋住根系，壓緊基質，使苗根和基質緊密接觸，移植完成后淋透定根水。

(7)幼苗培育：移植后，對幼苗進行水分、肥及防病菌的管理：

①水分管理：瓶苗在移植后基質保持濕潤，空氣相對濕度在80％～90％為宜，前4～5d可通過蓋膜保濕，之后通過噴霧補水，控制培養溫度25±2℃，蔭棚用70％的遮陽網遮光；

②肥及防病菌的管理：在移植后第三天用質量分數0.1％百菌清或多菌靈溶液噴霧消毒滅菌，之后每隔10d噴霧一次，百菌清和多菌靈交替使用；當有新芽萌發、新根長出時，噴施0.2％復合肥+0.04％尿素混合液，每隔15d噴施一次；

③待生長穩定，長出新芽和新根后，逐步增加光照強度，直到進行全光照常規管理，移栽后一個月成活率達95％，待幼苗長至10～15cm高時，可移至大田培育大苗。

實施例3

一種冬櫻離體快速繁殖方法，包括如下步驟：

(1)外植體采集：4～5月份天氣晴朗的上午10時左右，從冬櫻母株上剪取生長健壯、無病蟲害的半木質化枝條，保濕處理后帶回實驗室，將采集后嫩枝氯氣熏蒸20min(400mm干燥皿內0.25g二氧化氯片作用量)。除葉，用純凈水清洗干凈后作為外植體置4℃冰箱保存備用。采集外植體前，每隔3～4d用800倍多菌靈、百菌清交替噴灑萌枝2～3次。

(2)外植體表面消毒：將枝條(外植體)剪成4cm左右長的帶葉腋莖段，在超凈工作臺上先用無菌水摖洗干凈，再用質量分數10％～20％次氯酸鈉溶液，浸泡時間2～5min，倒掉次氯酸鈉溶液后，用無菌水沖洗4～5次，然后加入質量分數0.1％升汞溶液，根據外植體幼嫩程度浸泡1～3min，其間不斷搖動，倒掉升汞溶液后，再用無菌水沖洗5～6次。無菌濾紙吸干無菌材料表面水珠，用無菌刀片切除托葉、葉柄、莖段兩端受傷部位后，再將莖段切成1.5～2cm帶葉腋莖段備用，得到消毒好的帶葉腋切斷。

(3)腋芽誘導：將消毒好的帶葉腋莖段(外植體)接種到誘導培養基上培養，培養條件為：24±2℃，光照強度2000lx，光照時間12h/d，每瓶接種一個外植體，腋芽第5～6d開始萌動，誘導率為82％，所述的誘導培養基以1/2yd為基本培養基，每升添加6-ba1.0mg、kt0.1mg、iba0.05mg、naa0.08mg、蔗糖30g、瓊脂6g(激素購自sigma-aldrich公司)，ph為5.8(其配制方法為：將上述成分混合均勻后，調ph值，滅菌備用)，由此得到腋芽。

(4)增殖培養：將誘導出的腋芽截成1.0～1.5cm的莖段轉接入增殖培養基上培養，培養條件為：24±2℃，光照強度2000lx，光照時間12h/d，所述的增殖培養基以yd為基本培養基，每升添加6-ba0.6mg、kt0.5mg、iba0.1mg、ga31.0mg、蔗糖30g、瓊脂5.6g，ph為5.8(其配制方法為：將上述成分混合均勻后，調ph值，滅菌備用)，腋芽接入增殖培養基后，芽伸長生長快，單芽形成芽叢，20d增殖系數最達3.2，苗高達2cm左右，由此得到增殖苗。

(5)生根培養：從增殖苗選取健壯的有效芽(芽高>1.5cm)切取轉接到生根培養基中培養，培養條件為：25±2℃，光照強度2500lx，光照時間12h/d，所述的生根培養基以1/2yd為基本培養基，每升添加naa0.5mg、iba0.2mg、蔗糖15g、瓊脂5.6g，ph為5.8(其配制方法為：將上述成分混合均勻后，調ph值，滅菌備用)，10d生根率達80％。

(6)煉苗與移栽：將生根瓶苗移到溫室中適應外界環境5～7d，光照強度為5000～10000lx，出瓶移植前1～2d將組培瓶蓋從半開到全開煉苗，使瓶苗逐步適應適度小的自然環境，煉苗后將瓶中的幼苗小心取出，洗凈黏在苗上的培養基，移植到填滿泥炭:珍珠巖:礱糠灰＝3:1:1(體積比)混合基質的育苗杯中，每一杯種植一株苗，移植覆土深度剛好蓋住根系，壓緊基質，使苗根和基質緊密接觸，移植完成后淋透定根水。

(7)幼苗培育：移植后，對幼苗進行水分、肥及防病菌的管理：

①水分管理：瓶苗在移植后基質保持濕潤，空氣相對濕度在80％～90％為宜，前4～5d可通過蓋膜保濕，之后通過噴霧補水，控制培養溫度25±2℃，蔭棚用70％的遮陽網遮光；

②肥及防病菌的管理：在移植后第三天用質量分數0.1％百菌清或多菌靈溶液噴霧消毒滅菌，之后每隔10d噴霧一次，百菌清和多菌靈交替使用；當有新芽萌發、新根長出時，噴施0.2％復合肥+0.04％尿素混合液，每隔15d噴施一次；

③待生長穩定，長出新芽和新根后，逐步增加光照強度，直到進行全光照常規管理，移栽后一個月成活率達95％，待幼苗長至10～15cm高時，可移至大田培育大苗。

根據上述說明書的揭示和教導，本發明所屬領域的技術人員還可以對上述實施方式進行適當的變更和修改。因此，本發明并不局限于上面揭示和描述的具體實施方式，對本發明的一些修改和變更也應當落入本發明的權利要求的保護范圍內。此外，盡管本說明書中使用了一些特定的術語，但這些術語只是為了方便說明，并不對本發明構成任何限制。