一、技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于病蟲害防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用殺蟲真菌爪哇棒束孢降低煙粉虱體內(nèi)植物病毒含量的方法。

二、技術(shù)背景

煙粉虱bemisiatabaci是一種世界性害蟲，其刺吸作物造成直接為害，更大的為害是傳播植物病毒，造成病毒病的大流行，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來毀滅性災(zāi)害。番茄黃化曲葉病毒(tomatoyellowleafcurlvirus，tylcv)是煙粉虱傳播的最重要植物病毒，屬雙生病毒科(geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(begomovirus)病毒，為單鏈環(huán)狀dna病毒。煙粉虱的強(qiáng)入侵性造成了番茄黃化曲葉病毒病在亞洲、非洲、美洲等地區(qū)多個(gè)國(guó)家的流行，在我國(guó)大多數(shù)省份番茄黃化曲葉病毒病都有發(fā)生和流行，造成作物減產(chǎn)和農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降。

煙粉虱一旦獲取番茄黃化曲葉病毒后，可在體內(nèi)終身存留。如能有效降低煙粉虱體內(nèi)番茄黃化曲葉病毒的存留，將可顯著提高病毒病的控制效果。當(dāng)前生產(chǎn)上對(duì)番茄黃化曲葉病的防控主要采取利用抗病蟲品種、通過化學(xué)防治控制煙粉虱數(shù)量、用病毒拮抗劑等手段，尚未見如何殺蟲微生物降低煙粉虱體內(nèi)病毒含量以提高控病效果的研究報(bào)道。

爪哇棒束孢isariajavanica是一種重要昆蟲病原真菌，可在葉蟬等刺吸類害蟲種群中形成流行病，有效地控制害蟲的為害，現(xiàn)已被開發(fā)為防假眼小綠葉蟬的生物殺蟲劑。殺蟲真菌侵染攜帶植物病毒的介體昆蟲后，是否會(huì)對(duì)昆蟲體內(nèi)的植物病毒產(chǎn)生影響？國(guó)內(nèi)外還未見研究報(bào)道。研究爪哇棒束孢對(duì)煙粉虱體內(nèi)番茄黃化曲葉病毒的影響，期望能獲得既能侵染害蟲又能降低其體內(nèi)植物病毒量的殺蟲微生物，從而能同時(shí)實(shí)現(xiàn)害蟲和病毒病的防治，更大程度地發(fā)揮殺蟲微生物在植物病毒病防控方面的作用。

三、

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

1、發(fā)明目的

提供一種理想的降低昆蟲介體中番茄黃化曲葉病毒含量的方法，能安全降低昆蟲介體煙粉虱中番茄黃化曲葉病毒的含量，以更高效地控制番茄黃化曲葉病。

2、技術(shù)方案

本發(fā)明為一種降低煙粉虱中植物病毒含量的方法，其特征在于利用殺蟲真菌爪哇棒束孢降低煙粉虱體內(nèi)植物病毒含量的方法。

3、有益效果

本發(fā)明的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，產(chǎn)生以下有益效果：(1)與常規(guī)的殺蟲微生物直接作用于害蟲相比，本發(fā)明通過殺蟲真菌爪哇棒束孢降低煙粉虱體內(nèi)植物病毒含量，不僅可實(shí)現(xiàn)害蟲的直接控制，還能對(duì)植物病毒具有控制作用；(2)與化學(xué)藥劑防治害蟲及控制病毒病相比，本發(fā)明利用殺蟲真菌降低植物病毒量，可切實(shí)提高病毒病控制的無公害控制水平，有效減少環(huán)境污染。

四、具體實(shí)施方式

本發(fā)明的實(shí)施例是采用室內(nèi)測(cè)定的方法。

測(cè)定方法如下：

1、煙粉虱與殺蟲真菌爪哇棒束孢

帶毒高齡若蟲：挑選番茄黃化曲葉病發(fā)病明顯的番茄植株上，煙粉虱高齡若蟲密度大并且葉片長(zhǎng)勢(shì)較為整齊的葉片，用于殺蟲真菌處理。

帶毒剛羽化成蟲：采集密度和長(zhǎng)勢(shì)較為一致的帶煙粉虱高齡若蟲(10日齡左右若蟲，羽化前4天若蟲為宜)且番茄黃化曲葉病發(fā)病明顯的葉片，放在一次性杯中，每天觀察煙粉虱羽化情況，將同一天羽化成蟲收集在一起用于試驗(yàn)。

爪哇棒束孢：將實(shí)驗(yàn)室保存的爪哇棒束孢孢子粉配制成2×10⁵孢子/ml和2×10⁶孢子/ml兩個(gè)濃度懸浮液，對(duì)煙粉虱若蟲和成蟲兩個(gè)蟲態(tài)均進(jìn)行處理。每處理重復(fù)5次，若蟲處理每重復(fù)50頭以上若蟲，成蟲處理每重復(fù)30頭成蟲。

2、爪哇棒束孢處理煙粉虱

若蟲處理采用浸葉法：直接將帶高齡若蟲(10日齡左右若蟲，羽化前4天若蟲為宜)葉片在孢子懸浮液中浸10秒鐘取出，晾干后放在適合容器中，同時(shí)以清水作為空白對(duì)照。待成蟲羽化后，將剛羽化成蟲用于病毒檢測(cè)。

成蟲處理采用噴霧法：將剛羽化成蟲接入帶苗一次性杯中，用孢子液噴霧處理成蟲和葉片。同時(shí)以清水作為空白對(duì)照。處理后4天的煙粉虱用于病毒檢測(cè)。

3、煙粉虱dna的提取

各處理每重復(fù)均隨機(jī)10頭煙粉虱進(jìn)行群體dna提取。在1.5ml的離心管中加入10頭煙粉虱和20μl的dna堿裂解液(50mmol/ltris-hcl(ph8.0)，20mmol/lnacl，1mmol/ledta，1％sds)，充分研磨。加1μl蛋白酶k(20mg/ml)，離心30秒，60℃水浴1小時(shí)，追加1μl蛋白酶k，離心30s，繼續(xù)水浴2小時(shí)，加178μl的雙蒸水，100℃水浴5min，滅活蛋白酶k。取100μl提取液于另一離心管中，加2倍體積的預(yù)冷無水乙醇，充分混勻，4℃冰箱沉淀過夜后4℃13000rpm離心10分鐘，倒出乙醇，晾干后加20μl的雙蒸水溶解dna，-20℃保存。

4、番茄植株中番茄黃化曲葉病毒的定量檢測(cè)

番茄黃化曲葉病毒基因組1462(+)至1601(-)片段的拷貝數(shù)通過abistepone熒光定量pcr儀來測(cè)定，用于擴(kuò)增番茄黃化曲葉病毒基因組1462(+)至1601(-)片段的引物為：

(yg3)5’-gagttcccctgtgcgtgaa-3’

(yg5)5’-ctgttcgcaagtatcaatcaaggt-3’

反應(yīng)體系為：premixextaq(tlirnasehplus)(takara)，引物各0.6μl，referencedyeii0.4μl，dna1μl和ddh2o7.4μl。

擴(kuò)增程序：52℃2min，95℃1min，40個(gè)循環(huán)：95℃r5s，60℃30s，72℃。

5、數(shù)據(jù)分析

用統(tǒng)計(jì)分析軟件spss17.0對(duì)若蟲期和成蟲期各處理煙粉虱番茄黃化曲葉病毒含量均采用單因素方差分析和turkey多重比較法進(jìn)行各處理間的差異顯著性分析。

五、實(shí)施效果：

1、煙粉虱若蟲感染爪哇棒束孢對(duì)體內(nèi)番茄黃化曲葉病毒含量的影響

用2種濃度爪哇棒束孢懸浮液處理煙粉虱高齡若蟲，檢測(cè)處理4d后害蟲體內(nèi)番茄黃化曲葉病毒含量，發(fā)現(xiàn)爪哇棒束孢侵染顯著降低了煙粉虱若蟲體內(nèi)番茄黃化曲葉病毒含量，清水對(duì)照組煙粉虱若蟲體內(nèi)番茄黃化曲葉病毒含量分別是2×10⁵孢子/ml處理組和2×10⁶孢子/ml處理組tylcv含量的3.27倍和4.97倍(f＝43.867，df＝2，44，p＜0.001)，表明殺蟲真菌爪哇棒束孢處理煙粉虱若蟲有效降低了害蟲體內(nèi)番茄黃化曲葉病毒的含量。

2、煙粉虱成蟲感染爪哇棒束孢對(duì)體內(nèi)番茄黃化曲葉病毒含量的影響

同樣發(fā)現(xiàn)爪哇棒束孢侵染顯著降低了煙粉虱成蟲體內(nèi)番茄黃化曲葉病毒的含量，清水對(duì)照組煙粉虱成蟲體內(nèi)番茄黃化曲葉病毒含量分別是2×10⁵孢子/ml處理組和2×10⁶孢子/ml處理組成蟲體內(nèi)番茄黃化曲葉病毒含量的12.13倍和186.47倍(f＝9.125，df＝2，44，p＝0.001)，表明殺蟲真菌爪哇棒束孢處理煙粉虱成蟲也有效降低了害蟲體內(nèi)番茄黃化曲葉病毒的含量。