本發明屬于植物生物技術領域，涉及一種促進羅漢果ugt71v1基因表達的方法。
背景技術：
羅漢果甜苷v屬于葫蘆烷型四環三萜類物質，申請人前期根據羅漢果轉錄組數據，已推導出甜苷v可能的生物合成途徑。羅漢果甜苷v生物合成的前體物質是異戊烯二磷酸(ipp)和3,3-二甲基烯內基焦磷酸(dmapp)，二者是通過甲羥戊酸(mva)和甲基赤蘚糖醇磷酸化(mep)兩條途徑形成，mva途徑發生在胞質中，mep途徑發生在質體中。來源于上述兩途徑的ipp或dmapp經牻牛兒基焦磷酸合酶(gps)催化形成牻牛兒基焦磷酸(gpp)，ipp與gpp在法呢基焦磷酸合酶(fps)的催化作用下進而形成法呢基焦磷酸(fpp)，然后經角鯊烯合酶(ss)、角鯊烯環氧化酶(se)的催化形成2,3-氧化角鯊烯，葫蘆二烯醇合酶(cs)進一步催化形成葫蘆二烯醇，最后在cyp450酶和葡萄糖基轉移酶(ugt)的作用下，形成羅漢果甜苷v。
異戊二烯類物質的產生受到限速酶活性的嚴格調控，一直被認為在其生物合成途徑中起著重要的調控作用。作為異戊二烯途徑中的限速酶，ugt基因的表達對羅漢果甜苷v的生物合成起著決定性作用。過表達ugt基因，可以促進羅漢果甜苷v的積累；相反，如果抑制ugt基因的表達，羅漢果甜苷v的產量將顯著降低。然，ugt基因是個超基因家族，申請人前期研究發現，ugt71v1可能參與羅漢果甜苷v的合成途徑。現有技術中未見有促進羅漢果ugt71v1基因表達的報道。
技術實現要素：
本發明的一個目的是解決至少上述問題和/或缺陷，并提供至少后面將說明的優點。
本發明還有一個目的是提供一種促進羅漢果ugt71v1基因表達的方法。
為此，本發明提供的技術方案為：
一種促進羅漢果ugt71v1基因表達的方法，包括如下步驟：在羅漢果組培過程中和羅漢果栽培過程中，施加濃度50-400μmol/l的茉莉酸甲酯，以促進羅漢果ugt71v1基因的表達。
優選的是，所述的促進羅漢果ugt71v1基因表達的方法中，所述羅漢果組培過程中，將所述茉莉酸甲酯添加到所述羅漢果組培過程中的固體培養基中。
優選的是，所述的促進羅漢果ugt71v1基因表達的方法中，所述羅漢果栽培過程中，于羅漢果授粉后20～30天后，向羅漢果表面噴灑所述濃度50-400μmol/l的茉莉酸甲酯至其表面滴水為止，每天于早上、中午和晚上各噴灑一次，連續噴施5天。
優選的是，所述的促進羅漢果ugt71v1基因表達的方法中，所述羅漢果組培過程中所述固體培養基包含：ms，1.5mg/l6-ba，0.3mg/liba，3.5g/l瓊脂，30g/l蔗糖和1.0g/l活性炭。
優選的是，所述的促進羅漢果ugt71v1基因表達的方法中，所述羅漢果組培過程中的培養條件為：于相對濕度60-66％，光照強度1400lux，光照時間8h/d和溫度21～25℃條件下培養30d。
優選的是，所述的促進羅漢果ugt71v1基因表達的方法，還包括：茉莉酸母液配制：用2％(v/v)的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成10000μmol/l的母液，并用0.22μm的微孔濾膜滅菌，得到滅菌后的茉莉酸甲酯母液；
將該茉莉酸甲酯母液添加到羅漢果組培過程中的固體培養基中，至茉莉酸甲酯的終濃度為50-400μmol/l；
用乙醇助溶，將茉莉酸甲酯母液配成50-400μmol/l的溶液，施加于所述羅漢果栽培過程中。
優選的是，所述的促進羅漢果ugt71v1基因表達的方法中，還包括如下步驟：
qrt-pcr檢測ugt71v1基因的表達：
1)采集羅漢果果實，切成2-4mm小塊并分別用錫箔紙包好，立即置于液氮中速凍，保存于-80℃備用；
2)采用trizol法提取羅漢果果實總rna；
3)將rna反轉錄為cdna；
4)采用abi7500實時熒光定量pcr儀檢測ugt71v1基因的表達量，其中，擴增ugt71v1的引物序列為：上游引物ccggaattccaccaccaccaccaccacatgaagaagtttgagctagtttca，下游引物cggaattcttactctcctccttctggcccg，內參基因用ubq5基因，擴增引物序列為：上游引物ataaaagacccagcaccacattc，下游引物cccttgccgactacaacatcc。
優選的是，所述的促進羅漢果ugt71v1基因表達的方法中，還包括：所述羅漢果栽培過程中，向羅漢果表面噴灑的茉莉酸甲酯的溫度為8～12℃，同時，還采用注射的方式將茉莉酸甲酯注射入羅漢果植株的主莖中，注射量為6～15ml，注射的速率為3～5ml/h。
本發明至少包括以下有益效果：
(1)本發明通過在羅漢果組培苗和栽培羅漢果施加茉莉酸甲酯，短期內快速誘導羅漢果甜苷v生物合成途徑中關鍵酶基因ugt71v1的高表達，為促進羅漢果甜苷v含量的積累打下堅實基礎；
(2)本發明操作簡便，成本低，對環境友好，適于規模化生產，具有較強的實用性和推廣價值。
本發明的其它優點、目標和特征將部分通過下面的說明體現，部分還將通過對本發明的研究和實踐而為本領域的技術人員所理解。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。
應當理解，本文所使用的諸如“具有”、“包含”以及“包括”術語并不配出一個或多個其它元件或其組合的存在或添加。
本發明提供一種促進羅漢果ugt71v1基因表達的方法，包括如下步驟：在羅漢果組培過程中和羅漢果栽培過程中，施加濃度50-400μmol/l的茉莉酸甲酯，以促進羅漢果ugt71v1基因的表達。
在本發明的其中一個實施例中，作為優選，所述羅漢果組培過程中，將所述茉莉酸甲酯添加到所述羅漢果組培過程中的固體培養基中。
在上述方案中，作為優選，所述羅漢果組培過程中所述固體培養基包含：ms，1.5mg/l6-ba，0.3mg/liba，3.5g/l瓊脂，30g/l蔗糖和1.0g/l活性炭。
在本發明的其中一個實施例中，作為優選，所述羅漢果栽培過程中，于羅漢果授粉后20～30天后，向羅漢果表面噴灑所述濃度50-400μmol/l的茉莉酸甲酯至其表面滴水為止，每天于早上、中午和晚上各噴灑一次，連續噴施5天。
在本發明的其中一個實施例中，作為優選，所述羅漢果組培過程中的培養條件為：于相對濕度60-66％，光照強度1400lux，光照時間8h/d和溫度21～25℃條件下培養30d。
在本發明的其中一個實施例中，作為優選，還包括：茉莉酸母液配制：用2％(v/v)的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成10000μmol/l的母液，并用0.22μm的微孔濾膜滅菌，得到滅菌后的茉莉酸甲酯母液；
將該茉莉酸甲酯母液添加到羅漢果組培過程中的固體培養基中，至茉莉酸甲酯的終濃度為50-400μmol/l；
用乙醇助溶，將茉莉酸甲酯母液配成50-400μmol/l的溶液，施加于所述羅漢果栽培過程中。
在本發明的其中一個實施例中，作為優選，還包括如下步驟：
qrt-pcr檢測ugt71v1基因的表達：
1)采集羅漢果果實，切成2-4mm小塊并分別用錫箔紙包好，立即置于液氮中速凍，保存于-80℃備用；
2)采用trizol法提取羅漢果果實總rna；
3)將rna反轉錄為cdna；
4)采用abi7500實時熒光定量pcr儀檢測ugt71v1基因的表達量，其中，擴增ugt71v1的引物序列為：上游引物ccggaattccaccaccaccaccaccacatgaagaagtttgagctagtttca(seqidno:1)，下游引物cggaattcttactctcctccttctggcccg(seqidno:2)，內參基因用ubq5基因，擴增引物序列為：上游引物ataaaagacccagcaccacattc(seqidno:3)，下游引物cccttgccgactacaacatcc(seqidno:4)。
在本發明的其中一個實施例中，作為優選，還包括：所述羅漢果栽培過程中，向羅漢果表面噴灑的茉莉酸甲酯的溫度為8～12℃，同時，還采用注射的方式將茉莉酸甲酯注射入羅漢果植株的主莖中，注射量為6～15ml，注射的速率為3～5ml/h。在羅漢果栽培過程中，向羅漢果表面噴灑此溫度的茉莉酸甲酯溶液，對羅漢果的果實給予一定的冷刺激，能夠進一步誘導ugt71v1基因的表達。將茉莉酸甲酯直接注射于羅漢果體內，能夠便于羅漢果植株對其的直接吸收，進一步加大吸收效率，且由于是直接注射到體內，冷刺激更加明顯，能夠進一步促進ugt71v1基因的表達。
實施例1
一種促進羅漢果ugt71v1基因表達的方法，包括以下步驟：
(1)羅漢果組培苗施加茉莉酸甲酯；用2％的乙醇水溶液(v/v)溶解茉莉酸甲酯，配制成10000μmol/l的母液，并用0.22μm的微孔濾膜滅菌，將滅菌后的茉莉酸甲酯母液添加到固體培養基中，至茉莉酸甲酯最終濃度為50μmol/l，滅菌并冷卻至24℃；固體培養基配比為ms+6-ba1.5mg/l+iba0.3mg/l+3.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖+1.0g/l活性炭。將羅漢果組培苗接種在含有茉莉酸甲酯的固體培養基中，置于相對濕度60％、光照強度1400lux，光照時間8h/d，溫度23℃條件下培養30d。
(2)栽培羅漢果施加茉莉酸甲酯；用少量乙醇助溶，將茉莉酸甲酯原液配成50μmol/l的溶液，噴灑于授粉后20d的羅漢果表面，至表面滴水為止，早、中、晚各噴灑一次，連續噴施5d。
同時設置對比例1，
1)將羅漢果組培苗接種于不含有茉莉酸甲酯的固體培養基中培養；
2)不對羅漢果植株噴灑茉莉酸甲酯；其他條件與實施例1一致。
(3)qrt-pcr檢測ugt71v1基因的表達。
采集果實，挑取果肉，切成2mm小塊并分別用錫箔紙包好，立即置于液氮中速凍，保存于-80℃備用。
采用改良trizol法提取羅漢果果實總rna。
采用abi7500實時熒光定量pcr儀。
將rna反轉錄為cdna的反應體系為rna10.0μl，primescriptrtenzymemixi1.0μl，rtprimermix1.0μl，5×primescriptbuffer24.0μl，rnasefreedh2o4.0μl；反應條件為37℃(15min)→85℃(5s)→4℃。
采用primerpremier5.0軟件設計引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其中，ugt71v1引物序列為(fp：ccggaattccaccaccaccaccaccacatgaagaagtttgagctagtttca，rp：cggaattcttactctcctccttctggcccg)，內參基因用ubq5，序列為(fp：ataaaagacccagcaccacattc，rp：cccttgccgactacaacatcc)。
qrt-pcr反應體系(20μl)為sybrpremixextaqii(tlirnasehplus)(2×)10.0μl，pcrforwardprimer(10μm)0.8μl，pcrreverseprimer(10μm)0.8μl，roxreferencedyeofdyeii(50×)0.4μl，template2.0μl，dh2o6.0μl。反應條件為95℃(30s)，接著進行40個cycles[95℃(5s)，95℃(34s)]。
qrt-pcr檢測結果顯示，對比例1中，羅漢果ugt71v1基因的表達量為1，而實施例1中，羅漢果ugt71v1基因的表達量高達5.6，較對比例1提高了460％，可見，實施例1可以顯著促進羅漢果ugt71v1基因的高表達；hplc檢測結果顯示，對比例1中，羅漢果甜苷v含量為0.72％，而實施例1中，羅漢果甜苷v含量高達1.81％，較對比例1提高了151.39％，可見，實施例1還可以顯著促進羅漢果甜苷v產量的提高。
實施例2
一種促進羅漢果ugt71v1基因表達的方法，包括以下步驟：
(1)羅漢果組培苗施加茉莉酸甲酯；用2％的乙醇水溶液(v/v)溶解茉莉酸甲酯，配制成10000μmol/l的母液，并用0.22μm的微孔濾膜滅菌，將滅菌后的茉莉酸甲酯母液添加到固體培養基中，至茉莉酸甲酯最終濃度為400μmol/l，滅菌并冷卻至26℃；固體培養基配比為ms+6-ba1.5mg/l+iba0.3mg/l+3.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖+1.0g/l活性炭。將羅漢果組培苗接種在含有茉莉酸甲酯的固體培養基中，置于相對濕度66％、光照強度1400lux，光照時間8h/d，溫度21℃條件下培養30d。
(2)栽培羅漢果施加茉莉酸甲酯；用少量乙醇助溶，將茉莉酸甲酯原液配成400μmol/l的溶液，噴灑于授粉后30d的羅漢果表面，至表面滴水為止，早、中、晚各噴灑一次，連續噴施5d。
同時設置對比例2，
1)將羅漢果組培苗接種于不含有茉莉酸甲酯的固體培養基中培養；
2)不對羅漢果植株噴灑茉莉酸甲酯；其他條件與實施例1一致。
(3)qrt-pcr檢測ugt71v1基因的表達。
采集果實，挑取果肉，切成4mm小塊并分別用錫箔紙包好，立即置于液氮中速凍，保存于-80℃備用。
采用改良trizol法提取羅漢果果實總rna。
采用abi7500實時熒光定量pcr儀。
將rna反轉錄為cdna的反應體系為rna10.0μl，primescriptrtenzymemixi1.0μl，rtprimermix1.0μl，5×primescriptbuffer24.0μl，rnasefreedh2o4.0μl；反應條件為37℃(15min)→85℃(5s)→4℃。
采用primerpremier5.0軟件設計引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其中，ugt71v1引物序列為(fp：ccggaattccaccaccaccaccaccacatgaagaagtttgagctagtttca，rp：cggaattcttactctcctccttctggcccg)，內參基因用ubq5，序列為(fp：ataaaagacccagcaccacattc，rp：cccttgccgactacaacatcc)。
qrt-pcr反應體系(20μl)為sybrpremixextaqii(tlirnasehplus)(2×)10.0μl，pcrforwardprimer(10μm)0.8μl，pcrreverseprimer(10μm)0.8μl，roxreferencedyeofdyeii(50×)0.4μl，template2.0μl，dh2o6.0μl。反應條件為95℃(30s)，接著進行40個cycles[95℃(5s)，95℃(34s)]。
qrt-pcr檢測結果顯示，對比例2中，羅漢果ugt71v1基因的表達量為1，而實施例2中，羅漢果ugt71v1基因的表達量高達15.3，較對比例2提高了1430％，可見，實施例2可以顯著促進羅漢果ugt71v1基因的高表達；hplc檢測結果顯示，對比例2中，羅漢果甜苷v含量為0.72％，而實施例2中，羅漢果甜苷v含量高達2.72％，較對比例2提高了277.78％，可見，實施例2還可以顯著促進羅漢果甜苷v產量的提高。
實施例3
一種促進羅漢果ugt71v1基因表達的方法，包括以下步驟：
(1)羅漢果組培苗施加茉莉酸甲酯；用2％的乙醇水溶液(v/v)溶解茉莉酸甲酯，配制成10000μmol/l的母液，并用0.22μm的微孔濾膜滅菌，將滅菌后的茉莉酸甲酯母液添加到固體培養基中，至茉莉酸甲酯最終濃度為225μmol/l，滅菌并冷卻至24-26℃；固體培養基配比為ms+6-ba1.5mg/l+iba0.3mg/l+3.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖+1.0g/l活性炭。將羅漢果組培苗接種在含有茉莉酸甲酯的固體培養基中，置于相對濕度63％、光照強度1400lux，光照時間8h/d，溫度25℃條件下培養30d。
(2)栽培羅漢果施加茉莉酸甲酯；用少量乙醇助溶，將茉莉酸甲酯原液配成225μmol/l的溶液，噴灑于授粉后25d的羅漢果表面，至表面滴水為止，早、中、晚各噴灑一次，連續噴施5d。
同時設置對比例3，
1)將羅漢果組培苗接種于不含有茉莉酸甲酯的固體培養基中培養；
2)不對羅漢果植株噴灑茉莉酸甲酯；其他條件與實施例1一致。
(3)qrt-pcr檢測ugt71v1基因的表達。
采集果實，挑取果肉，切成3mm小塊并分別用錫箔紙包好，立即置于液氮中速凍，保存于-80℃備用。
采用改良trizol法提取羅漢果果實總rna。
采用abi7500實時熒光定量pcr儀。
將rna反轉錄為cdna的反應體系為rna10.0μl，primescriptrtenzymemixi1.0μl，rtprimermix1.0μl，5×primescriptbuffer24.0μl，rnasefreedh2o4.0μl；反應條件為37℃(15min)→85℃(5s)→4℃。
采用primerpremier5.0軟件設計引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其中，ugt71v1引物序列為(fp：ccggaattccaccaccaccaccaccacatgaagaagtttgagctagtttca，rp：cggaattcttactctcctccttctggcccg)，內參基因用ubq5，序列為(fp：ataaaagacccagcaccacattc，rp：cccttgccgactacaacatcc)。
qrt-pcr反應體系(20μl)為sybrpremixextaqii(tlirnasehplus)(2×)10.0μl，pcrforwardprimer(10μm)0.8μl，pcrreverseprimer(10μm)0.8μl，roxreferencedyeofdyeii(50×)0.4μl，template2.0μl，dh2o6.0μl。反應條件為95℃(30s)，接著進行40個cycles[95℃(5s)，95℃(34s)]。
qrt-pcr檢測結果顯示，對比例3中，羅漢果ugt71v1基因的表達量為1，而實施例3中，羅漢果ugt71v1基因的表達量高達20.7，較對比例3提高了1970％，可見，實施例3可以顯著促進羅漢果ugt71v1基因的高表達；hplc檢測結果顯示，對比例3中，羅漢果甜苷v含量為0.76％，而實施例3中，羅漢果甜苷v含量高達2.96％，較對比例3提高了289.47％，可見，實施例3還可以顯著促進羅漢果甜苷v產量的提高。
實施例4
一種促進羅漢果ugt71v1基因表達的方法，包括以下步驟：
(1)羅漢果組培苗施加茉莉酸甲酯；用2％的乙醇水溶液(v/v)溶解茉莉酸甲酯，配制成10000μmol/l的母液，并用0.22μm的微孔濾膜滅菌，將滅菌后的茉莉酸甲酯母液添加到固體培養基中，至茉莉酸甲酯最終濃度為100μmol/l，滅菌并冷卻至24-26℃；固體培養基配比為ms+6-ba1.5mg/l+iba0.3mg/l+3.5g/l瓊脂+30g/l蔗糖+1.0g/l活性炭。將羅漢果組培苗接種在含有茉莉酸甲酯的固體培養基中，置于相對濕度64％、光照強度1400lux，光照時間8h/d，溫度24℃條件下培養30d。
(2)栽培羅漢果施加茉莉酸甲酯；用少量乙醇助溶，將茉莉酸甲酯原液配成300μmol/l的溶液，置于冰箱中降溫，使茉莉酸甲酯的溫度降至8～12℃，再噴灑于授粉后23d的羅漢果表面，至表面滴水為止，早、中、晚各噴灑一次，連續噴施5d。同時，還采用注射的方式將茉莉酸甲酯注射入羅漢果植株的主莖中，注射量為6～15ml，注射的速率為3～5ml/h。
同時設置對比例4
1)將羅漢果組培苗接種于不含有茉莉酸甲酯的固體培養基中培養；
2)不對羅漢果植株噴灑和注射茉莉酸甲酯；其他條件與實施例4一致。
(3)qrt-pcr檢測ugt71v1基因的表達。
采集果實，挑取果肉，切成2-4mm小塊并分別用錫箔紙包好，立即置于液氮中速凍，保存于-80℃備用。
采用改良trizol法提取羅漢果果實總rna。
采用abi7500實時熒光定量pcr儀。
將rna反轉錄為cdna的反應體系為rna10.0μl，primescriptrtenzymemixi1.0μl，rtprimermix1.0μl，5×primescriptbuffer24.0μl，rnasefreedh2o4.0μl；反應條件為37℃(15min)→85℃(5s)→4℃。
采用primerpremier5.0軟件設計引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其中，ugt71v1引物序列為(fp：ccggaattccaccaccaccaccaccacatgaagaagtttgagctagtttca，rp：cggaattcttactctcctccttctggcccg)，內參基因用ubq5，序列為(fp：ataaaagacccagcaccacattc，rp：cccttgccgactacaacatcc)。
qrt-pcr反應體系(20μl)為sybrpremixextaqii(tlirnasehplus)(2×)10.0μl，pcrforwardprimer(10μm)0.8μl，pcrreverseprimer(10μm)0.8μl，roxreferencedyeofdyeii(50×)0.4μl，template2.0μl，dh2o6.0μl。反應條件為95℃(30s)，接著進行40個cycles[95℃(5s)，95℃(34s)]。
qrt-pcr檢測結果顯示，對比例4中，羅漢果ugt71v1基因的表達量為1，而實施例4中，羅漢果ugt71v1基因的表達量高達20.1，較對比例4提高了1910％，可見，實施例4可以顯著促進羅漢果ugt71v1基因的高表達；hplc檢測結果顯示，對比例4中，羅漢果甜苷v含量為0.76％，而實施例4中，羅漢果甜苷v含量高達2.87％，較對比例4提高了277.63％，可見，實施例4還可以顯著促進羅漢果甜苷v產量的提高。
這里說明的模塊數量和處理規模是用來簡化本發明的說明的。對本發明的促進羅漢果ugt71v1基因表達的方法的應用、修改和變化對本領域的技術人員來說是顯而易見的。
盡管本發明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現另外的修改，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發明并不限于特定的細節和這里示出與描述的實施例。
sequencelisting
<110>韋榮昌
<120>促進羅漢果ugt71v1基因表達的方法
<130>2016
<160>4
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>51
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
ccggaattccaccaccaccaccaccacatgaagaagtttgagctagtttca51
<210>2
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
cggaattcttactctcctccttctggcccg30
<210>3
<211>23
<212>dna
<213>人工序列
<400>3
ataaaagacccagcaccacattc23
<210>4
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
<400>4
cccttgccgactacaacatcc21