專利名稱：高效表達腫瘤血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒及其構建方法
技術領域：
本發明涉及生命科學領域，具體涉及一種能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，及其構建和增殖的方法。
惡性腫瘤嚴重危及人類的生命健康。目前對惡性腫瘤的常規治療仍為手術及放、化療，這種常規治療對極大多數腫瘤的療效仍不十分理想，對于極大多數化療藥物而言，其治療指數仍較低，即其治療劑量與毒性劑量較為接近。故這種治療方案通常伴有明顯的毒性作用，包括危及生命的骨髓抑制等。因此，研究選擇性殺滅腫瘤細胞而不影響正常細胞的方法對腫瘤治療非常重要，這種選擇性殺滅腫瘤細胞的方法主要依賴于腫瘤細胞的特異性標記，其療效也決定于該腫瘤標記是否嚴格限制于腫瘤細胞內。
近幾年來，關于腫瘤新生血管研究取得很大進展，Folkkman的研究小組提出了在腫瘤發生和發展過程中的“血管生成開關機制”，揭示了腫瘤微血管形成的分子機制。當腫瘤的半徑＜2mm時，它主要依靠擴散在細胞周圍的營養物質和氧氣生存。隨著瘤體的增大，腫瘤本身或宿主組織將建立起新生血管網以供給瘤體營養。腫瘤新生血管網的形成取決于腫瘤周圍的微環境中誘導與抑制新生血管形成的因子相互作用結果，在腫瘤的發生及轉移灶形成過程中，誘導及促進新生血管形成的因子如成纖維細胞生長因子(bFGF)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)、轉化生長因子-α(TGF-α)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、血小板來源的內皮生長因子(PDEGF)、白細胞介素-8(IL-8)、纖溶酶原激活因子(PA)及基質金屬蛋白酶(MMP)等占主導地位，而抑制新生血管形成的因子如內皮抑素(endostatin)、血管生成抑制(angiostatin)、干擾素-α、干擾素-β、干擾素-γ、血小板反應蛋白(thrombospondin)、血小板因子4基因、纖溶酶原激活因子抑制劑(PAI)基因及纖維結合素(fibronectin)基因等處于劣勢。從而導致腫瘤新生血管的形成，新生血管輸送腫瘤細胞快速增殖所需的營養，也使腫瘤細胞的遠距離轉移得已實現。抑制腫瘤新生血管的形成，可阻斷腫瘤細胞的營養供應，從而導致腫瘤細胞因營養不足而死亡，腫瘤明顯萎縮乃至完全消褪。同時抑制腫瘤新生血管的形成，也達到阻斷腫瘤轉移的通路的目的。目前已有多種阻斷腫瘤新生血管生成抑制因子進入臨床試驗。但由于新生血管生成抑制因子需要半衰期均較短，需要每天給予治療。同時通常需要量也較多，如內皮抑素(endostatin)及血管生成抑素(angiostatin)治療劑量10-20mg/Kg/天。常規生物工程方法難以達到。
腫瘤特異性增殖的病毒的根據腫瘤細胞與正常細胞某些生物學特性的差異，經過改造的病毒只能特異性地在腫瘤細胞內增殖、裂解腫瘤細胞，然后釋放出病毒顆粒，再次感染其它腫瘤細胞，再次增殖、裂解，如此產生放大效應，由于病毒能夠彌散到全身各個組織及臟器，因而能感染所有腫瘤細胞，從而殺滅局部及轉移的腫瘤，而不影響正常細胞。
但迄今為止，尚未見到應用腫瘤特異性增殖的病毒系統高效表達血管生成抑制因子的報告。
本發明的目的在于提供一類能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒及其構建方法。
本發明的目的在于提供一類能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒的復合物。
本發明的目的在于研究上述能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒的應用。
本發明提供一類能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，將編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列插入腫瘤細胞內特異性增殖的病毒基因組中的非增殖必需區域，該病毒選擇性地在腫瘤細胞內增殖，而在正常細胞內不增殖，通過病毒在腫瘤細胞內復制增殖，導致編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列拷貝數增加，從而血管生成抑制因子基因表達量增加，該腫瘤細胞內特異性增殖的病毒可以是以下任何一種(1)在腫瘤細胞內特異性增殖的野生型病毒；(2)病毒增殖必需基因的轉錄起始點與編碼起始位點之間插入腫瘤細胞特異性激活的順式作用元件；(3)蛋白功能缺失重組后能在腫瘤細胞內特異性增殖的病毒。
上述重組病毒可以是腺病毒、單純皰疹病毒等，編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列可以是編碼內皮抑素的核苷酸序列、編碼血管生成抑素的核苷酸序列等。
本發明提供一類能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒的構建方法，(1)將編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列直接插入腫瘤細胞內特異性增殖的病毒基因組中的非增殖必需區域；(2)病毒增殖必需基因的轉錄起始點與編碼起始位點之間插入腫瘤細胞特異性激活的順式作用元件；順式作用元件可以是下述任何一種(a).甲胎蛋白(AFP)增強子及啟動子；(b).癌胚抗原(CEA)增強子及啟動子；(c).酪氨酸酶增強子及啟動子；(d).ErbB2增強子及啟動子；(e).ErbB3增強子及啟動子；(f).ErbB4增強子及啟動子；(g).DF3乳腺癌相關抗原(MUCl)增強子；(h).前列腺素特異性抗原增強子及啟動子；(i).腺血管舒緩素增強子及啟動子；(j).EB病毒愛潑斯坦氏-巴爾氏病毒(Epstein-Barr virus，按常規簡稱為EB病毒)中的Orip；(k).EB病毒Orip中的family of 30bp repeats(按常規簡稱為FR)；(1)EB病毒BamHⅠC-啟動子；(m).EB病毒中的Orip聯合EB病毒BamHⅠC-啟動子；(n).EB病毒Orip中的FR聯合單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本啟動子或SV40基本啟動子；(3)蛋白功能缺失重組后能在腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，蛋白功能缺失可以是下述任何一種腺病毒E1B 55Kda蛋白功能缺失，腺病毒E1B19Kda蛋白功能缺失，腺病毒E1A蛋白功能缺失，單純皰疹病ICP6蛋白功能缺失，單純皰疹病ICP34.5蛋白功能缺失。
病毒在腫瘤細胞內特異性增殖及復制，而在正常細胞不增殖及復制，主要通過以下方法實現(1)選擇性對病毒增殖必需基因的控制基因轉錄激活的調節受反式作用因子(如轉錄因子)與順式作用元件相互作用的影響。當缺乏或出現某些轉錄因子會影響基因的轉錄水平。本發明應用腫瘤組織特異性激活順式作用元件(包括啟動子或增強子)控制目的基因，使該目的基因特異性在腫瘤細胞內表達，而在正常的細胞內不表達或低水平表達。應用控制腫瘤組織特異性啟動子或增強子病毒增殖及復制的必需基因，從而使病毒增殖必需基因只能在腫瘤的細胞中表達，導致病毒只能在腫瘤的細胞內增殖，而在正常細胞內不增殖。
本發明采用細胞專一的反應元件是由腫瘤細胞特異性激活順式作用元件組成，其順式作用元件可以是下述任何一種甲胎蛋白(AFP)增強子及啟動子為肝癌細胞特異性激活增強子及啟動子。
癌胚抗原(CBA)增強子及啟動子為胃癌及結腸癌細胞特異性激活增強子及啟動子。
酪氨酸酶增強子及啟動子為黑色素瘤細胞特異性激活增強子及啟動子。
ErbB2增強子及啟動子為乳腺癌細胞特異性激活增強子及啟動子。
ErbB3增強子及啟動子為乳腺癌細胞特異性激活增強子及啟動子。
ErbB4增強子及啟動子為乳腺癌及胃癌細胞特異性激活增強子及啟動子。
DF3乳腺癌相關抗原(MUCl)增強子為乳腺癌細胞特異性激活增強子及啟動子。
前列腺素特異性抗原增強子及啟動子，該前列腺素特異性抗原增強子位于前列腺素特異性抗原起始轉錄位點的nt-5322～nt-3739，啟動子位于前列腺素特異性抗原起始轉錄位點的nt-540～nt+12，該增強子與啟動子特異性激活于前列腺細胞及前列腺癌細胞。
腺血管舒緩素增強子及啟動子特異性激活于前列腺細胞及前列腺癌細胞。
愛潑斯坦氏-巴爾氏病毒(Epstein-Barr virus，按常規簡稱為EB病毒)中的Orip、EB病毒Orip中的FR、EB病毒BamHⅠC-啟動子、EB病毒中的Orip聯合EB病毒BamHⅠC-啟動子、EB病毒Orip中的FR聯合單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本啟動子或SV40基本啟動子、在EB病毒感染或潛伏感染細胞中特異性激活的順式作用元件。
本發明提出的在于提供一類能特異性殺滅腫瘤細胞的增殖型重組病毒，它至少有一個病毒增殖所必需的基因的腫瘤細胞特異性激活的順式作用元件制。它由在病毒增殖必需基因的轉錄起始位點與編碼起始位點之間區域插入某種順式作用元件而構成。該順式作用元件特異性在腫瘤細胞內激活，產生轉錄活性，而在正常細胞內不激活，不能產生轉錄活性。該順式作元件可以是下述順序之一甲胎蛋白(AFP)增強子及啟動子，癌胚抗原(CEA)增強子及啟動子，酪氨酸酶增強子及啟動子，ErbB2增強子及啟動子，ErbB3增強子及啟動子，ErbB4增強子及啟動子，DF3乳腺癌相關抗原(MUCl)增強子，前列腺素特異性抗原增強子及啟動子，腺血管舒緩素增強子及啟動子，EB病毒中的Orip、EB病毒Orip中的FR、EB病毒BamHⅠC-啟動子、EB病毒中的Orip聯合EB病毒BamHⅠC-啟動子、EB病毒Orip中的FR聯合單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本啟動子或SV40基本啟動子、在EB病毒感染或潛伏感染細胞中特異性激活的順式作用元件。上述病毒增殖所必需的為病毒早期表達基因，如單純皰疹病毒早早期表達基因ICP4。
本發明中，上述病毒可以采用腺病毒。其病毒增殖必需基因至少含有以下一個腺病毒的早期表達基因E1A、E1B、E2、E4。
(2).病毒在正常細胞復制必需而在腫瘤細胞中非必需的基因編碼的蛋白功能選擇性地缺失正常細胞與腫瘤存在著某些基因表達上的差異，某些病毒在正常細胞內復制所必需的基因，在腫瘤細胞內并不需要，因此，去除這些基因編碼的蛋白功能有望使在腫瘤細胞內特異性復制，而不能在正常細胞中復制。
病毒蛋白功能功失可以是以下任何一種腺病毒E1B 55kDa的基因點突變、缺失突變、插入突變導致E1B 55kDa蛋白質功能異常。腺病毒E1B 19kDa的基因點突變、缺失突變、插入突變導致E1B 19kDa蛋白質功能異常。腺病毒E1A的基因點突變、缺失突變、插入突變導致E1A蛋白質功能異常。單純皰疹病毒ICP6基因點突變、缺失突變、插入突變導致ICP6的蛋白質功能異常。單純皰疹病毒ICP34.5基因點突變、缺失突變、插入突變導致ICP34.5的蛋白質功能異常。
(3).依賴于腫瘤細胞某個信號轉導途徑異常而產生的病毒復制，呼吸道腸道過濾性病毒(Reovirus)感染后其早期病毒基因轉錄可激活雙鏈RNA依賴的蛋白激酶(PKR)，而該激酶可抑制該病毒的其它基因的轉錄，從而使病毒不能有效復制，而當細胞中Ras處于激活狀態則可抑制該激酶，從而使該病毒活躍復制。Ras基因是一個癌基因，當它被不正常激活時，即可能發生癌變。呼吸道腸道過濾性病毒復制及增殖依賴于Ras異常激活的信號途徑，即在Ras高表達的腫瘤細胞內復制及增殖。
(4).選擇性進入腫瘤細胞改變它們表面的結合蛋白可使其與某些特定的腫瘤組織結合，從而使病毒只能感染特定的腫瘤組織。目前這方面改造主要集中于腺病毒外殼蛋白-纖維蛋白(Fiber)、五鄰體(penton)及六鄰體蛋白(hexon)，尤其在纖維蛋白中頭部HI環中或C末端最常見，包括插入腫瘤膜表面具有高親和力的某種配體、短肽及抗體Fab區域。
本發明提供一類的能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼含有分泌型信號肽的內皮抑素(endostatin)的核苷酸序列。內皮抑素是一個膠原蛋白ⅩⅧ的20KDa的C-末端片段，它能特異性地抑制血管內皮細胞增殖作用，而不影響其它細胞。Folkman等的實驗結果表明內皮抑素對腫瘤誘導的血管生成具有強烈的抑制活性，從而抑制腫瘤的形成與轉移，而且反復應用內皮抑素無抗性產生，即使數百倍治療劑量也無明顯毒性。由于內皮抑素為膠原蛋白ⅩⅧ的C-末端片段，故無分泌性信號肽。在基因治療時需要加入分泌型信號肽，M-成瘤蛋白信號肽及免疫球蛋白K鏈信號肽均為強分泌型信號肽，在內皮抑素加入M-成瘤蛋白信號肽或免疫球蛋白K鏈信號肽可將內皮抑素分泌至細胞外。
本發明提供一類能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼血管生成抑素(angiostatin)的核苷酸序列。血管生成抑素是血漿纖維蛋白溶酶原(plasminogen)的內部片段。血漿纖維蛋白溶酶原包含Kringle1-5結構，Kringle位點是3個環狀相連的二硫鍵結構，每個Kringle結構包含約80個氨基酸，各個Kringle結構有50％左右的序列相同。血管生成抑素具有強烈抑制血管生存和腫瘤生長。通常的血管生成抑素是指血漿纖維蛋白溶酶原中含有Kringle1-4結構的38kDa蛋白片段。最近有研究對人血漿纖維蛋白溶酶原水解片段Kringle1-4和Kringle1-3作抗血管內皮細胞作用比較，Kringle1-3比Kringle1-4抗血管內皮細胞作用更強，重組的人Kringlel、Kringle2、Kringle3及Kringle4抗血管內皮細胞作用的研究表明抗血管內皮細胞作用依次Kringle1＞Kringle3＞Kringle2，而Kringle4幾乎無活性。Keingle5抗血管內皮細胞作用活性與Kringle1-4相似或更強。
本發明中該編碼血管生成抑制因子(angiostatin)的核苷酸序列，其為編碼血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle1-4結構的核苷酸序列。
本發明提供一類能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其所述編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle1-5結構的核苷酸序列。
本發明提供一類能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其所述編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle1-3結構的核苷酸序列。
本發明提供一類能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle1-3加上Kringle5結構的核苷酸序列。
本發明提供一類能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle1結構的核苷酸序列。
本發明提供一類能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle2結構的核苷酸序列。
本發明提供一類能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle3結構的核苷酸序列。
本發明提供一類能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle5結構的核苷酸序列。
干擾素廣泛應用于抗病毒治療，有研究表明干擾素在體內有明顯抑制腫瘤的作用。實驗表明干擾素是通過抑制腫瘤新生血管形成而抑制腫瘤生長與轉移。
本發明提供一類能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼干擾素-α的核苷酸序列。
本發明提供一類能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼干擾素-β的核苷酸序列。
本發明提供一類能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼干擾素-γ的核苷酸序列。
本發明提供一類能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼血小板反應蛋白Ⅰ(thrombospondinⅠ)的核苷酸序列。血小板反應蛋白Ⅰ是一個由三個相同的180kDa亞單位組成的糖蛋白，它只少有兩個不同的作用區域抑制新生微血管的形成。
本發明提供一類能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼血小板因子4的核苷酸序列。血小板因子4是血小板α顆粒蛋白，其抑制新生微血管形成區位于C-末端、肝素結合區。
本發明提供一類能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼纖溶酶原激活因子抑制劑(PAI)的核苷酸序列。
本發明提供一類能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼白細胞介素-12的核苷酸序列。白細胞介素-12是一個具有多種功能的細胞因子，包括促進淋巴細胞增殖、增強抗腫瘤的細胞免疫、誘導大量干擾素γ的產生、增強NK細胞及LAK細胞活性。最近發現它具有抗新生血管形成作用。
本發明提供一類能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼纖維結合素(fibronectin)的核苷酸序列。纖維結合素是很多正常細胞的表面的主要組成成分及潛在的細胞獼散因子。纖維結合素在體內抑制新生血管生成。
本發明提供一類能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列受啟動子控制。該啟動子可以為以下啟動子之一猴病毒40(Simian virus40，按常規簡稱為SV40)啟動子、勞斯氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus，按常規簡稱為RSV)LTR啟動子及人巨細胞病毒(按常規簡稱為HCMV)IE啟動子等。
本發明在上述這種修飾病毒基因組中非增殖必需區域插入編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列，本發明所述的編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為含有分泌型信號肽的內皮抑素基因(endostatin)，該分泌信號肽為M-成瘤蛋白信號肽、免疫球蛋白K鏈信號肽，血管生成抑素基因(angiostatin)(血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle1-4結構)、血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle1-5結構、血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle1-3結構、血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle1-3加上Kringle5結構、血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle1結構、血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle2、結構血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle3、結構血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle5結構、干擾素-α基因、干擾素-β基因、干擾素-γ基因、血小板反應蛋白(thrombospondin)基因、血小板因子4基因、纖溶酶原激活因子抑制劑(PAI)基因、白細胞介素-12及纖維結合素(fibronectin)基因。隨著病毒在腫瘤細胞內復制，使編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列拷貝數增加，使腫瘤細胞高效表達血管生成抑制因子，從而抑制腫瘤血管形成，抑制腫瘤形成、生長及轉移。同時，這種修飾后的病毒載體可被用于在某些細胞混合物中殺滅被某種殊靶細胞，通過給予修飾后的病毒能選擇性地在該種靶細胞中增殖，從而使這種靶細胞被增殖的病毒選擇性的殺滅；在體外培養或在動物體內通過將修飾后的病毒與細胞復合物混合，病毒只能在靶細胞增殖，也就是說除了靶細胞，其它細胞不能被這種病毒殺死。由于病毒在靶細胞內增殖及擴增，從而使混合細胞中的該靶細胞被殺滅，一旦靶細胞被破壞，病毒不再能夠再增殖。
本發明提出的高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒與化學治療藥物(如順鉑、5-氟脲嘧啶絲裂霉素C等)、生物毒素(如蛇毒素)、單克隆抗體一起可以組成復合物，其作為抗腫瘤藥物效果更好。與X-線聯合應用可產生更為有效的抗腫瘤效應。
本發明提供一類能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，用于抑制腫瘤細胞的生長。
本發明提供一類能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，用于體外感染腫瘤細胞，病毒在腫瘤細胞內復制及增殖，導致編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列拷貝數增加及血管生成抑制因子表達量增加。
本發明提供一類能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，可用于體內選擇性地在腫瘤細胞內復制及增殖，導致編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列拷貝數增加及其表達量增加，抑制腫瘤血管形成，抑制腫瘤形成、生長及轉移。同時該病毒能在而且僅限于腫瘤細胞內增殖，也能特異性直接殺滅腫瘤細胞。
本發明具有如下有益效果1．本發明提供一類治療腫瘤的能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，動物實驗證明，這種重組病毒可用于治療腫瘤。
2．本發明提供一類高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒的構建方法。該方法通常易行可用于構建高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒。
3．本發明提供一種在體內及體外殺滅腫瘤細胞、而不影響正常細胞，并在體內及體外腫瘤細胞內高效表達血管生成抑制因子，與化學抗腫瘤藥物結合，更有效地殺滅腫瘤細胞，達到高效低毒應用于治療腫瘤的目的。
人類腺病毒有6個不同亞屬，分為A、B、C、D、E及F。它們對宿主細胞的親嗜性、致瘤性及疾病史并不相同。本發明以腺病毒C亞屬中的5型(Ad5)作為例證對本發明加以進一步具體說明，本發明構建手段均是現有技術人員能夠實現。
例一、攜帶人內皮抑素(endostatin)基因的E1區缺失的腺載體的構建pCA13載體購于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pCA13含有5型腺病毒序列bp22-5790并缺失E1區342至3523bp片段，在E1缺失區插入了人巨細胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)及SV40 poly A加尾信號。應用多聚酶鏈反應(PCR)技術應用多聚酶鏈反應(PCR)技術人內皮抑素(endostatin)基因，自新鮮的正常人肝組織中抽提總RNA，以隨機引物作逆轉錄反應，在擴增人內皮抑素(endostatin)基因，并用兩次多聚酶鏈反應(PCR)技術(方法參見PCRProtools Current Methods and Applications,White BA主編，HumanaPress Inc.1993年出版一文獻1)在基因前加入M-成瘤蛋白(Oncostatin-M)信號肽及信號肽前、基因結尾引入EcoRⅠ和XbaⅠ兩個酶切位點。
Primer1:GGG GAA TTC ACC ATG GGG GTA CTG CTC ACA CAG AGG ACGCTG CTC AGT CTG GTC CTT GCA CTCPrimer2:CTG CTC AGT CTG GTC CTT GCA CTC CTG TTT CCA AGC ATGGCG AGC CAC AGC CAC CGC GAC TTC CAGPrimer3:GCT CTA GAC TAT TAC TTG GAG GCA GTC ATG AAG CTG TTCTCA ATG CAT AGC ACG ATG TAG GCG TGPrimer2與primer3進行第一次PCR擴增，回收615bp片段，再用primer1與primer3對615bp片段進行第二次PCR擴增，回收647bp片段，應用EcoRⅠ+XbaⅠ對酶切，將該基因插入pbluescriptⅡKS(+)載體(購于美國ATCC公司)中進行測序，其測序結果見下GAATTCACCATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCCACAGCCACCGCGACTTCCAGCCGGTGCTCCACCTGGTTGCGCTCAACAGCCCCCTGTCAGGCGGCATGCGGGGCATCCGCGGGGCCGACTTCCAGTGCTTCCAGCAGGCGCGGGCCGTGGGGCTGGCGGGCACCTTCCGCGCCTTCCTGTCCTCGCGCCTGCAGGACCTGTACAGCATCGTGCGCCGTGCCGACCGCGCAGCCGTGCCCATCGTCAACCTCAAGGACGAGCTGCTGTTTCCCAGCTGGGAGGCTCTGTTCTCAGGCTCTGAGGGTCCGCTGAAGCCCGGGGCACGCATCTTCTCCTTTAACGGCAAGGACGTCCTGAGGCACCCCACCTGGCCCCAGAAGAGCGTGTGGCATGGCTCGGACCCCAACGGGCGCAGGCTGACCGAGAGCTACTGTGAGACGTGGCGGACGGAGGCTCCCTCGGCCACGGGCCAGGCCTCCTCGCTGCTGGGGGGCAGGCTCCTGGGGCAGAGTGCCGCGAGCTGCCATCACGCCTACATCGTGCTATGCATTGAGAACAGCTTCATGACTGCCTCCAAGTAATAGTCTAG將其EcoRⅠ+XbaⅠ切下，定向插入pCA13載體EcoRⅠ+XbaⅠ中，命名pCA13-human endostatin。
例二、攜帶血管生成抑素(angiostatin)基因的E1區缺失的腺載體的構建應用多聚酶鏈反應(PCR)技術血管生成抑素(angiostatin)基因，自新鮮的正常人肝組織中抽提總RNA，以隨機引物作逆轉錄反應后進行第一輪PCR，并用兩次多聚酶鏈反應(PCR)技術(方法參見PCR Protools Current Methods and Applications，White BA主編，Humana Press Inc.1993年出版一文獻1)在基因結尾引入EcoRⅠ和XhoⅠ兩個酶切位點，primer4:AGC GAA TTC CAA AAT GGA ACA TAA GGEcoRⅠ血漿纖維蛋白溶酶原49-67primer5:ACA CTT TTC CTT GAC CTG ATT TCA G血漿纖維蛋白溶酶原348-343+111-94primer6:CTG AAA TCA GGT CAA GGA AAA GTG TAT CTC TCAGAG TGC血漿纖維蛋白溶酶原94-111+343-363primer7:5’-AGCCTCGAGCTATTACGCTTCTGTTCCTGAG-3’XhoⅠ(2 Stop)血漿纖維蛋白溶酶原1431-1416Primer4與primer5、primer6與primer7分別進行第一次PCR反應，將其反應產物混合，用primer4與primer7進行再次PCR反應，回收1168bp片段。應用EcoRⅠ+XhoⅠ對酶切，將該基因插入pbluescript ⅡKS(+)載體(購于美國ATCC公司)中進行測序，其測序結果見下GAATTCCAAAATGGAACATAAGGAAGTGGTTCTTCTACTTCTTTTATTTCTGAAATCAGGTCAAGGAAAAGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATGTATGCATTGCAGTGGAGAAAACTATGACGGCAAAATTTCCAAGACCATGTCTGGACTGGAATGCCAGGCCTGGGACTCTCAGAGCCCACACGCTCATGGATACATTCCTTCCAAATTTCCAAACAAGAACCTGAAGAAGAATTACTGTCGTAACCCCGATAGGGAGCTGCGGCCTTGGTGTTTCACCACCGACCCCAACAAGCGCTGGGAACTTTGCGACATCCCCCGCTGCACAACACCTCCACCATCTTCTGGTCCCACCTACCAGTGTCTGAAGGGAACAGGTGAAAACTATCGCGGGAATGTGGCTGTTACCGTTTCCGGGCACACCTGTCAGCACTGGAGTGCACAGACCCCTCACACACATAACAGGACACCAGAAAACTTCCCCTGCAAAAATTTGGATGAAAACTACTGCCGCAATCCTGACGGAAAAAGGGCCCCATGGTGCCATACAACCAACAGCCAAGTGCGGTGGGAGTACTGTAAGATACCGTCCTGTGACTCCTCCCCAGTATCCACGGAACAATTGGCTCCCACAGCACCACCTGAGCTAACCCCTGTGGTCCAGGACTGCTACCATGGTGATGGACAGAGCTACCGAGGCACATCCTCCACCACCACCACAGGAAAGAAGTGTCAGTCTTGGTCATCTATGACACCACACCGGCACCAGAAGACCCCAGAAAACTACCCAAATGCTGGCCTGACAATGAACTACTGCAGGAATCCAGATGCCGATAAAGGCCCCTGGTGTTTTACCACAGACCCCAGCGTCAGGTGGGAGTACTGCAACCTGAAAAAATGCTCAGGAACAGAAGCGTAATAGCTCGAG將其EcoRⅠ+XhoⅠ切下，定向插入pCA13載體EcoRⅠ+XhoⅠ中，命名pCA13-human angiostatin。例三、腺病毒E1b 55Kda蛋白基因部分缺失及在缺失區插入終止密碼子載體的構建pXC.1載體購于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，pXC.1含有5型腺病毒序列bp22-5790。應用內切酶BglⅡ將該載體在3329bp中切開，然后用內切酶Hind Ⅲ再作部分酶切，回收9372bp DNA片段，應用大腸桿菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段對3’凹端補平，即為pXC.1載體中缺失2809bp-3329bp區域(具體方法參見分子克隆實驗指南，科學出版1992出版)。
合成兩個DNA寡核苷酸片段做一個連接頭，其DNA寡核苷酸序列為primer8 TAATGAGTAACTAAprimer9 TTAGTTACTCATTA將兩個DNA寡核苷酸片段各0.1μg混合，100℃變性5分鐘，然后緩慢降溫復性，復性后應用T4噬菌體多核苷酸激酸進行磷酸化。將該磷酸化后的連接頭與缺失2809-3329bp區域的pXC.1載體片段進行連接，命名為pXC-del E1b(方法參見分子克隆實驗指南，科學出版1992出版)。在插入連接頭兩端附近位置中合成引物，分別為primer10 CTG GCC AAT ACC AAC CTT Aprimer11 ATA TGA GCT CAC AAT GCT TC對pXC-del E1b進行聚合酶鏈式反應(PCR)進行體外擴增(方法參見分子克隆實驗指南，科學出版1992出版)，其PCR產物進行測序。結果顯示 CTGGCCAATACCAACCTTATCCTACACGGTGTAAGCTTAATGAGTAACTAAGATCTGGAAGGTGCTGAGGTACGATGAGACCCGCACCAGGTGCAGACCCTGCGAGTGTGGCGGTAAACTATTAGGAACCAGCCTGTGATGCTGGATGTGACCGAGGAGCTGAGGCCCGATCACTTGGTGCTGGCCTGCACCCGCGCTGAGTTTGGCTCTAGCGATGAAGATACAGATTGAGGTACTGAAATGTGTGGGCGTGGCTTAAGGGTGGGAAAGAATATATAAGGTGGGGGTCTTATGTAGTTTTGTATCTGTTTTGCAGCAGCCGCCGCCGCCATGAGCACCAACTCGTTTGATGGAAGCATTGTGAGCTCATAT， 這表明pXC-del E1b為pXC.1載體中缺失了2809-3329區域并在該區域中插入TAATGAGTAACTAA，并在兩個終止密碼子后保留了BglⅡ酶切位點。例四、攜帶人內皮抑素或血管生成抑素的E1b 55Kda蛋白基因部分缺失的腺病毒載體的構建應用BglⅡ分別酶切pCA13-human endostatin和pCA13-humanangiostatin，分別回收1237bp(含有人巨細胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信號肽的人內皮抑素基因及SV40poly A加尾信號)及1758bp(人巨細胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、人血管生成抑制及SV40 poly A加尾信號)，將其插入pXC-delE1b BglⅡ酶切位點，應用PCR技術分別驗證其插入的正反方向其BglⅡ上游引物primer10:CTG GCC AAT ACC AAC CTT A分別與人內皮抑素5’及3’-primer進行擴增primer12人內皮抑素5’-primer(位于M-成瘤蛋白信號肽及人內皮抑素基因中110-131bp)TCC ACC TGG TTG CGC TCA ACA Gprimer13人內皮抑素3’-primer(位于M-成瘤蛋白信號肽及人內皮抑素基因中577-600bp)AGC ACG ATG TAG GCG TGA TGG C分別與人血管生成抑素5’及3’-primer進行擴增primer14人血管生成抑素5’-primer(位于人血管生成抑素11-32bp)ATG GAA CAT AAG GAA GTG GTT Cprimer15人血管生成抑素3’-primer(位于人血管生成抑素823-842bp) AGG AGT CAC AGG ACG GTA TC其primer10與primer13能擴增到1056bp，表明含有人巨細胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信號肽的人內皮抑素基因及SV40 poly A加尾信號正向插入pXC-del E1b Bgl Ⅱ酶切位點，命名為pXC-del E1b-endostatinl。其primer10與primer12能擴增到752bp，表明含有人巨細胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信號肽的人內皮抑素基因及SV40 poly A加尾信號反向插入pXC-del E1b BglⅡ酶切位點。命名為pXC-delE1b-endostatin2其primer10與primer15能擴增到1298bp，表明含有人巨細胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、人血管生成抑素基因及SV40poly A加尾信號正向插入pXC-del E1b BglⅡ酶切位點，命名為pXC-del E1b-angiostatin1。其primer10與primer14能擴增到1374bp，表明含有人巨細胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、人血管生成抑素基因及SV40 poly A加尾信號反向插入pXC-del E1b BglⅡ酶切位點，命名為pXC-del E1b-angiostatin2。例五、攜帶人內皮抑素或血管生成抑素的E1b 55Kda蛋白基因部分缺失的腺病毒的重組將本發明的缺陷型病毒轉染至E1轉化人胚胎腎細胞株293或E1轉化的人胚胎視網膜細胞株911細胞，本發明例將其轉染293細胞，293細胞株購于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，是由剪切的5型腺病毒DNA轉化人胚胎腎細胞而成，它含有及表達5型腺病毒E1區，腺病毒DNA對其具有高轉染率。將含有5型腺病毒左臂的質粒聯合含有5型腺病毒右臂的質粒共轉染293細胞，通過同源重組可產生具有感染力的腺病毒。我們將pXC-del E1b-endostatin1 pXC-del E1b-endostatin2、pXC-de1 E1b-angiostatin1或pXC-del E1b-angiostatin2分別與含有5型腺病毒右臂的質粒pBHG10或pBHGE3通過Lipofectamine共轉染至293細株，其具體方法參見GIBCO BRL公司的操作說明。pBHG10及pBHGE3購于加拿大Microbix Biosystems Inc.(0ntario)，pBHG10含有5型腺病毒右臂，但缺失E3區；pBHGE3含有5型腺病毒右臂，含有E3區。共轉染后9-14天出現病毒空斑，經過三次病毒空斑純化，該腺病毒命名為CNHK-endostatin1-1、CNHK-endostatin1-2、CNHK-endostatin2-1CNHK-endostatin2-2及CNHK-angiostatin1-1、CNHK-angiostatinl-2、CNHK-angiostatin2-1、CNHK-angiostatin2-2，具體方法參見GeneTransfer and Expression Protocols，Murray EJ主編，Humana Press1991出版。
病毒的產生及基因組結構重組腺病毒方法參見例一內容。其名稱見下
腺病毒在293細胞中大量繁殖，應用氯化銫梯度離心的方法大量純化腺病毒(具體方法參見Gene Transfer and ExpressionProtocols,Murray EJ主編，Humana Press 1991出版)。Ad5-del E1b-endostatin1(CNHK-endostatin-1-1)為5型腺病毒，在2809-3329bp區域(E1b 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突變，并在缺失突變區域中插入含有兩個終止密碼子的序列TAATGAGTAACTAA，并在終止密碼子后BglⅡ酶切位點中正向插入含有人巨細胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信號肽的人內皮抑素基因及SV40 polyA加尾信號基因序列，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。Ad5-delE1b-endostatin2(CNHK-endostatin-1-2)為5型腺病毒，在2809-3329bp區域(E1b 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突變，并在缺失突變區域中插入含有兩個終止密碼子的序列TAATGAGTAACTAA，并在終止密碼子后BglⅡ酶切位點中反向插入含有人巨細胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299-+72)、含有M-成瘤蛋白信號肽的人內皮抑素基因及SV40 poly A加尾信號基因序列，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。Ad5-del E1b E3-endostatin1(CNHK-endostatin-2-1)為5型腺病毒，在2809-3329bp區域(E1b 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突變，并在缺失突變區域中插入含有兩個終止密碼子的序列TAATGAGTAACTAA，并在終止密碼子后BglⅡ酶切位點中正向插入含有人巨細胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信號肽的人內皮抑素基因及SV40 poly A加尾信號基因序列，同時伴有28133-30818bp(E3區部分序列)缺失，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。Ad5-del E1b E3-endostatin2(CNHK-endostatin-2-2)為5型腺病毒，在2809-3329bp區域(E1b 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突變，并在缺失突變區域中插入含有兩個終止密碼子的序列TAATGAGTAACTAA，并在終止密碼子后BglⅡ酶切位點中反向插入含有人巨細胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信號肽的人內皮抑素基因及SV40 poly A加尾信號基因序列，同時伴有28133-30818bp(E3區部分序列)缺失，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。
Ad5-del E1b-angiostatin1(CNHK-angiostatin-1-1)為5型腺病毒，在2809-3329bp區域(E1b 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突變，并在缺失突變區域中插入含有兩個終止密碼子的序列TAATGAGTAACTAA，并在終止密碼子后BglⅡ酶切位點中正向插入含有人巨細胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、人angiostatin及SV40 poly A加尾信號基因序列，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。Ad5-del E1b-angiostatin 2(CNHK-angiostatin-1-2)為5型腺病毒，在2809-3329bp區域(E1b 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突變，并在缺失突變區域中插入含有兩個終止密碼子的序列TAATGAGTAACTAA，并在終止密碼子后BglⅡ酶切位點中反向插入含有人巨細胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、人angiostatin及SV40 poly A加尾信號基因序列，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。Ad5-del E1b E3-angiostatin1(CNHK-angiostatin-2-1)為5型腺病毒，在2809-3329bp區域(E1b 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突變，并在缺失突變區域中正向插入含有兩個終止密碼子的序列TAATGAGTAACTAA，并在終止密碼子后BglⅡ酶切位點中正向插入含有人巨細胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、人angiostatin及SV40 poly A加尾信號基因序列，同時伴有281 33-30818bp(E3區部分序列)缺失，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。Ad5-del E1bE3-angiostatin2(CNHK-angiostatin-2-2)為5型腺病毒，在2809-3329bp區域(E1b 55Kda蛋白基因部分序列)缺失突變，并在缺失突變區域中插入含有兩個終止密碼子的序列TAATGAGTAACTAA，并在終止密碼子后BglⅡ酶切位點中反向插入含有人巨細胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、人angiostatin及SV40 poly A加尾信號基因序列，同時伴有28133-30818bp(E3區部分序列)缺失，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。例六、攜帶人內皮抑素或血管生成抑素的E1b 55Kda蛋白基因部分缺失的重組腺病毒體外腫瘤細胞復制、增殖并高效表達人內皮抑素或人血管生成抑素，并在體外特異性殺滅腫瘤細胞將CNHK-endostatin1-1、CNHK-endostatin1-2、CNHK-angiostatin1-1及CNHK-angiostatin1-2分別感染肝癌細胞株Hep3B、293及正常人成纖維細胞，細胞按2×105/孔接種6孔板，分別感染重組腺病毒CNHKEBV-endostatin1-1、CNHKEBV-endostatin1-2、CNHKEBV-angiostatin1-1、CNHKEBV-angiostatin1-2及野生型5型腺病毒4×105pfu，48小時后應用293細胞株測定其病毒滴度，具體方法參見前述文獻2，結果為
將肝癌細胞株Hep3B及正常人成纖維細胞分別感染重組腺病毒CNHK-endostatin1-1、CNHK-endostatin1-2、CNHK-angiostatin1-1及CNHK-angiostatin1-2，MOI為1，37℃孵育1小時，感染后7天收集細胞，應用QIAamp DNA Blood mini kit(德國QIAGEN公司)提取病毒DNA，方法參見QIAGEN公司操作說明。應用NheⅠ和XhoⅠ雙酶切，用0.8％的瓊脂糖電泳，將其轉至尼龍膜，用32P標記人5型腺病毒1178bp BstXⅠ加XhoⅠ片段(位于腺病毒nt4611-5789)，進行souther blot雜交，以pXC.1作為病毒拷貝數對照(方法參見分子克隆實驗指南，科學出版1992出版)，CNHK-endostatin1-1、CNHK-endostatin1-2、CNHK-angiostatin1-1及CNHK-angiostatin1-2在肝癌細胞株Hep3B及正常人成纖維細胞的每個細胞病毒拷貝數分別為2×104、3×104、1×104、1×104及＜10、＜10、＜10、＜10。
將上述CNHK-endostatin1-1及CNHK-endostatin1-2提取的DNA分別應用BglⅡ酶切，用1％的瓊脂糖電泳，將其轉至尼龍膜，用32P分別標記人內皮抑素cDNA片段(EcoRⅠ與XbaⅠ雙酶切pCA13-humanendostatin，回收637bp)作為探針，進行souther blot雜交，以pCA13-human endostatin作為病毒拷貝數對照(方法參見分子克隆實驗指南，科學出版1992出版)，CNHK-endostatin1-1及CNHK-endostatin1-2在肝癌細胞株Hep3B及正常人成纖維細胞的每個細胞病毒拷貝數分別為2×104、3×104及＜10、＜10。將上述CNHK-angiostatin1-1及CNHK-angiostatin1-2提取的DNA分別應用BglⅡ酶切，用1％的瓊脂糖電泳，將其轉至尼龍膜，用32P分別標記人血管生成抑素cDNA片段(EcoRⅠ與XbaⅠ雙酶切pCA13-human angiostatin，回收1168bp)作為探針，進行souther blot雜交，以pCA13-human angiostatin作為病毒拷貝數對照(方法參見分子克隆實驗指南，科學出版1992出版)，CNHK-angiostatin1-1及CNHK-angiostatin1-2在肝癌細胞株Hep3B及正常人成纖維細胞的每個細胞病毒拷貝數分別為1×104、1×104及10、10。例七、攜帶人內皮抑素或血管生成抑素的E1b 55Kda蛋白基因部分缺失的重組腺病毒在裸鼠體內治療移植腫瘤并高效表達人內皮抑素或人血管生成抑素，抑制腫瘤新生血管形成，抑制腫瘤形成、生長及轉移。同時該病毒能在而且僅限于腫瘤細胞內增殖，也能特異性直接殺滅腫瘤細胞。將4-5周齡的SCID小鼠皮下接種肝癌細胞株Hep 3B細胞1×107，兩周后給予1×109pfu增殖型重組腺病毒CNHK101治療或用相同劑量的對照腺病毒Ad5-LacZ，其未治療組及對照腺病毒治療組4周后腫瘤體增加4倍以上，而治療組則腫瘤明顯縮小，部分腫瘤完全消失。例八含有EB病毒順式作用元件的載體的構建以pCAT-Basic為基礎載體，在其多克隆位點中插入EB病毒Orip中的family of 30bp repeats(FR，位于EB病毒7337-8190bp)聯合SV40基本啟動子(mini-SV40)，pCAT-Basic購自Promega公司。應用PCR技術擴增EB病毒Orip中的family of 30bp repeats及mini-SV40啟動子。前者的模板EB病毒DNA從淋巴瘤細胞株B95-8中提取，其提取病毒DNA方法參見QIAGEN公司QIAamp Blood試劑盒的操作說明。后者的模板為pCAT-Control(購于Promega公司)。EB病毒Orip中的FR的引物為primer16:5’-引物(含有Hind Ⅲ及AgeⅠ酶切位點)GGG AAG CTTACC GGT GCA TGC AGG AAA AGG ACA AGCprimer17:3’-引物(含有部分mini-SV40啟動子序列)GAG ATGCAG ATC AAT GGC ACC CCG GGG AAT ACCmini-SV40啟動子的引物為primer18:5’-引物(含有部分Orip中的FR序列)GTG CCA TTG ATCTGC ATC TCA ATT AGT CAGprimer19:3’-引物(含有SalⅠ及AgeⅠ酶切位點)GCT AAA GTCGAC ACC GGT AAG CTT TTT GCA AAA GCC TAG應用兩次疊加PCR技術(方法同前)將EB病毒Orip中的FR序列和mini-SV40啟動子產生融合啟動子，將其融合啟動子PCR片段應用Hind Ⅲ及SalⅠ雙酶切插入pCAT-Basic載體Hind Ⅲ及SalⅠ位點中(方法參見分子克隆實驗指南，科學出版1992出版)。將該片段進行DNA測序，其融合啟動子序列完全正確，記為CHEB-FRSV40。
以pbluescriptⅡKS(+)為基礎載體(購于美國ATCC公司)，在其多克隆位點中插入EB病毒Orip中的family of 30bp repeats(FR，位于EB病毒7337-8190bp)聯合HSV-TK基本啟動子(mini-TK)，pbluescriptⅡ購自Promega公司。應用PCR技術擴增EB病毒Orip中的family of 30bp repeats及mini-SV40啟動子。前者的模板EB病毒DNA從淋巴瘤細胞株B95-8中提取，其提取病毒DNA方法參見QIAGEN公司QIAamp Blood試劑盒的操作說明。后者的模板為(購于Invitrogen公司)。
EB病毒Orip中的FR的引物為Primer 20:5’-引物(含有XhoⅠ酶切位點)GGG CAT CTC GAG GCATGC AGG AAA AGG ACA AGCPrimer 21:3’-引物(含有部分mini-HSV-TK啟動子序列)AGT CGGGGC GGC AAT GGC ACC CCG GGG AAT ACCmini-HSV-TK啟動子的引物為
Primer22:5’-引物(含有部分Orip中的FR序列)GGT GCC ATT GCCGCC CCG ACT GCA TCT GCPrimer23:3’-引物(含有XbaⅠ酶切位點)TTT TCT AGA CTT CTGCTT CAT CCC CGT G應用兩次疊加PCR技術(方法同前)將EB病毒Orip中的FR序列和mini-TK啟動子產生融合啟動子，將其融合啟動子PCR片段應用XhoⅠ及XbaⅠ雙酶切插入pbluescriptⅡKS(+)載體(購于美國ATCC公司)XhoⅠ及XbaⅠ位點中(方法參見分子克隆實驗指南，科學出版1992出版)。將該片段進行DNA測序，其融合啟動子序列完全正確，記為CHEB-FRTK。例九攜帶內皮抑素或血管生成抑素的EB病毒順式作用元件控制E1A及E1B表達的減毒增殖腺病毒載體的構建。pXC.1載體購于加拿大Microbix Biosystem Inc.(oronto),pXC.1含有5型腺病毒序列bp22-5790。在該載體中552bp處創立一個新的、唯一的AgeⅠ酶切位點，該位點位于E1A起始密碼前12bp，其方法采用定位突變雙次PCR技術(方法參見前述文獻1)。其引物分別為primer24:5’-引物(含有EcoRⅠ酶切位點)TTC AAG AAT TCT CATGTT TGprimer25:3’-引物(插入一個A，從而產生一個AgeⅠ酶切位點)CAG TCA CCG GTG TCG GAG Cprimer26:5’-引物(插入一個T，從而產生一個AgeⅠ酶切位點)GCT CCG ACA CCG GTG ACT GA
primer27:3’-引物(含有XbaⅠ酶切位點)TTC TCT AGA CAC AGG TGATG采用定位突變雙次PCR技術，PCR產物片段插入pGEM-T-easy載體中(方法參見Promega公司操作說明書)，命名為pGEM-T-Ela。將該片段進行DNA測序，其測序結果顯示在pXC.1質粒bp552位點中插入T，從而產生一個新的AgeⅠ酶切位點，其它序列與pXC.1相同。應用EcoRⅠ與XbaⅠ雙酶切pGEM-T-E1A及pXC.1質粒，將pGEM-T-E1A中切出片段插入pXC.1質粒中EcoRⅠ及BamHⅠ位點中，從而使pXC.1中552插入一個T，從而產生一個AgeⅠ酶切位點，該位點位于E1A起始密碼前12bp，將該質粒命名為pXC.1-AgeⅠ。
CHEB分別用AgeⅠ酶切，其酶切片段分別插入pXC-AgeⅠ質粒中AgeⅠ酶切位點中，分別應用引物24及19進行PCR擴增，擴出2050bp，這表明EB病毒Orip中的family of 30bp repeats聯合mini-SV40啟動子已正向插入pXC-AgeⅠ質粒AgeⅠ位點，即腺病毒5型E1A起始密碼子上游區12bp處，命名為pXC-FRSVE1A。為進一步證實EB病毒Orip中的family of 30bp repeats聯合mini-SV40啟動子已正向插入pXC-AgeⅠ質粒AgeⅠ位點，本研究將pXC-FRSVE1A載體應用EcoRⅠ加XbaⅠ作雙酶切，回收2823bp片段，插入pBluescriptⅡSK載體EcoRⅠ及XbaⅠ酶切位點進行測序，結果證實EB病毒Orip中的family of 30bp repeats聯合mini-SV40啟動子已正向插入pXC-AgeⅠ質粒AgeⅠ位點，序列如下GAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCACACCCGTCCTGTGGATCCGGGCCCCCATTTCCCCTCCCTTCCAGCTCTCTGCCCCTTTTGGATTGAAGCCAATATGATAATGAGGGGGTGGAGTTTGTGACGTGGCGCGGGGCGTGGGAACGGGGCGGGTGACGTAGTAGTGTGGCGGAAGTGTGATGTTGCAAGTGTGGCGGAACACATGTAAGCGACGGATGTGGCAAAAGTGACGTTTTTGGTGTGCGCCGGTGTACACAGGAAGTGACAATTTTCGCGCGGTTTTAGGCGGATGTTGTAGTAAATTTGGGCGTAACCGAGTAAGATTTGGCCATTTTCGCGGGAAAACTGAATAAGAGGAAGTGAAATCTGAATAATTTTGTGTTACTCATAGCGCGTAATATTTGTCTAGGGCCGCGGGGACTTTGACCGTTTACGTGGAGACTCGCCCAGGTGTTTTTCTCAGGTGTTTTCCGCGTTCCGGGTCAAAGTTGGCGTTTTATTATTATAGTCAGCTGACGTGTAGTGTATTTATACCCGGTGAGTTCCTCAAGAGGCCACTCTTGAGTGCCAGCGAGTAGAGTTTTCTCCTCCGAGCCGCTCCGACACCGGTGCATGCAGGAAAAGGACAAGCAGCGAAAATTCACGCCCCCTTGGGAGGTGGCGGCATATGCAAAGGATAGCACTCCCACTCTACTACTGGGTATCATATGCTGACTGTATATGCATGAGGATAGCATATGCTACCCGGATACAGATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAAATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTATCCAGATATTTGGGTAGTATATGCTACCCAGATATAAATTAGGATAGCATATACTACCCTAATCTCTATTAGGATAGCATATGCTACCCGGATACAGATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAAATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTATCCAGATATTTGGGTAGTATATGCTACCCATGGCAACATTAGCCCACCGTGCTCTCAGCGACCTCGTGAATATGAGGACCAACAACCCTGTGCTTGGCGCTCAGGCGCAAGTGTGTGTAATTTGTCCTCCAGATCGCAGCAATCGCGCCCCTATCTTGGCCCGCCCACCTACTTATGCAGGTATTCCCCGGGGTGCCATTGATCTGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTACCGGTGACTGAAAATGAGACATATTATCTGCCACGGAGGTGTTATTACCGAAGAAATGGCCGCCAGTCTTTTGGACCAGCTGATCGAAGAGGTACTGGCTGATAATCTTCCACCTCCTAGCCATTTTGAACCACCTACCCTTCACGAACTGTATGATTTAGACGTGACGGCCCCCGAAGATCCCAACGAGGAGGCGGTTTCGCAGATTTTTCCCGACTCTGTAATGTTGGCGGTGCAGGAAGGGATTGACTTACTCACTTTTCCGCCGGCGCCCGGTTCTCCGGAGCCGCCTCACCTTTCCCGGCAGCCCGAGCAGCCGGAGCAGAGAGCCTTGGGTCCGGTTTCTATGCCAAACCTTGTACCGGAGGTGATCGATCTTACCTGCCACGAGGCTGGCTTTCCACCCAGTGACGACGAGGATGAAGAGGGTGAGGAGTTTGTGTTAGATTATGTGGAGCACCCCGGGCACGGTTGCAGGTCTTGTCATTATCACCGGAGGAATACGGGGGACCCAGATATTATGTGTTCGCTTTGCTATATGAGGACCTGTGGCATGTTTGTCTACAGTAAGTGAAAATTATGGGCAGTGGGTGATAGAGTGGTGGGTTTGGTGTGGTAATTTTTTTTTTAATTTTTACAGTTTTGTGGTTTAAAGAATTTTGTATTGTGATTTTTTTAAAAGGTCCTGTGTCTGAACCTGAGCCTGAGCCCGAGCCAGAACCGGAGCCTGCAAGACCTACCCGCCGTCCTAAAATGGCGCCTGCTATCCTGAGACGCCCGACATCACCTGTGTCTpXC.1載體購于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Tronto)，pXC.1含有5型腺病毒序列bp22-5790。在該載體中1686bp處創立多個酶切位點，包括BglⅡ、BamHⅠ、XhoⅠ及XbaⅠ，該酶切位點位于E1B轉錄位點與起始密碼之間，其方法采用定位突變雙次PCR技術(方法參見上述文獻1)。其引物分別為primer28:5’-引物(含有Hind Ⅲ及HpaⅠ酶切位點)TTT TGCAAG CTT GTT AAC GCC TTT GTT TGC TGAprimer29:3’-引物(產生四個酶切位點)CTC GAG GGA TCC AGA TCTGCG CAT TAT ATA CCC TTT AAGprimer30:5’-引物(產生四個酶切位點)AGA TCT GGA TCC CTC GAGTGA TCT AGA GGG CTA ATC TTG GTT ACA TCprimer31:3’-引物(含有KpaⅠ酶切位點)CCA GAA AAT CCA GCAGGT AAC采用定位突變雙次PCR技術，PCR產物片段經HindⅢ和KpnⅠ酶切，插入pUC19載體中HindⅢ和KpnⅠ酶切點，pUC19購于美國ATCC公司，命名為pUC-E1B。將該片段進行DNA測序，其測序結果顯示在E1b轉錄起始位點與編碼起始位點中插入BglⅡ、BamHⅠ、XhoⅠ及XbaⅠ酶切位點，其它序列與pXC.1相同。
將CHEB-FRTK用XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切，其片段插入pUC-E1B中XhoⅠ和XbaⅠ酶切位點，即在E1B轉錄起始位點與編碼起始位點中正向插入EB病毒Orip中的family of 30bp repeats聯合mini-TK啟動子，命名pUC-E1B-FRTK，應用引物28及23進行PCR擴增，擴出1159bp，這表明EB病毒Orip中的FR聯合mini-TK啟動子已正向插入pUC質粒XhoⅠ和XbaⅠ位點。其測序結果如下GTTAACGCCTTTGTTTGCTGAATGAGTTGATGTAAGTTTAATAAAGGGTGAGATAATGTTTAACTTGCATGGCGTGTTAAATGGGGCGGGGCTTAAAGGGTATATAATGCGCAGATCTGGATCCCTCGAGGCATGCAGGAAAAGGACAAGCAGCGAAAATTCACGCCCCCTTGGGAGGTGGCGGCATATGCAAAGGATAGCACTCCCACTCTACTACTGGGTATCATATGCTGACTGTATATGCATGAGGATAGCATATGCTACCCGGATACAGATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAAATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTATCCAGATATTTGGGTAGTATATGCTACCCAGATATAAATTAGGATAGCATATACTACCCTAATCTCTATTAGGATAGCATATGCTACCCGGATACAGATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAAATTAGGATAGCATATACTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCCTATGCTACCCAGATATAGATTAGGATAGCATATGCTATCCAGATATTTGGGTAGTATATGCTACCCATGGCAACATTAGCCCACCGTGCTCTCAGCGACCTCGTGAATATGAGGACCAACAACCCTGTGCTTGGCGCTCAGGCGCAAGTGTGTGTAATTTGTCCTCCAGATCGCAGCAATCGCGCCCCTATCTTGGCCCGCCCACCTACTTATGCAGGTATTCCCCGGGGTGCCATTGCCGCCCCGACTGCATCTGCGTGTTCGAATTCGCCAATGACAAGACGCTGGGCGGGGTTTGTGTCATCATAGAACTAAAGACATGCAAATATATTTCTTCCGGGGACACCGCCAGCAAACGCGAGCAACGGGCCACGGGGATGAAGCAGAAGTCTAGAGGGCTAATCTTGGTTACATCTGACCTCATGGAGGCTTGGGAGTGTTTGGAAGATTTTTCTGCTGTGCGTAACTTGCTGGAACAGAGCTCTAACAGTACCTCTTGGTTTTGGAGGTTTCTGTGGGGCTCATCCCAGGCAAAGTTAGTCTGCAGAATTAAGGAGGATTACAAGTGGGAATTTGAAGAGCTTTTGAAATCCTGTGGTGAGCTGTTTGATTCTTTGAATCTGGGTCACCAGGCGCTTTTCCAAGAGAAGGTCATCAAGACTTTGGATTTTTCCACACCGGGGCGCGCTGCGGCTGCTGTTGCTTTTTTGAGTTTTATAAAGGATAAATGGAGCGAAGAAACCCATCTGAGCGGGGGGTACCTG應用BglⅡ分別酶切pCA13-human endostatin和pCA13-humanangiostatin，分別回收1237bp(含有人巨細胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信號肽的人內皮抑素基因及SV40poly A加尾信號)及1758bp(人巨細胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、人血管生成抑制及SV40 poly A加尾信號)，將其插入pUC-E1B-FRTK中BglⅡ酶切位點，應用PCR技術分別驗證其插入的正反方向其BglⅡ上游引物primer32:GTT AAC GCC TTT GTT TGC TGA分別與人內皮抑素5’及3’-primer進行擴增primer12人內皮抑素5’-primer(位于M-成瘤蛋白信號肽及人內皮抑素基因中110-131bp)TCC ACC TGG TTG CGC TCA ACA Gprimer13人內皮抑素3’-primer(位于M-成瘤蛋白信號肽及人內皮抑素基因中577-600bp)AGC ACG ATG TAG GCG TGA TGG C
分別與人血管生成抑素5’及3’-primer進行擴增primer14人血管生成抑素5’-primer(位于人血管生成抑素11-32bp)ATG GAA CAT AAG GAA GTG GTT Cprimer15人血管生成抑素3’-primer(位于人血管生成抑素823-842bp)AGG AGT CAC AGG ACG GTA TC其primer32與primer13能擴增到1122bp，表明含有人巨細胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信號肽的人內皮抑素基因及SV40 poly A加尾信號正向插入pUC-E1B-FRTK BglⅡ酶切位點，命名為pUC-E1B-FRTK-endostatin1。其primer32與primer12能擴增到818bp，表明含有人巨細胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信號肽的人內皮抑素基因及SV40 polyA加尾信號反向插入pUC-E1B-FRTK BglⅡ酶切位點。命名為pUC-E1B-FRTK-endostatin2。
其primer32與primer15能擴增到1364bp，表明含有人巨細胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、人血管生成抑素基因及SV40poly A加尾信號正向插入pUC-E1B-FRTK BglⅡ酶切位點，命名為pUC-E1B-FRTK-angiostatin1。其primer32與primer14能擴增到1440bp，表明含有人巨細胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、人血管生成抑素基因及SV40 poly A加尾信號反向插入pUC-E1B-FRTKBglⅡ酶切位點，命名為pUC-E1B-FRTK-angiostatin2。
應用HpaⅠ和KpnⅠ雙酶切pUC-E1B-FRTK-endostatin1、pUC-E1B-FRTK-endostatin2、pUC-E1B-FRTK-angiostatin1及pUC-E1B-FRTK-angiostatin2，回收片段，分別插入pXC-FRSVE1A中HpaⅠ和KpnⅠ酶切位點，分別命名為pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-endostatin1、pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-endostatin2、pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-angiostatin1及pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-angiostatin2。例十攜帶內皮抑素或血管生成抑素的EB病毒順式作用元件控制E1A及E1B表達的減毒增殖腺病毒的重組。
293細胞株購于加拿大Microbix Biosystem Inc.(Toronto)，是由剪切的5型腺病毒DNA轉化人胚胎腎細胞而成，它含有及表達5型腺病毒E1區，腺病毒DNA對其具有高轉染率。將含有5型腺病毒左臂的質粒聯合含有5型腺病毒右臂的質粒共轉染293細胞，通過同源重組可產生具有感染力的腺病毒。我們將pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-endostatin1、pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-endostatin2、pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-angiostatin1及pXC-FRSVE1A-FRTKE1B-angiostatin2與含有5型腺病毒右臂的質粒pBHG10通過Lipofectamine共轉染至293細株，其具體方法參見GIBCO BRL公司的操作說明。PBHG10購于加拿大Microbix BiosystemsInc.(Ontario)，含有5型腺病毒右臂，但缺失E3區。共轉染后9-14天出現病毒空斑，經過三次病毒空斑純化，即得E1A及E1B受EB病毒順式作用元件Orip FR聯合mini-SV40啟動子及Orip FR聯合mini-HSV-TK啟動子控制的腺病毒，并攜帶人內皮抑素或血管生成抑素，分別命名為EBV FRSVEIA-FRTKE1B-endostatin1、EBV FRSVEIA-FRTKE1B-endostatin2、EBV FRSVEIA-FRTKE1B-angiostatin1及FRSVEIA-FRTKE1B-angiostatin2，分別記為CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-endostatin2、CNHKEBV-angiostatin1及CNHKEBV-angiostatin2。
由上述方法構建的重組病毒的列表如下
腺病毒在293細胞中大量繁殖，應用氯化銫梯度離心的方法大量純化腺病毒(具體方法參見前述文獻2出版)。EBV FRSVEIA-FRTKE1B-endostatin1(CNHKEBV-endostatin1)為5型腺病毒，在E1A及E1B轉錄起始位點與編碼起始位點之間分別插入EB病毒順式作用元件0rip FR聯合mini-SV40啟動子及Orip FR聯合mini-HSV-TK啟動子，并在E1A終止密碼子后與Orip FR聯合mini-HSV-TK啟動子上游區之間新建一個BglⅡ酶切位點，在該酶切位點中正向插入含有人巨細胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信號肽的人內皮抑素基因及SV40 poly A加尾信號基因序列，同時伴有28133-30818bp(E3區部分序列)缺失，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。EBV FRSVEIA-FRTK E1B-endostatin2(CNHKEBV-endostatin2)為5型腺病毒，在E1A及E1B轉錄起始位點與編碼起始位點之間分別插入EB病毒順式作用元件Orip FR聯合mini-SV40啟動子及Orip FR聯合mini-HSV-TK啟動子，并在E1A終止密碼子后與Orip FR聯合mini-HSV-TK啟動子上游區之間新建一個BglⅡ酶切位點，在該酶切位點中反向插入含有人巨細胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、含有M-成瘤蛋白信號肽的人內皮抑素基因及SV40polyA加尾信號基因序列，同時伴有28133-30818bp(E3區部分序列)缺失，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。
EBV FRSVEIA-FRTK E1B-angiostatin1(CNHKEBV-angiostatin1)為5型腺病毒，在E1A及E1B轉錄起始位點與編碼起始位點之間分別插入EB病毒順式作用元件0rip FR聯合mini-SV40啟動子及OripFR聯合mini-HSV-TK啟動子，并在E1A終止密碼子后與OripFR聯合mini-HSV-TK啟動子上游區之間新建一個BglⅡ酶切位點，在該酶切位點中正向插入含有人巨細胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、含人血管生成抑素基因及SV40 poly A加尾信號基因序列，同時伴有28133-30818bp(E3區部分序列)缺失，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。EBV FRSVEIA-FRTK E1B-angiostatin2(CNHKEBV-angiostatin2)為5型腺病毒，在E1A及E1B轉錄起始位點與編碼起始位點之間分別插入EB病毒順式作用元件Orip FR聯合mini-SV40啟動子及Orip FR聯合mini-HSV-TK啟動子，并在E1A終止密碼子后與Orip FR聯合mini-HSV-TK啟動子上游區之間新建一個BglⅡ酶切位點，在該酶切位點中反向插入含有人巨細胞病毒(HCMV)IE啟動子(-299--+72)、含有人血管生成抑素基因及SV40poly A加尾信號基因序列，同時伴有28133-30818bp(E3區部分序列)缺失，病毒其他DNA序列與5型腺病毒相同。例十一攜帶人內皮抑素或人血管生成抑素的EB病毒順式作用元件控制E1A及E1B表達的減毒增殖腺病毒的體外在EB感染或潛伏感染的腫瘤細胞增殖、復制及高效表達人內皮抑素或人血管生成抑素因子并特異性殺滅腫瘤細胞。
將CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-angiostatin1及CNHKEBV-angiostatin2分別感染EB病毒感染的淋巴瘤細胞株Jijoye、293及正常人成纖維細胞，細胞按2×105/孔接種6孔板，分別感染重組腺病毒CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-angiostatin1、CNHKEBV-angiostatin2及野生型5型腺病毒4×105pfu，48小時后應用293細胞株測定其病毒滴度，具體方法參見前述文獻2，結果為
將感染EB病毒感染的淋巴瘤細胞株Jijoye及正常人成纖維細胞分別感染重組腺病毒CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-endostatin2、CNHKEBV-angiostatin1及CNHKEBV-angiostatin2，MOI為1，37℃孵育1小時，感染后7天收集細胞，應用QIAamp DNA Bloodmini kit(德國QIAGEN公司)提取病毒DNA，方法參見QIAGEN公司操作說明。應用NheⅠ和XhoⅠ雙酶切，用0.8％的瓊脂糖電泳，將其轉至尼龍膜，用32P標記人5型腺病毒1178bp BstⅪ加XhoⅠ片段(位于腺病毒nt4611-5789)，進行souther blot雜交，以pXC.1作為病毒拷貝數對照(方法參見分子克隆實驗指南，科學出版1992出版)，CNHKEBV-endostatin1、CNHKEBV-endostatin2、CNHKEBV-angiostatin1及CNHKEBV-angiostatin2在Jijoye及正常人成纖維細胞的每個細胞病毒拷貝數分別為5×104、5×104、4×104、4×104及＜10、＜10、＜10、＜10。將上述CNHKEBV-endostatin1及CNHKEBV-endostatin2提取的DNA分別應用BglⅡ酶切，用1％的瓊脂糖電泳，將其轉至尼龍膜，用32P分別標記人內皮抑素cDNA片段(EcoRⅠ與XbaⅠ雙酶切pCA13-human endostatin，回收637bp)作為探針，進行souther blot雜交，以pCA13-human endostatin作為病毒拷貝數對照(方法參見分子克隆實驗指南，科學出版1992出版)，CNHKEBV-endostatin1及CNHKEBV-endostatin2在Jijoye及正常人成纖維細胞的每個細胞病毒拷貝數分別為5×104、5×104及＜10、＜10。
將上述CNHKEBV-angiostatin1及CNHKEBV-angiostatin2提取的DNA分別應用BglⅡ酶切，用1％的瓊脂糖電泳，將其轉至尼龍膜，用32P分別標記人血管生成抑素eDNA片段(EcoRⅠ與XbaⅠ雙酶切pCA13-human angiostatin，回收1168bp)作為探針，進行southerblot雜交，以pCA13-human angiostatin作為病毒拷貝數對照(方法參見分子克隆實驗指南，科學出版1992出版)，CNHKEBV-angiostatin1及CNHKEBV-angiostatin2在Jijoye及正常人成纖維細胞的每個細胞病毒拷貝數分別為4×104、4×104及＜10、＜10。例十一攜帶人內皮抑素或人血管生成抑素的EB病毒順式作用元件控制E1A及E1B表達的減毒增殖腺病毒的在SCID小鼠體內治療EB病毒感染或潛伏感染的腫瘤細胞移植瘤將4-5周齡的SCID小鼠皮下接種EB病毒感染的淋巴瘤細胞株Jijoye細胞5×107，兩周后給予5×108pfu增殖型重組腺病毒CNHK101治療或用相同劑量的對照腺病毒Ad5-LacZ，其未治療組及對照腺病毒治療組4周后腫瘤體增加3倍以上，而治療組則腫瘤明顯縮小，部分腫瘤完全消失。
權利要求
1．一種能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其特征在于將編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列插入腫瘤細胞內特異性增殖的病毒基因組中的非增殖必需區域，該病毒選擇性地在腫瘤細胞內增殖，而在正常細胞內不增殖，通過病毒在腫瘤細胞內復制增殖，導致編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列拷貝數增加，從而血管生成抑制因子基因表達量增加，該腫瘤細胞內特異性增殖的病毒可以是以下任何一種(1)在腫瘤細胞內特異性增殖的野生型病毒；(2)病毒增殖必需基因的轉錄起始點與編碼起始位點之間插入腫瘤細胞特異性激活的順式作用元件；(3)蛋白功能缺失重組后能在腫瘤細胞內特異性增殖的病毒。
2．根據權利要求1所述能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒的構建方法，其特征在于(1)將編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列直接插入腫瘤細胞內特異性增殖的病毒基因組中的非增殖必需區域；(2)病毒增殖必需基因的轉錄起始點與編碼起始位點之間插入腫瘤細胞特異性激活的順式作用元件；順式作用元件可以是下述任何一種(a).甲胎蛋白增強子及啟動子；(b).癌胚抗原增強子及啟動子；(c).酪氨酸酶增強子及啟動子；(d).ErbB2增強子及啟動子；(e).ErbB3增強子及啟動子；(f).ErbB4增強子及啟動子；(g).DF3乳腺癌相關抗原增強子；(h).前列腺素特異性抗原增強子及啟動子；(i).腺血管舒緩素增強子及啟動子；(j).EB病毒中的Orip；(k).EB病毒Orip中的FR增強子；(l).EB病毒BamHⅠC-啟動子；(m).EB病毒中的Orip聯合EB病毒BamHⅠC-啟動子；(n).EB病毒Orip中的FR聯合單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本啟動子或SV40基本啟動子；(3)蛋白功能缺失重組后能在腫瘤細胞內特異性增殖的病毒；蛋白功能缺失可以是下述任何一種腺病毒E1B 55Kda蛋白功能缺失，腺病毒E1B 19Kda蛋白功能缺失，腺病毒E1A蛋白功能缺失，單純皰疹病毒ICP6蛋白功能缺失，單純皰疹病毒ICP34.5蛋白功能缺失。
3． 根據權利要求1所述的能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其特征在于它由要病毒增殖必需基因的轉錄起始點與編碼起始位點之間區域插入某種腫瘤細胞特異性激活的順式作用元件構成，該種順式作用元件可以是下述任何一種甲胎蛋白增強子及啟動子，癌胚抗原增強子及啟動子，酪氨酸酶增強子及啟動子，ErbB2增強子及啟動子，ErbB3增強子及啟動子，ErbB4增強子及啟動子，DF3乳腺癌相關抗原增強子，前列腺素特異性抗原增強子及啟動子，腺血管舒緩素增強子及啟動子，EB病毒中的Orip，EB病毒Orip中的FR增強子，EB病毒BamHⅠC-啟動子，EB病毒中的Orip聯合EB病毒BamHⅠC-啟動子，EB病毒Orip中的FR聯合單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基本啟動子或SV40基本啟動子，在EB病毒感染或潛伏感染細胞中特異性激活的順式作用元件，病毒增殖必需基因為病毒早期基因。
4．根據權利要求3所述的能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其特征在于所述病毒為腺病毒，該腺病毒增殖必需基因至少含有以下一個腺病毒的早期表達基因E1A、E1B、E2、E4。
5．根據權利要求1所述的能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其特征在于所述病毒是腺病毒時，該腺病毒E1B55Kda通過基因點突變、缺失突變及插入突變導致E1B 55Kda蛋白功能缺失。
6．根據權利要求1所述的能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其特征在于所述病毒是腺病毒時，該腺病毒E1B19Kda通過基因點突變、缺失突變及插入突變導致E1B 19Kda蛋白功能缺失。
7．根據權利要求1所述的能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其特征在于所述病毒是腺病毒時，該腺病毒E1A通過基因點突變、缺失突變及插入突變導致E1A蛋白功能缺失。
8．根據權利要求1所述的能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其特征在于所述病毒是單純皰疹病毒時，該單純皰疹病中ICP6基因點突變、缺失突變及插入突變導致ICP6蛋白功能缺失。
9． 根據權利要求1所述的能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其特征在于所述病毒是單純皰疹病毒時，該單純皰疹病毒中雙拷貝ICP34.5基因點突變、缺失突變及插入突變導致ICP34.5蛋白功能缺失。
10．根據權利要求1所述的能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其特征在于所述編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼含有分泌型信號肽的內皮抑素的核苷酸序列。
11．根據權利要求10所述分泌型信號肽，其特征在于該分泌型信號肽為M-成瘤蛋白信號肽。
12．根據權利要求10所述分泌型信號肽，其特征在于該分泌型信號肽為免疫球蛋白K鏈信號肽。
13．根據權利要求1所述的能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其特征在于所述編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼血管生成抑素的核苷酸序列。
14．根據權利要求13所述的編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列，其特征在于所述編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle1-4結構的核苷酸序列。
15．根據權利要求1所述的能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其特征在于所述編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle1-5結構的核苷酸序列。
16．根據權利要求1所述的能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其特征在于所述編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle1-3結構的核苷酸序列。
17．根據權利要求1所述的能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其特征在于所述編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle1-3加上Kringle5結構的核苷酸序列。
18．根據權利要求1所述的能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其特征在于所述編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle1結構的核苷酸序列。
19．根據權利要求1所述的能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其特征在于所述編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle2結構的核苷酸序列。
20．根據權利要求1所述的能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其特征在于所述編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle3結構的核苷酸序列。
21．根據權利要求1所述的能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其特征在于所述編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼血漿纖維蛋白溶酶原中Kringle5結構的核苷酸序列。
22．根據權利要求1所述的能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其特征在于所述編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼干擾素-α的核苷酸序列。
23．根據權利要求1所述的能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其特征在于所述編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼干擾素-β的核苷酸序列。
24．根據權利要求1所述的能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其特征在于所述編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼干擾素-γ的核苷酸序列。
25．根據權利要求1所述的能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其特征在于所述編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼血小板反應蛋白Ⅰ的核苷酸序列。
26．根據權利要求1所述的能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其特征在于所述編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼血小板因子4的核苷酸序列。
27．根據權利要求1所述的能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其特征在于所述編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼纖溶酶原激活因子抑制劑的核苷酸序列。
28．根據權利要求1所述的能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其特征在于所述編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼白細胞介素-12的核苷酸序列。
29．根據權利要求1所述的能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其特征在于所述編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列為編碼纖維結合素的核苷酸序列。
30．根據權利要求1所述的能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其特征在于所述編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列受啟動子控制。
31．根據權利要求30所述的啟動子，其特征在于所述啟動子為SV40啟動子。
32．根據權利要求30所述的啟動子，其特征在于所述啟動子為RSVLTR啟動子。
33．根據權利要求30所述的啟動子，其特征在于所述啟動子為人巨細胞病毒IE啟動子。
34．根據權利要求1所述的能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其特征在于該病毒與化學抗腫瘤藥物組成復合物。
35．根據權利要求1所述的能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其特征在于將該重組病毒用于抑制腫瘤細胞的生長
36．根據權利要求1所述的能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒的應用，其特征在于將該重組病毒用于體外感染腫瘤細胞，病毒在腫瘤細胞內復制及增殖，導致編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列拷貝數增加及血管生成抑制因子表達量增加。
37．根據權利要求1所述的能高效表達血管生成抑制因子的腫瘤細胞內特異性增殖的病毒，其特征在于將該重組病毒用于體內選擇性地在腫瘤細胞內復制及增殖，導致編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列拷貝數增加及其表達量增加，抑制腫瘤血管的抑制腫瘤血管形成，抑制腫瘤形成、生長及轉移，同時該病毒能在而且僅限于腫瘤細胞內增殖，也能特異性直接殺滅腫瘤細胞。
全文摘要
本發明提供一類高效表達腫瘤血管生成抑制因子的腫瘤細胞特異性增殖的病毒及其構建方法。該病毒選擇性地在腫瘤細胞內增殖,而在正常細胞內不增殖,通過將編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列插入腫瘤細胞內增殖的病毒基因組中的非增殖必需區域,隨著病毒在腫瘤細胞內復制,使編碼血管生成抑制因子的核苷酸序列拷貝數增加,從而在腫瘤細胞高效表達血管生成抑制因子。抑制腫瘤血管形成,抑制腫瘤形成、生長及轉移。同時該病毒能在而且僅限于腫瘤細胞內增殖,也能特異性直接殺滅腫瘤細胞。
文檔編號C12N9/68GK1298947SQ00127680
公開日2001年6月13日 申請日期2000年12月1日 優先權日2000年12月1日
發明者錢其軍, 車小燕, 岑信棠, 吳孟超 申請人:錢其軍