專利名稱：產生黃原膠的無毒力野油菜黃單胞菌菌株的制作方法
技術領域：
本發明涉及喪失了致植物病性質但基本上保持了產生外多糖(exopolysaccharide)，尤其是黃原膠能力的新型細菌菌株，特別是黃單胞菌屬(Xanthomonas)的菌株，尤其是野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)。
野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(X.campestris pv.campestris)是十字花科植物的致植物病的革蘭氏陰性細菌，它用于黃原膠的工業生產(Martin，1994，微生物學研究(Res.Microbiol.)1459 93-97)。
這種外多糖經濟上的重要性引起了許多關于參與此合成的基因的研究(Martin，1994，如上所述)。
已經對致病性的許多決定因素作了描述(Dow和Daniels，1994，植物與動物中的細菌致病原因(In bacterial pathogenesis of plants andanimals)，JL Dangl編，Springer Verlag，Heidelberg)。其中有對植物組織具有水解活性的胞外酶。當負責這些酶輸出的分泌系統失活時，野油菜黃單胞菌的菌株就失去了其致植物病的表型，而此與植物中非常減弱的癥狀有關(Dow和Daniels，1994，如上所述)。所描述的致病性決定因素中，外多糖似乎在疾病的早期顯示出作用(Dow和Daniels，1994，如上所述；Katzen等人，1998，細菌學雜志(J.Bacteriol.)1801607-1617)。同樣地，野油菜黃單胞菌野油菜致病變種中描述的hrpXc基因(Kamoun等人，分子植物微生物相互作用(Mol.Plant MicrobeInteract)522-33)參與抑制相容宿主植物的防御反應，因為這個基因的突變會導致特征性的壞死反應(過敏性反應，HR)。多種野油菜黃單胞菌致病變種中所描述的無毒力基因也參與細菌的致病性，因為含有對應于和引起HR反應的抗性基因的植物能夠識別它們(Dow和Daniels，1994，如上所述；Yang等人，1995，分子植物微生物相互作用8627-631)。在參與黃單胞菌屬致病性的其它基因中(Dow和Daniels，1994，如上所述)，已經描述了野油菜黃單胞菌野油菜致病變種中的兩個基因，它們的突變將引起其致病性的減弱，并且沒有改變胞外酶和外多糖的累積水平(Osbourn等人，1990，分子植物微生物相互作用3280-285)。其它致病性決定因素包括多組調節胞外酶和外多糖合成的獨立基因，其中有rpfA至H基因，它們的突變引起外多糖產生的降低；rpfN基因，是這些酶和外多糖合成的阻遏基因(repressor)；clp基因，它的突變引起致病性的下降以及外多糖產物的降低(Dow和Daniels，1994，如上所述)。最后，致病性的其它決定因素包括hrp基因。
hrp(過敏性反應和致病性)基因對與相容植物有關的致病性和與抗性宿主有關的過敏性反應是至關重要的(Alfano和Collmer，1997，細菌學雜志1795655-5662)。在歐文氏菌屬、假單胞菌屬、Ralstonia屬和黃單胞菌屬的多種致植物病的細菌中，已經克隆了這些基因，并在不同程度上描繪了其特性，它們是相對保守的(Zurek和Bukowski，1998，Acta Microbiologica Polonica，47227-241；Alfano和Collmer，如上所述)，尤其是在野油菜黃單胞菌辣椒斑點病致病變種(X.campestrispv vesicatoria)中(Huguet等人，1998，分子微生物學(Molec.Microbiol)291379-1390；Fenselau等人，1992，分子植物微生物相互作用，5390-396；Bonas，1994，如上所述)。而且已經將其中最保守的改名為hrc基因(Bogdanove等人，1996，分子微生物學，20681-683)。迄今為止所描述的hrp基因的功能中有它們的表達調控、引起宿主反應的蛋白質的產生、特異的分泌系統(“III型” )的組成以及周質葡聚糖的合成(Zurek et Bukowski，1998，Acta MicrobiologicaPolonica，47227-241；Mudgett et Staskawicz，1998，微生物學的當前觀點(Current Opinion in Microbiology)1109-114；Lindgren，1997，植物病原學年評(Annu.Rev.Phytopathol.)35129-152；Alfano和Collmer，1997，如上所述；Bonas，1994，如上所述)。已經克隆了一組野油菜黃單胞菌野油菜致病變種中的hrp基因(Arlat等人，1991，分子植物微生物相互作用，4593-601)，但是沒有測序。也已經報道，根據平板上菌落的外觀，認為由轉座子引起這些基因發生突變的菌株具有正常外多糖的產生。但是沒有公布這些菌株中更為精確定量的黃原膠產生能力。
另外，這些菌株中產生的突變在性質上不十分穩定，不適用于生產黃原膠的工業用途。具體地，所使用的轉座子含有編碼轉座酶的基因(Simon等人，1989，基因(Gene)80161-169)，不排除估計大約以每世代10-6至10-3的頻率發生轉座子的切除事件(Berg等人，1989，Berg和Howe編著，可移動DNA(Mobible DNA)，美國微生物學會，華盛頓，879-926頁；Craig，大腸桿菌和沙門氏菌(Escherichia coli andSalmonella)，Neidhardt編著，ASM出版社，華盛頓，2339-2362頁)。另外，所使用的轉座子含有抗生素新霉素和卡那霉素的抗性基因。最后，插入到這些菌株基因組中的轉座子構成非同源性DNA元件，因為它不是該菌株基因組自身的元件。
雖然，目前在歐洲沒有因野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的致植物病性質而施加特殊的管理法規，但是由于與環境有關的原因，使用非致植物病的野油菜黃單胞菌來降低可能污染附近農學目的栽培的風險是非常可取的。使用常規的隨機誘變技術來選擇用于生產的這樣的菌株是一個冗長乏味的過程，因為它必須包括分離非致植物病但又保持生產能力特性(即無次級突變)的菌株的高通量篩選。
此外，使用產生改造的黃原膠(如US 5,514,791所描述的)或者已經提高了生產力的遺傳修飾菌株是經過嚴格規定的(Theilleux 1998，Dictionnaire permanent bioéthique et biotechnologies[生物倫理學和生物技術的永久條例]，ed Législatives[立法機關編]，第1595-1648頁)。后者要求，尤其是對菌株中產生的對植物有危害的結構，在生產地區必須采用嚴格的防止擴散措施。因此，必要花費將具有負面的經濟后果。
因此，要求用于工業生產的野油菜黃單胞菌菌株穩定地缺失致植物病性質，但保留其黃原膠的生產能力特性。另外，由于法規以及為了簡化由生物質中分離黃原膠所帶來的垃圾處理，使用不含有編碼抗生素抗性的異源基因的菌株是有用的。最后，根據法國和歐洲立法，優選使用通過自體克隆(autocloning)構建得到的菌株，即是它不含有自身遺傳以外的任何DNA元件。
本發明人的研究已經可以構建具有所要求特性的野油菜黃單胞菌菌株。
令人驚訝的是，本發明顯示，通過缺失影響到毒力有關基因的幾千個堿基的相當大的片段，得到穩定地非致植物病的細菌，但是它仍然能夠生產黃原膠。
更為令人驚訝的是，本發明所改造的菌株產生的黃原膠在數量和質量的所有方面都能夠與產生該結構的野生型菌株所產生的黃原膠相比。
本發明的一個主題是通過失活至少一個毒力基因而喪失致植物病性質、并且保持產生外多糖能力的細菌菌株。
根據本發明，通過缺失hrp或hrc基因群的至少一個基因，有利的是至少兩個基因，優選至少三個基因，優選hrp或hrc基因群的5至9個基因，可有利地獲得穩定地非致植物病的細菌菌株。
措辭“穩定地缺乏致植物病性質”是指在經過至少20代，有利的是至少30代，優選至少40代的細胞周期以后仍然保留著這個特性。
在喪失了致植物病性質并能夠有利地用于外多糖工業生產的細菌中，尤其要提到以下屬歐文氏菌屬(Erwinia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、Ralstonia以及黃單胞菌屬。
本發明的一個主題，尤其是本質上穩定地缺乏致植物病性質并且基本保持產生外多糖能力的黃單胞菌屬菌株。
措辭“本質上非致植物病的”是指在通過損害葉片的中脈進行接種至少15天后，在宿主十字花科植物，尤其是甘藍(Brassica oleracera)的葉上沒有擴散損傷和/或枯萎。
有利地，黃單胞菌屬菌株是野油菜黃單胞菌的，尤其是野油菜致病變種的。
所述基因的失活優選通過缺失hrp或hrc基因群中至少1kb，優選至少3kb，有利地至少5kb，優選hrp或hrc基因群中的9kb，并可長達40kb來獲得。
在一個優選的實施方案中，通過缺失野油菜黃單胞菌野油菜致病變種致植物病的野生型菌株的hrpA1至hrpC2基因得到根據本發明的本質上非致植物病的黃單胞菌屬菌株，尤其是野油菜黃單胞菌菌株。
本發明黃單胞菌屬菌株所產生的黃原膠與野生型產生的是基本相同的，換句話說，它具有基本相同的分子量分布，還有相同程度的修飾，尤其是乙酰化和丙酰化(pyruvylation)的程度。
本發明的主題還有一種制備以上所定義菌株的方法，其特征在于是通過與含有hrp或hrc基因的全部或部分缺失的質粒進行同源重組來獲得的。
本發明的主題還有一種制備細菌外多糖，尤其是黃原膠的方法，其特征在于將以上所定義的細菌菌株，適當地，黃單胞菌屬菌株，優選野油菜黃單胞菌菌株，在允許于發酵培養基中產生外多糖的條件下進行培養。
下面的實施例將舉例說明對應于本發明特征的野油菜黃單胞菌菌株的構建。
在這些實施例中，使用通過篩選黃原膠所獲得的野油菜黃單胞菌野油菜致病變種菌株來進行構建。
不用說，根據所述技術領域中的一般知識以及以下所給出的說明，尤其是當菌株屬于野油菜黃單胞菌時參考部分所報道的序列，黃單胞菌屬和不同屬中產生外多糖的、本領域技術人員可獲得的其它細菌菌株也可用作產生非致植物病菌株的出發原始材料，為理解實施例，將參考附圖，其中-


圖1用圖解法表示構建攜帶hrp基因缺失的野油菜黃單胞菌RPA-BIOCAT826菌株衍生物的策略。
Fenselau和Bonas(1995，分子植物微生物相互作用，8(6)845-854)和Fenselau等人，(1992，分子植物微生物相互作用，5390-396)描述了野油菜黃單胞菌辣椒斑點病致病變種中hrp基因的組成，在Genebank中是可部分獲得，其登錄編號為U33548。按照克隆它們的質粒的名稱，對從RPA-BIOCAT826菌株中克隆的同源區進行了描述。Arlat等人(分子植物微生物相互作用，1991，4593-601)公布了野油菜黃單胞菌野油菜致病變種中hrp區的限制性圖譜，并在實施例1到4中給出了所完成的結果。經過雙重同源重組將實施例中所描述的pRPA-BCAT140質粒攜帶的ΔhrpA1-C2缺失引入到基因組中。
-圖2表示使用以下所描述的HRPB5探針和RPA-BIOCAT826菌株以及該菌株的兩個已經整合了ΔhrpA1-C2缺失的衍生物的基因組DNA，通過DNA印跡法所得到的雜交信號。分子量大小標記條帶的位置是通過與轉移以前經溴化乙錠染色的凝膠上的移動距離比較而得到的。這些大小用千堿基(kb)來表示。
-圖3表示使用以下所描述的HRPC2探針和RPA-BIOCAT826菌株以及該菌株的五個已經整合了ΔhrpA1-C2缺失的衍生物的基因組DNA，通過DNA印跡法所得到的雜交信號。分子量大小標記條帶的位置是通過轉移以前經溴化乙錠染色的凝膠上的移動距離比較而得到的。這些大小用kb來表示。
材料和方法除非另外說明，所使用的技術都是本領域技術人員所公知的常規分子生物學和微生物學的技術，例如Ausubel等人1987年(分子生物學當代方法(Current Protocol in Molecular Biology)，John Wiley andSons，紐約；Maniatis等人，1982，分子克隆實驗室手冊(MolecularCloninga laboratory manual)，冷泉港實驗室，紐約)和Coligan等人1997年(蛋白質科學當代方法(Current Protocol in Protein Science)John Wiley & Sons公司)所描述的。
1.原始菌株RPA-BIOCAT826菌株來自Rhodia Chimie的保藏中心(Melle factory，RTAM)，根據它的白色形態外觀而不是通常的黃色外觀來加以選擇。RPA-BIOCAT1016、1017、1019和1021菌株保藏在CBS，各自的編號為CBS101940、CBS 101941、CBS 101942、CBS 101943和CBS 101944。
2.MSX培養基培養黃單胞菌屬的MSX培養基含有0.2g/l酵母提取物；1.2g/lNH4NO3；7.3g/l K2HPO4；0.25g/l MgSO4.7H2O，1g/l葡萄糖和15g/l細菌用瓊脂(Bacto-Agar)用于瓊脂培養基；10g/l葡萄糖用于液體培養基。將硫酸鎂和葡萄糖分別滅菌并臨時加入。滅菌之前，用稀釋到10％的硫酸將培養基的pH平衡到pH7.2。
基因組DNA是由MSX中新鮮的液體培養物制備的(OD660小于0.4)。將40ml培養物離心后，用11.9ml TE緩沖液懸浮細胞沉淀(分子生物學當代方法，John Wiley and Sons，紐約)，加入630μl 10％SDS(十二烷基硫酸鈉)，然后再加入63μl 20mg/ml的蛋白酶K。37℃孵育1小時后，加入2.1ml 5M的NaCl溶液，然后加入1.7ml溶解于0.7M NaCl溶液中的10％CTAB，將整個混合物在65℃孵育10分鐘。用等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)混合物第一次抽提后，再用等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)混合物進行第二次抽提，將上清中加入0.6體積的異丙醇。離心(10000轉/分5分鐘)后，將得到的沉淀用70％的乙醇洗滌后干燥，再溶解到至少2ml的TE中，然后再加入25μl 5mg/ml的核糖核酸酶溶液。37℃孵育1小時后，用酚/氯仿/異戊醇進行抽提，通過加入0.1體積的3M醋酸鈉和2.5體積的乙醇將上清中的DNA沉淀出來。將14 000轉/分離心5分鐘得到的沉淀用70％的乙醇洗滌，干燥后，重新懸浮在至少0.5ml的TE中。
實施例1RPA-BIOCAT826的hrpC2區的克隆使用引物XcC2.3(SEQ ID No.1)和XcC2.4(SEQ ID No.2)從RPA-BIOCAT826的基因組DNA起始通過PCR擴增目的片段。抽提RPA-BIOCAT826菌株的基因組DNA，并在PCR反應中使用，其中含有100ng基因組DNA，40pmol的每一種引物，0.2mM dNTP和1.25U Pwo聚合酶(BoehringerMannheim)，終體積為50μl這種酶的緩沖液。95℃孵育5分鐘后，混合物首先經過30個循環，每個循環包括94℃孵育1分鐘，然后在溫度63℃-48℃(每一循環變化0.5℃)下1分鐘，以及72℃1分鐘。接下來的15個循環包括94℃孵育1分鐘，48℃1分鐘以及72℃1分鐘。最后是72℃10分鐘。將大小接近1.2kb的擴增產物通過在瓊脂糖凝膠上的移動和接下來使用的Qiaex試劑盒(Quiagen)來進行純化。然后將它克隆到用EcoRV打開的pZERO-1載體(Invitrogen BV)中。轉化大腸桿菌(E.coli)菌株JM110后，選擇含有已經整合了1.2kb片段的質粒的克隆。將這個質粒命名為pRPA-BCAT91并將它所含有的插入片段進行測序(GenomeExpress，Grenoble，法國)。將所得到的序列(SEQ ID No.3)與野油菜黃單胞菌辣椒斑點病致病變種的hrpC2基因序列(Fenselau等人，1992，分子植物微生物相互作用，5390-396)進行對比。與代表61％hrpC2基因的1188bp的序列有87％的一致性。由核苷酸序列所推測的氨基酸序列與野油菜黃單胞菌辣椒斑點病致病變種的HrpC2蛋白序列的相應部分顯示出92％的一致百分比。
實施例2RPA-BIOCAT826 HrpA區的克隆使用對應于野油菜黃單胞菌辣椒斑點病致病變種菌株等同區域的探針，通過篩選RPA-BIOCAT826菌株的部分基因組文庫來克隆該區。在名為pL3o的質粒中可得到該區域，該質粒含有包括野油菜黃單胞菌辣椒斑點病致病變種的hrpB8和hrpA1基因6.6kb的EcoRV插入片段(Fenselau等人，1992，分子植物微生物相互作用，5390-396)。
使用引物XcvA15(SEQ ID No.4)和XcvA18(SEQ ID No.5)各40pmol，pL3o質粒模板(40ng)，0.2mM dNTP和1.25U Pwo聚合酶(BoehringerMannheim)，終體積為50μl的這種酶的緩沖液，通過PCR來制備HRPA1探針。95℃孵育5分鐘后，混合物經過30個循環，各循環包括94℃孵育30秒鐘，然后在55℃下1分鐘，以及72℃1.5分鐘。最后72℃孵育10分鐘后，將擴增的664bp產物先在瓊脂糖凝膠上，然后再使用Qiaex試劑盒(Quiagen)進行純化。
用100單位的EcoRI將大約10μg的BIOCAT826菌株基因組DNA在37℃消化16小時。然后使用常規的DNA印跡技術，目的是測定與上述的HRPA1探針雜交的EcoRI片段的大小。將上述的EcoRI消化物在瓊脂糖凝膠上移動后，轉移到Hybond N+膜(Amersham)上，使用按照制造商的說明用Ready-To-Go試劑盒(Pharmacia Biotech)得到的磷32標記的HRPA1探針，在水性雜交溶液(0.55％SDS；6％SSC；0.25％脫脂奶粉)中，55℃進行雜交19小時，并用0.2SSC和0.1％SDS溶液在55℃下洗滌，將膜在-80℃下放射自顯影19小時。膠片的顯影表明雜交信號的大小接近7.3kb。
因此，用1000單位的EcoRI將100μg的RPA BIOCAT826菌株基因組DNA在37℃消化20小時后，產生該菌株的部分基因組文庫。在瓊脂糖凝膠上移動后，將大小在7kb到8kb片段所對應的區域切下，在透析袋(購自Spectrum Medical Industries公司的Spectra/Por膜)中通過電洗脫將DNA從膠中抽提出來。乙醇沉淀后，將DNA與經EcoRI酶切后用蝦堿性磷酸酶(美國生物化學(United States Biochemicals))去磷酸化的pBlueScript II SK載體(Stratagene)在終體積10μl中連接。將連接化合物在16℃孵育14小時后，用1/10的混合物通過電穿孔轉化大腸桿菌DH5alpha細胞。使用HRPA1探針與轉移到尼龍膜上的菌落進行雜交來分析大約3 000個轉化體。將12個產生陽性雜交信號的菌落在含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基上進行純化。抽提12個純化菌落的質粒，使用HRPA1探針，通過DNA印跡法來分析這些質粒的EcoRI消化物，目的是確認與該探針雜交的大約7.3kb片段的存在。使用多種酶進行限制性內切酶分析后，將2.7kb的SacII片段和1.6kb的SacII片段亞克隆到用SacII酶切后的pBlueScript II SK載體上，分別產生pRPA-BCAT135和pRPA-BCAT134載體。將這兩個載體進行部分測序(GenomeEopress，Grenoble)，結果表明存在1818bp的可讀框(SEQ ID No.6)，推斷的多肽序列與野油菜黃單胞菌辣椒斑點病致病變種的HrpA1蛋白(Fenselau等人，1992，分子植物微生物相互作用，5390-396)具有85％的一致性。
實施例3來自RPA BIOCAT826、含有ΔhrpA1-C2缺失的菌株的構建通過將pRPA-BCAT134的一個片段和pRPA-BCAT91的一個片段(參照
圖1)克隆到質粒pJQ200SK(Quandt和Hynes，1993，基因(Gene)12715-21)中來體外構建ΔhrpA1-C2缺失。用NcoI打開pRPA-BCAT91質粒，然后用多聚酶I(Klenow片段)在25μM dNTP存在下，30℃處理15分鐘。用酚/氯仿/異戊醇進行抽提后，再用乙醇沉淀。將樣品溶解到40μl水中，用20單位XbaI 37℃處理樣品，接下來再用20單位ApoI 50℃處理。然后用膠分離出大約1.2kb的片段，并用Quiex II試劑盒(Quiagen)回收。用同樣的方法純化大約1.3kb的pBCAT134的RsaI-SacII片段。將這兩個片段連接到用SacII和XbaI打開的pBlueScript II SK載體中，產生pRPA-BCAT139質粒。然后，從這個質粒中能夠抽提出攜帶ΔhrpA1-C2缺失的大約2.5kb的SacI-XbaI片段以便克隆到用SacI和XbaI酶打開的質粒pJQ200KS中。得到的質粒命名為pRPA-BCAT140。這個質粒在野油菜黃單胞菌中是不能復制的，它攜帶的慶大霉素抗性標記可用于選擇已經通過同源重組整合了該質粒的野油菜黃單胞菌克隆，而且它所攜帶的sacB正向選擇標記可用于選擇發生第二次同源重組事件后去除了慶大霉素抗性標記的克隆。
通過接合將pRPA-BCAT140質粒引入到RPA BIOCAT826菌株中。為此，將MSX培養基中含有pRPA-BCAT140的DH5alpha菌株指數生長期的培養物40μl，含有pRK2013質粒的HB101菌株指數生長期的培養物40μl(Ditta等人，1980，Proc.Natl.Acad.Sci，USA 777347-7351)和指數生長期的RPA-BIOCAT826菌株培養物40μl，在MSK瓊脂培養基上混合。30℃孵育24小時后，將已經整合了pRPA-BCAT140質粒的野油菜黃單胞菌克隆在含有15μg/ml慶大霉素的MSX瓊脂培養基上連續純化兩次。在約1平方厘米的含有5％蔗糖的MSX瓊脂培養基表面平板接種8個克隆。30℃孵育72小時后，通過在MSX瓊脂培養基上兩次連續的純化來分離菌落。然后，為鑒別45慶大霉素敏感的克隆(根據此實驗90到100％的克隆)，將大約300個菌落在含有15μg/ml慶大霉素的MSX瓊脂培養基上進行傳代培養。然后用EcoRI-BamHI消化的其基因組與HRPA1探針進行DNA印跡法來分析大約40個這樣。大約有25％的克隆表現出與野生型RPA-BIOCAT826菌株不同并與ΔhrpA1-C2缺失的整合一致的信號。選擇了5個克隆用于后面的實驗RPA BIOCAT菌株1016、1017、1019、1021和1022。
實施例4來自RPA-BIOCAT826并含有ΔhrpA1-C2缺失的菌株的DNA印跡法鑒定通過分析EcoRI、BamHI和EcoRI-BamHI消化的基因組DNA與HRP3’A1、HRPB5和HRPC2探針的雜交圖譜來分析鑒定RPA BIOCAT菌株1016、1017、1019、1021和1022。
HRP3’A1探針是通過將pRPA-BCAT134質粒的1.6kb SacII片段在瓊脂糖凝膠上移動，然后再使用Qiaex試劑盒進行純化而得到的。
HRPC2探針是通過將pRPA-BCAT91質粒的1.2kb EcoRI-XbaI片段在瓊脂糖凝膠上移動，然后再使用Qiaex試劑盒進行純化而得到的。
HRPB5探針是通過將pRPA-BCAT129質粒的1.5kb BamHI片段在瓊脂糖凝膠上移動，然后再使用Qiaex試劑盒進行純化而得到的。尤其該插入片段的測序表明有一個可讀框(SEQ ID No.7)，推斷的肽序列與野油菜黃單胞菌辣椒斑點病致病變種的HrpB5蛋白(Fenselau等人，1995，分子植物微生物相互作用，8845-854)具有77％的一致性。通過將大小在1.3至1.9kb的RPA BIOCAT826菌株的BamHI基因組DNA片段克隆到pBlueScript II SK載體中，并按照實施例2中所描述的相似方法用HRPB探針篩選菌落來得到pRPA-BCAT129質粒。使用引物RST2和RST3(Leite等人，1994，應用環境微生物學(Appl.Environ.Microbiol.)601068-1077)與質粒模板pB10g(U.Bonas，個人聯系)通過PCR來獲得HRPB探針。質粒pB10g相當與其中克隆了含有野油菜黃單胞菌辣椒斑點病致病變種的hrpB區域和hrpA1基因的7.3kb BamHI片段的pBlueScript KS質粒(Fenselau等人，1995，分子植物微生物相互作用，8845-854)。使用40pmol的每一種引物，50ng pB10g，0.2mM dNTP和1.25U Pwo聚合酶(Boehringer Mannheim)，在終體積為50μl這種酶的緩沖液中進行PCR反應。95℃孵育5分鐘后，混合物首先經過24個循環，每個循環包括95℃孵育30秒鐘，然后在溫度70℃-63℃(每一循環變化0.3℃)下40秒鐘，以及72℃1分鐘，接下來的6個循環包括95℃孵育30秒鐘，63℃40秒鐘以及72℃1分鐘，最后是72℃5分鐘。將大約840bp的擴增產物在瓊脂糖凝膠上和使用Qiaex試劑盒(Quiagen)來進行純化。
根據提供的說明，使用“Megaprime DNA標記系統”試劑盒(Amersham)標記探針來進行DNA印跡法分析。按照所提供的說明，將基因組DNA的消化物在瓊脂糖凝膠上移動后，轉移到Hybond N+膜(Amersham)上，在由0.5M磷酸鹽緩沖液和7％SDS(115ml 1M Na2HPO4，84.6ml[脫漏]MNaH2PO4，200ml水和28克SDS)組成的雜交溶液中孵育。將標記的探針在100℃孵育5分鐘，再在室溫下孵育5分鐘，然后稀釋在12ml雜交溶液中，100℃孵育5分鐘。接下來將混合物與膜在65℃接觸6到20個小時，將膜在含有1％SDS的0.1M磷酸鹽緩沖液(42.3ml 1MNa2HPO4，57.7ml1M NaH2PO4，900ml水和10克SDS)中洗滌10到15分鐘后，曝光。
用HRPB5探針所得到的結果(圖2)表明，對于RPA-BIOCAT826菌株，使用EcoRI消化的雜交信號在大約4.8kb，用BamHI消化和EcoRI-BamHI消化的信號在1.6kb。這些結果與Arlat等人(分子植物微生物相互作用，1991，4593-601)所得到的圖譜和以上所描述的hrpB5基因的定位是一致的。所研究的RPA-BIOCAT菌株中沒有顯示出與HRPB5的雜交信號，這與這些RPA BIOCAT菌株1016、1017、1019、1021和1022的基因組中整合了ΔhrpA1-C2缺失是一致的(圖2只顯示了RPA-BIOCAT菌株所得到的雜交結果)。
用HRPC2探針所得到的結果(圖3)表明，對于RPA-BIOCAT826菌株，使用EcoRI消化的雜交信號在大約5.5kb，用EcoRI-BamHI消化的信號在2.6kb。這些結果與Arlat等人(分子植物微生物相互作用，1991，4593-601)所得到的圖譜，野油菜黃單胞菌辣椒斑點病致病變種的hrp基因的組構(Fenselau等人，1992，分子植物微生物相互作用，5390-396)和以上所描述的hrpB5基因的定位是一致的。由RPA BIOCAT菌株1016、1017、1019和1021所得到的結果，使用EcoRI消化的雜交信號在7到8kb之間，用EcoRI-BamHI消化的信號在4.4kb。如
圖1所顯示的圖譜，這些結果與RPA BIOCAT菌株1016、1017、1019、1021和1022的基因組中整合了ΔhrpA1-C2缺失是一致的。
最后，用HRP3’A1探針所得到的結果表明，對于RPA-BIOCAT826菌株，使用EcoRI-BamHI消化的雜交信號在7.3kb。使用RPA-BIOCAT菌株1016、1017、1019和1021，該雜交信號在4.4kb。這與這些菌株基因組中整合了ΔhrpA1-C2缺失是一致的。
實施例5來自RPA-BIOCAT826并含有ΔhrpA1-C2缺失的菌株的毒力在甘藍植物(Brassica oleracera var.captiva eultivar Siria)上進行毒力試驗，從Clause Semences(av.Lucien Clause，91221Brétigny-sur-Orge，法國)獲得其種子。根據以下的常數在人工氣候室中種植這種植物25℃14小時、55％溫度、飽和的光強度(4000W/m)；25℃10小時，60％濕度。在兩葉階段進行感染，例如播種后大約13天。對每一種菌株都使用8株植物，在第一片葉子的中脈末端部分使用感染的牙簽進行穿刺。通過將牙簽的頂部浸入到MSK培養基中所研究的菌株的2天培養物(大約108細菌/ml)中來使之得到污染。陰性對照包括使胡椒發生植物病害的、在Clause Semences分離到的野油菜黃單胞菌辣椒斑點病致病變種的參考菌株混合物(B229RI菌株＝RPA-BIOCAT381，B230RII菌株＝RPA-BIOCAT382)。陽性對照包括使甘藍發生植物病害的，在ClauseSemences分離到的野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的參考菌株混合物(2963菌株＝RPA-BIOCAT379，63C2AM菌株＝RPA-BIOCAT380)。觀察癥狀(V形黃色損傷)，并在感染12和14天后測量。對應以下0，沒有癥狀；1，感染點的附近有褪色；2，壞死小于0.5平方厘米；3，壞死在0.5到1.5平方厘米；4，壞死大于1.5平方厘米；5，葉片的廣泛壞死，對每一株植物進行打分。用同一種菌株感染的8株植物的分數總和是該菌株的致病性分數(表1)。表1黃單胞菌屬菌株的致植物病性
雖然RPA-BIOCAT826菌株能夠引起葉片的不斷枯萎，但所構建的菌株至多只能引起局部的壞死干枯，從而反映出無致病性。
序列表<110>RHODIA CHIMIE<120>產生黃原膠的無毒力野油菜黃單胞菌菌株<130>BFF 99/0315<140>FR 9907963<141>1999-06-22<160>7<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>1aaattcgtca agggtgatgc20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>2gttccacctg gtcgacaagc20<210>3<211>1189<212>DNA<213>野油菜黃單胞菌<400>3aaattcgtca agggtgatgc gatcgccggc ctggtgatca ccatggtcaa catcttggcc 60ggcatcgtgg taggcgtgac ctaccacggc atgagcgcgg gcgaggccgc caaccgcttt 120gcgatcctgt cggtaggcga tgcgatggtg tcgcagatcg cctcgctgct gatctcggtg 180gcggccggcg tcatgatcac ccgcgtcgcc aacgagaatg aaaccaagat cagctcgctc 240gggctcgaca tcggccgcca gctcaccagc aacgcacgtg ccttgatggc agcgagtgtg 300ctgctggcct gctttgcgtt cgtgccggga tttccggcgc tgctgttcct gctgctggca 360gcggcggtcg gtgccggggg ctatacgatc tggcgcaagc aacgcgacac cagcgggagc 420gatcagcccg cactgccatc aaccagccgc aaaggtgcca aaggcgatgc gccgcacatc 480cgcaagagcg ccccggattt cgcctcgccc ttgtcgatgc ggctttcgcc gcaactggct 540gcacggctcg acccggcgct gctggatcag gcgatcgaaa gcgagcggag gcaattggtc 600gagctgctgg gattgccgtt cccggggatc gcgatatggc agagcgaatc cctgcagggc 660ctgcagtacg aagtgttgat ccacgatgtg ccggaaaccc gcagcgcgtt gagcgatacg 720gcggacatgc agaaagcgct ggcccaacaa gccatcgcac cgttgcatgc acgcgcgcat 780ctgttcgtcg gcatccagga gacgcagtgg atgctggaac aggtgggcgc ggactatccc 840gggctggttg cagaggtcaa caaggccatg ccagcccaac gcatcgccga tgtgttgcgg 900cgactgctgg aagaacgcat cccggtgcgc aacatcaaga gcatcctgga gagcctggtg 960gtgtggggac cgaaggaaaa ggatctgctg atgctgaccg agtatgtgcg ctgcgatctc 1020ggccgctatc ttgcgcacac cgcgaccgca ggcaccggac agctgcctgc ggtgatgctc 1080gaccacgccg tggaacagtt gatccggcag tcgattcgcg ccacaccggc cggcaatttc 1140ctggcgctgc caccggagca ggccaatcag cttgtcgacc aggtggaaa 1189<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>4gatccaacag ctggacaacc20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>5aacggaatct tcgacaggcc20<210>6<211>1818<212>DNA<213>野油菜黃單胞菌<400>6atggcatacg cctgtcctcc agttcaccgc catcgacgcg cgccgttggc cgctgccttg 60ttgcttggct tgctgccgct gctgccgccg catgccaacg ccgcgtcggt gccgtggcac 120tcgcgcagct tcaaatacgt tgccgaccgc aaggatctca aggaggtgct gcgcgacctg 180tccgccagcc aatccatcac cacctggatt tcaccggagg tgaccggcac gctcagtggc 240aaattcgaag ccactccgca gaagtttctc gacgatctat cgggcacgtt cggttttgtc 300tggtattacg atggctcggt gctcagaatc tggggcgcga acgagaccaa gaatgcgacc 360ttgagtttgg gcgctgcatc gacgagtgcg ctgcgcgatg cgcttgcgcg catgcggctg 420gacgatccgc gctttccggt ccgttatgac gagacagcgc acctggcggt ggtgtcgggc 480ccgccgggtt atgtggatac cgtcgcggcg atcgccaagc aggtcgagca ggtcgcgcgc 540caacgcgacg ccaccgaagt gcaggtgttt cagctgcatt atgcgcaggc ggccgaccac 600accacccgca tcggtggtca agacatccag gtgccgggca tggccagcct gttgcgcaac 660atatacggcg tgcgtggcgc gcccactgcg gcgctgcccg ggccaggcgc gaatttcggg 720cgtgtgcaac cgatcggcgg tggctcgtcc aataccttcg gcaacagcgg tcagcgccag 780agtggcggca gcggcattct cggtttgcct gcgtcgtggt tcggcgctgg gtcgccgtcc 840gagcgggtgc cggtcagtcc gccgttgccg ggcagtggca atagcgccaa tgcgccggcc 900agcgtgtggc cggagatgag ccaggccaga cgcgatgcgc cgctggcggt ggacgccggc 960agcggcggtg agctggcatc cgacgcgccg gtgatcgaag ccgacccgcg caccaacggc 1020attctcattc gcgaccgccc cgagcggatg gccgcctatg gcacgttgat ccagcagctc 1080gacaaccgtc ccaagctgct gcagatcgat gccaccatca tcgagatccg cgacggcgcc 1140ctgcaggatc tcggcgtgga ctggcggttc cacagccggc gtgtggatgt gcagaccggc 1200gacgggcgtg gtggccagct tggctacgat ggcagcttga gcggtgcagc agccgccggt 1260gcagccgcgc cgttgggcgg gacgttgacc gctgtcctgg gcgatgcagg gcgttacctg 1320atgacgcgcg tctcggcgct cgagcagacc aacaaggcca agatcgtctc caccccgcag 1380gtggcgacgc tggacaacgt ggaagcggtg atggaccaca agcaacaggc attcgtgcgt 1440gtcagcggtt atgcatccgc cgacctctac aacctgtccg cgggtgtatc gctacgcgta 1500ttgccaagtg tggtgccggg gtcgccaaat ggtcagatgc gcctggatgt gcgtatcgaa 1560gacgggcagt tgggcgccaa taccgtcgat ggcattcccg tcatcacctc cagcgagatc 1620accacgcagg ccttcgtcaa cgagggccag agcctgctga tcgccggtta tgcttccgac 1680accgatcaga cagatctgaa caacgtcccc gggctgtcca ggattccatt ggtcggcaac 1740ctgttcaagc atcgccagca gagcgggtcg cggttgcagc ggttgttcct gctgaccccg 1800catatcgtct cgccctga 1818<210>7<211>702<212>DNA<213>野油菜黃單胞菌<400>7atgcgtcttt ggctgaggtc cacaccggaa gcggtcggcc ttgactgcga ggtcatccca 60cgcgaggcat tggcctgtgt gctggaactg gacgcagcgg gtgcacaggt gcacgcgcgt 120tgcgcgcagg cgctggcgga cgcccagacg cgtgcgcagg cgctgctcga cgctgcccaa 180cggcaggccg aggccatcct tcaggatgcc cacgacaggg ccgagcgcag tgcacgcctg 240ggctatgccg ccgggctgcg ccgtcagctc gacgcgtgga acgagcgcgg cgtgcggcat 300gccttcgcgg cccaggacgc cgcacggcgc gcccgcgagc gcctggccga gatcgtcgcg 360cacgcctgcg agcaggttct gcacgggcac gatcctgcgg cgctgtacgc gcgcgccgca 420caggcgctgg acggcgccct ggacgaggcg aacgccctgc aggtgagcgt gcatcccgat 480gcgctggacg atgcacggcg cgccttcgat gcggccgcag cggccggcgg atggagcatg 540ccggtggaac tgtgcggtga tacgactctg gccttgggtg cctgcgtgtg cgaatgggat 600accggcgtgt tcgagaccga tctgcgtgat cagctgcgca gtctccggcg cgtcattcgc 660cgcgtgttgg ccacgccgca ggcggtgccg gatgcttgct ga70權利要求
1.細菌菌株，其已通過失活至少一個毒力基因而喪失致植物病性質，并保留產生外多糖的能力。
2.權利要求1所要求保護的細菌菌株，其特征在于已通過失活hrp或hrc基因群的至少一個基因，有利的是至少兩個基因，優選至少三個基因使其成為穩定地非致植物病的細菌菌株。
3.權利要求1或2所要求保護的細菌菌株，其特征在于已通過失活hrp或hrc基因群的5至9個基因使其成為穩定地非致植物病的細菌菌株。
4.權利要求1所要求保護的細菌菌株，其特征在于它是通過失活至少一個毒力基因而喪失致植物病性質但保留產生外多糖能力的黃單胞菌屬菌株。
5.權利要求4所要求保護的黃單胞菌屬菌株，其特征在于它是野油菜黃單胞菌的菌株。
6.權利要求5所要求保護的黃單胞菌屬菌株，其特征在于它是野油菜黃單胞菌野油菜致病變種。
7.以上任一個權利要求所要求保護的黃單胞菌屬菌株，其特征在于通過缺失hrp或hrc基因群中至少1kb，優選至少3kb，有利的是至少5kb的DNA區來獲得所述基因的失活，并且該菌株保持產生外多糖的能力。
8.以上任一個權利所述要求所要求保護的黃單胞菌屬菌株，其特征在于它包含了至多40kb的DNA區的缺失。
9.權利要求8所要求保護的黃單胞菌屬菌株，其特征在于其是通過缺失hrpA1到hrpC2基因的全部或部分來獲得的。
10.本質上非致植物病的黃單胞菌屬菌株，其特征在于它包含hrp或hrc基因群中至少1kb，優選至少3kb，有利的是至少5kb的DNA區域的缺失，并且它保留了產生外多糖的能力。
11.本質上非致植物病的黃單胞菌屬菌株，其特征在于它是通過hrpA1-C2基因的全部或部分缺失來獲得的。
12.本質上非致植物病的野油菜黃單胞菌菌株，其選自BIOCAT 1016、BIOCAT 1017、BIOCAT 1019、BIOCAT 1021和BIOCAT 1022菌株，其中這些菌株分別以編號CBS 101940、CBS 101941、CBS 101942、CBS 101943和CBS 101944保藏在CBS。
13.權利要求4到13的任一個所要求保護的黃單胞菌屬菌株，其特征在于外多糖是黃原膠。
14.pRPA-BCAT質粒，用于產生權利要求9到13所要求保護的菌株。
15.制備權利要求7到13之任一個所要求保護的菌株的方法，其特征在于通過與含有hrp或hrc基因的全部或部分缺失的質粒進行同源重組來獲得該菌株。
16.制備細菌外多糖，尤其是黃原膠的方法，其特征在于將權利要求1到13之任一個所要求保護的細菌菌株，適當地，黃單胞菌屬的細菌菌株，優選野油菜黃單胞菌的細菌菌株，在允許于發酵培養基中產生外多糖的條件下進行培養。
17.一種核酸，其特征在于它包含核苷酸序列SEQ ID No.3。
18.一種核酸，其特征在于它包含核苷酸序列SEQ ID No.6。
19.一種核酸，其特征在于它包含核苷酸序列SEQ ID No.7。
全文摘要
本發明涉及通過失活至少一個毒力基因而喪失致植物病性質的細菌菌株,它保持著產生外多糖的能力。
文檔編號C12N15/31GK1357043SQ0080932
公開日2002年7月3日 申請日期2000年6月21日 優先權日1999年6月22日
發明者J·皮爾拉德, J－L·西蒙, P·切瓦勒里奧 申請人:羅狄亞化學公司